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Medicine

उच्च प्रवाह Nitrobenzoxadiazole-समाप्ति कोलेस्ट्रॉल परख लेबल

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58891
Automatic Translation
1, 1, 1
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

Summary

मापन इन विट्रो में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता सीरम या प्लाज्मा मैक्रोफेज सेल मॉडल में atherosclerosis के लिए एक के रूप में एक होनहार उपकरण है । वर्तमान अध्ययन में, हम अनुकूलन और एक फ्लोरोसेंट NBD-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति विधि मानकीकरण और एक उच्च प्रवाह ९६-well प्लेट्स का उपयोग कर विश्लेषण का विकास ।

Abstract

Atherosclerosis हृदय रोग (सीवीडी) की ओर जाता है । यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि कोलेस्ट्रॉल एचडीएल (cHDL) एकाग्रता atherosclerosis विकास में एक कारण भूमिका निभाता है । हालांकि, मेदार्बुद पट्टिका गठन के प्रारंभिक दौर में एक महत्वपूर्ण कारक कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता एचडीएल (एचडीएल कणों मैक्रोफेज से कोलेस्ट्रॉल को स्वीकार करने की क्षमता) के क्रम में फोम सेल गठन से बचने के लिए है । इस endothelium में कोलेस्ट्रॉल के संचय और जिगर के माध्यम से कोलेस्ट्रॉल को खत्म करने के लिए रिवर्स कोलेस्ट्रॉल परिवहन (RCT) का एक हिस्सा से बचने में एक महत्वपूर्ण कदम है । मैक्रोफेज सेल मॉडल में सीरम या प्लाज्मा को कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता एक होनहार उपकरण है जिसे atherosclerosis के लिए रिमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । परंपरागत रूप से, [3एच]-कोलेस्ट्रॉल में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति की परख का प्रयोग किया गया है । इस अध्ययन में, हम एक सेलुलर परख में फ्लोरोसेंट बला-कोलेस्ट्रॉल (NBD-कोलेस्ट्रॉल) का उपयोग कर एक सुरक्षित और तेजी से रणनीति विकसित करने के लिए THP-1-व्युत्पंन मैक्रोफेज में कोलेस्ट्रॉल तेज और समाप्ति प्रक्रिया का पता लगाने के उद्देश्य । अंत में, हम अनुकूलन और NBD-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति विधि का मानकीकरण और एक उच्च प्रवाह ९६-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग विश्लेषण का विकास ।

Introduction

विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, दुनिया भर में मौत के वर्तमान प्रमुख कारणों कोरोनरी हृदय रोग और स्ट्रोक (१५,२००,००० मौतों की कुल के लिए लेखांकन)1हैं । दोनों हृदय रोग (सीवीडी) है कि atherosclerosis और रक्त वाहिकाओं2,3में मेदार्बुद सजीले टुकड़े का टूटना से पहले किया जा सकता है ।

Atherosclerosis एक पोत दीवार भड़काऊ रोग है जिसमें मैक्रोफेज, टी कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, और वृक्ष कोशिकाओं endothelium घुसपैठ और खून से संचित, अंततः atherosclerotic सजीले टुकड़े बनाने । Atherosclerotic सजीले टुकड़े एक लिपिड कोर और कोलेस्ट्रॉल क्रिस्टल प्रस्तुत, मन्या intima मीडिया मोटाई4,5के उच्च संकल्प बी मोड ट्रा माप के द्वारा सबूत. मैक्रोफेज में, लिपिड स्वीकारकर्ता कणों की ओर कोलेस्ट्रॉल समाप्ति एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) रिसेप्टर्स ABCA1 के माध्यम से किया जाता है, एटीपी बाइंडिंग कैसेट उपपरिवार जी सदस्य 1 (ABCG1), और मेहतर रिसेप्टर SR-द्वि. मैक्रोफेज में कोलेस्ट्रॉल की आमद और समाप्ति के असंतुलन को atherosclerosis दीक्षा6में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया माना जाता है । कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परिधीय ऊतक से प्लाज्मा और जिगर को रिवर्स कोलेस्ट्रॉल परिवहन (RCT) नामक प्रक्रिया में कोलेस्ट्रॉल उन्मूलन में एक महत्वपूर्ण कदम माना जाता है । कोलेस्ट्रॉल मैक्रोफेज से मुख्य रूप से apolipoprotein A1 (ApoA1) उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन (एचडीएल) कणों की सतह पर पाया स्थानांतरित किया जाता है । डेंसिटी तो उत्सर्जन के लिए जिगर को कोलेस्ट्रॉल परिवहन और पुन: उपयोग7,8,9।

परंपरागत रूप से tritium (3एच) रेडियो-बला कोलेस्ट्रॉल का इस्तेमाल कोलेस्ट्रॉल समाप्ति10में किया गया है । radioisotopes का उत्सर्जन संकेत अति संवेदनशील10है; हालांकि, रेडियो-लेबल कोलेस्ट्रॉल इस तरह के लंबे प्रोटोकॉल के रूप में स्पष्ट बाधाओं प्रस्तुत करता है, विकिरण के लिए जोखिम के जोखिम, और विशेष रेडियोधर्मिता सुविधाओं और रेडियोधर्मी उत्सर्जन की सुरक्षित हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए उपकरणों के लिए की जरूरत है । इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति सफलतापूर्वक फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने में अपनी सादगी के कारण नैदानिक तकनीक में शामिल किया गया है, उपलब्ध fluorophores की व्यापक विविधता है, और अपनी सुरक्षा11. कई फ्लोरोसेंट-बला sterols dehydroergosterol सहित कोलेस्ट्रॉल चयापचय का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (आंतरिक प्रतिदीप्ति के साथ), dansyl कोलेस्ट्रॉल, 4, 4-difluoro-3 ए, 4adiaza-s-indacene (BODIPY)-कोलेस्ट्रॉल, और 22-(एन-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1, 3-Diazol-4-yl) अमीनो)-23, 24-Bisnor-5-Cholen-3β-राजभाषा (NBD-cholesterol) । विशेष रूप से, NBD-कोलेस्ट्रॉल मानव कोशिकाओं12में एक कुशल सुलाने के लिए प्रस्तुत करता है । दो अलग NBD बला-कोलेस्ट्रॉल वर्तमान में उपलब्ध हैं: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl) अमीनो)-23, 24-bisnor-5-cholen-3 बी-राजभाषा (22-NBD) और 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl)-मिथाइल] अमीनों) -27-norcholesterol (25-NBD; चित्रा 1) । कोलेस्ट्रॉल 22-NBD moiety के साथ लेबल सबसे अच्छा कोलेस्ट्रॉल समाप्ति अध्ययन के अनुरूप हो सकता है, जबकि 25-NBD-कोलेस्ट्रॉल मुख्य रूप से सेलुलर झिल्ली गतिशीलता अनुसंधान13,14में प्रयोग किया जाता है ।

सेल आमतौर पर इन विट्रो में प्रयुक्त लाइनों कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख monocyte जैसे मानव ल्यूकेमिया-व्युत्पंन THP-1 कोशिकाओं, murine कच्चे २६४.७ कोशिकाओं15, या जंमू 774.1 जैसे कोशिकाओं रहे हैं । इन कोशिकाओं के सभी phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) का उपयोग कर इन विट्रो में मैक्रोफेज में विभेद किया जा सकता है, लेकिन THP-1-व्युत्पंन मैक्रोफेज (dmTHP-1) सबसे अच्छा प्रतिबिंबित और मानव मैक्रोफेज16नकल ।

वर्तमान अध्ययन में, हम ऑप्टिमाइज़ करें और dmTHP-1 पर सीरम नमूनों की कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक फ्लोरोसेंट उच्च-प्रवाह विधि मानकीकरण, 22-NBD-कोलेस्ट्रॉल के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोग करना [3H]-कोलेस्ट्रॉल. इसके अलावा, हम मानक रेडियोधर्मी एनालॉग के साथ अनुकूलित फ्लोरोसेंट तकनीक की तुलना करें ।

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Protocol

इस अध्ययन के लिए, नैतिक समिति अनुमोदन (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, अस्पताल क्लिनिक, बार्सिलोना; अनुमोदन संख्या HCB/2014/0756) और लिखित, सभी विषयों से सूचित सहमति प्राप्त की गई ।

1. NBD-कोलेस्ट्रॉल तैयारी

  1. NBD-कोलेस्ट्रॉल (मेगावाट ४९४.६३; सामग्री की तालिकादेखें) शुद्ध इथेनॉल में स्टॉक (2 मिमी) प्राप्त करने के लिए भंग । एक 10 मिलीग्राम की शीशी के लिए, इथेनॉल के एक १०.१ मिलीलीटर मात्रा में पूरी शीशी सामग्री को भंग एक 2 मिमी शेयर प्राप्त करने के लिए ।
  2. NBD-RPMI १६४० में शेयर से कोलेस्ट्रॉल पतला 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 5% पेनिसिलिन/streptomycin (R10 माध्यम) 5 माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए पूरक (जैसे, 5 माइक्रोन पर NBD-कोलेस्ट्रॉल की 10 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए अंतिम एकाग्रता) कमजोर 25 μL ऑफ NBD-कोलेस्ट्रॉल स्टॉक (2 एमएम) R10 मीडियम में । यह वॉल्यूम एक ९६-well प्लेट के लिए पर्याप्त है ।

2. सेल कल्चर और सीडिंग (Day-2)

  1. कल्चरल THP-R10 मीडियम में 1 सेल ३७ ° c, 5% CO2. समायोजित करने के लिए ०.३ x 106 कोशिकाओं/एमएल हर 3 दिन ।
  2. बीज एक सफेद ९६-अच्छी तरह से थाली में एक फ्लैट, स्पष्ट नीचे के साथ ०.२ x 106 कोशिकाओं में/अच्छी तरह से R10 माध्यम में (१०० μL प्रति अच्छी तरह से) ।
  3. १०० एनएम phorbol 12-myristate 13-एसीटेट के साथ कोशिकाओं का इलाज (पमा; एक 10 माइक्रोन स्टॉक से) 48 – 72 एच के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीनिंग, 5% सह2 THP-1 कोशिकाओं को dmTHP-1 में अंतर करने के लिए ।
    नोट: यह R10 माध्यम के ५०० μL में पमा स्टॉक (10 माइक्रोन) के 5 μL का उपयोग करने की सिफारिश की है । इससे पहले, dimethyl sulfoxide (DMSO), aliquot, और स्टॉक पर-20 ° c के 10 मिलीलीटर में एक lyophilized 1 g शीशी को भंग करके एक 10 माइक्रोन पमा शेयर तैयार करें ।
  4. वैकल्पिक रूप से (सुझाव) बेहतर homogenization के लिए कदम २.२ और २.३ गठबंधन । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में THP-1 कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर तैयार, पमा स्टॉक (10 माइक्रोन) के २०० μL जोड़ें, धीरे मिश्रण, और तुरंत बीज १०० प्रति अच्छी तरह से थाली पर μL । २.३ चरण में वर्णित के रूप में कोशिकाओं की मशीन ।

3. Apolipoprotein B घट सीरम (ABDS) तैयारी (Day 2 या 3)

  1. एक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) समाधान तैयार करने के लिए, 10% पंजाबियों (बाँझ एच2ओ के साथ) में २०० मिमी की एकाग्रता के लिए पीएच ७.४ में glycine पतला । खूंटी ८००० के 10 जी करने के लिए २०० mM glycine के ४० मिलीलीटर जोड़ें पेग 20% (डब्ल्यू/ घोल को जोरदार तरीके से homogenize.
  2. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक सीरम/प्लाज्मा नमूना पर 20% खूंटी के प्रति 10 भागों के 4 भागों पर लागू करें और बर्फ पर 25 मिनट17 (जैसे, प्लाज्मा या सीरम के १०० μL के लिए मिश्रण छोड़, 20% खूंटी समाधान के ४० μL जोड़ें) ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए खूंटी-apolipoprotein बी हाला १३,००० x g पर ।
  4. हाला को त्यागें । supernatant एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: हम 3 दिन (ताजा) पर ABDS की तैयारी सुझाव देते हैं । यदि यह संभव नहीं है, दिन 2 पर ABDS तैयार है और यह 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में रहते हैं ।

4. NBD-कोलेस्ट्रॉल सेल लोड हो रहा है (दिन 2)

  1. dmTHP के कल्चरल मीडियम को त्यागें-1 और कोशिकाओं को दो बार 1x फास्फेट वाले बफर खारा (पंजाब) से धोएं ।
  2. 5 माइक्रोन NBD के साथ कोशिकाओं लोड-कोलेस्ट्रॉल (१०० μL प्रति अच्छी तरह से) R10 माध्यम में और रात भर गर्मी में ३७ ° c, 5% सह2.

5. कोलेस्ट्रॉल स्वीकार करने वालों के साथ मशीन (3 दिन)

  1. मध् यम को छोड़ें और पंजाबियों के साथ दो बार कक्षों को धोएं ।
  2. 2-5% ABDS या शुद्ध लिपिड स्वीकारकर्ता (एचडीएल, ApoA, ApoE, आदि) की वांछित एकाग्रता के साथ कोशिकाओं को बेरंग RPMI १६४० मध्यम में पतला (१०० μL प्रति अच्छी तरह से) 4 के लिए-6 एच ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    नोट: स्वीकार करने वाले के बिना बेरंग RPMI १६४० माध्यम से एक नकारात्मक नियंत्रण (सी-) शामिल है और एक सकारात्मक नियंत्रण (सी +) (जैसे, स्वस्थ दाताओं या शुद्ध डेंसिटी के एक पूल से ABDS) । ध्यान दें कि सकारात्मक नियंत्रण विशेष रूप से लागू होता है जब रोगी के नमूनों (रोग की स्थिति) का विश्लेषण कर रहे हैं (अनुपूरक चित्रा 1).
  3. सेल lysis समाधान 1 (५० mm Tris बफर, १५० mm NaCl, एच2ओ) का २०० मिलीलीटर स्टॉक तैयार करें । lysis समाधान 2 को प्राप्त करने के लिए शुद्ध इथेनॉल के साथ 1:1 (v:v) अनुपात में सेल lysis समाधान 1 को मिलाएं ।

6. फ्लोरोसेंट सिग्नल कैप्चर (3 दिन)

  1. मीडिया NBD-कोलेस्ट्रॉल का पता लगाने
    1. प्लेट से सेल मध्यम निकालें और एक अपारदर्शी सपाट नीचे के साथ एक नया सफेद ९६-अच्छी तरह से थाली में इसे इकट्ठा ।
    2. मीडिया नमूनों में एक इष्टतम प्रतिदीप्ति संकेत पता लगाने के लिए, ९६-well सफेद प्लेट में 1:1 अनुपात प्राप्त करने के लिए प्रत्येक मध्यम नमूना के १०० μL करने के लिए शुद्ध इथेनॉल के १०० μL जोड़ें ।
    3. इलाज मीडिया के साथ थाली रखने के लिए आगे के उपाय करने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता (FI) एक 463 ⁄ 536 एनएम (उत्तेजना/उत्सर्जन) तरंग दैर्ध्य में luminometer ।
  2. Intracellular NBD-कोलेस्ट्रॉल का पता लगाना
    1. पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
    2. intracellular कोलेस्ट्रॉल को प्राप्त करने के लिए, लाइसे lysis समाधान 2 के प्रति अच्छी तरह से १०० μL के साथ उन्हें गर्मी और कमरे के तापमान (आरटी) के लिए 25 मिनट में थाली हिला द्वारा कोशिकाओं ।
    3. कक्ष lysate नमूनों में एक इष्टतम प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए, एक ही सफेद ९६ में सेल lysates की प्रतिदीप्ति तीव्रता पर कब्जा-स्पष्ट फ्लैट नीचे के साथ अच्छी तरह से थाली (एक ही प्लेट जिसमें कोशिकाओं के चरण २.२ में वरीयता प्राप्त थे).
  3. ६.३ में प्रतिदीप्ति तीव्रता (FI) को मापने जबकि सॉफ्टवेयर में ५० करने के लिए संवेदनशीलता पैरामीटर समायोजित luminometer ( सामग्री की तालिकादेखें).

7. परिणाम विश्लेषण

  1. सूत्र द्वारा परिकलित प्रतिशत के रूप में एक नमूने के कोलेस्ट्रॉल समाप्ति दर को व्यक्त:
    Equation
  2. नकारात्मक नियंत्रण के ce घटाकर (नमूना NBD-कोलेस्ट्रॉल के साथ भरी हुई है लेकिन बेरंग RPMI १६४० माध्यम से तैयार, कोलेस्ट्रॉल स्वीकार के बिना) एक दिए गए नमूनों की सीई से कोलेस्ट्रॉल समाप्ति (ce) के अंतिम उपाय प्राप्त करें:
    Equation 2

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Representative Results

कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख का उद्देश्य इन विट्रो में एक दिया सीरम, प्लाज्मा, या supernatant युक्त एचडीएल कणों की कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता निर्धारित करने के लिए है । विधि एक मानक मैक्रोफेज सेल लाइन की एक संस्कृति में और कोशिकाओं के साथ FBS-मुक्त मीडिया में पतला परीक्षण नमूना के साथ संपर्क उत्प्रेरण से लेबल लोड-कोलेस्ट्रॉल के होते हैं । अंत में, NBD से फ्लोरोसेंट स्तर मीडिया और सेल lysate में मापा जाता है । माप का अनुकूलन करने के लिए, मीडिया के लिए कोशिकाओं से effluxed कोलेस्ट्रॉल एक विलायक युक्त इथेनॉल की एक मात्रा के साथ मिलाया जाता है । NBD-कोशिकाओं में शेष कोलेस्ट्रॉल एक विलायक से पहले माप से युक्त इथेनॉल या डिटर्जेंट में resuspend है । अंत में, effluxed/कुल बला-कोलेस्ट्रॉल का अनुपात निर्धारित होता है. इस तकनीक को स्थापित करने के लिए, स्वस्थ दाताओं के एक पूल से apolipoprotein बी घट सीरम (ABDS) का इस्तेमाल किया गया था ।

मध्यम और इथेनॉल दोनों में NBD-कोलेस्ट्रॉल के लिए सर्वोत्तम कमजोर पड़ने की स्थिति की जांच की गई. हम कई विलायक वातावरण में मुक्त NBD-कोलेस्ट्रॉल के फ्लोरोसेंट व्यवहार का परीक्षण किया, इथेनॉल और बेरंग RPMI १६४० के विभिंन अनुपात भी शामिल है । NBD के प्रतिदीप्ति तीव्रता (FI)-जलीय समाधान में पतला कोलेस्ट्रॉल सबसे कम fi मूल्यों से पता चला है, जबकि NBD-शुद्ध इथेनॉल के भीतर कोलेस्ट्रॉल उच्चतम fi उत्सर्जित । इससे पता चलता है कि २२-NBD-कोलेस्ट्रॉल अणु का प्रतिदीप्ति उत्सर्जन उस माध्यम पर अत्यधिक निर्भर करता है जिसमें वह निहित है. तदनुसार, 22-NBD-कोलेस्ट्रॉल के प्रतिदीप्ति संकेत काफी अधिक है जब एक मीडिया युक्त इथेनॉल में रखा । हमने देखा है कि 1:1 मीडिया के अनुपात में: इथेनॉल, प्रतिदीप्ति तीव्रता संकेत 0.5-50 माइक्रोन की सीमा में कोलेस्ट्रॉल अनुरूप की एकाग्रता के साथ आनुपातिक बढ़ जाती है, इस मामले में जांच के एक उचित व्यवहार का सुझाव (चित्रा 2 ). 1:1 शर्त (मीडिया: इथेनॉल) में रैखिक व्यवहार का पालन समीकरण द्वारा दर्शाया जाता है: y = 20.88 x + १४६.७ R2 = ०.९३४१ के साथ ।

इस विधि में एक महत्वपूर्ण कदम समय कोलेस्ट्रॉल स्वीकार करता है तो कोलेस्ट्रॉल समाप्ति करने में सक्षम है के साथ भरी हुई कोशिकाओं मशीन बिताया है । आदेश में आवश्यक मशीन समय निर्धारित करने के लिए, सेल मीडिया अलग timepoints में काटा गया था (1 से 24 ज; चित्रा 3) । 0 से 6 एच की सीमा में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति रेखीय (पी < ०.०००१; y = 18.2 x + १२७.३) एक समय पर निर्भर तरीके से विकसित । ABDS कोशिकाओं को जोड़ा गया था के बाद अधिकतम संकेत कैप्चर 6 ज पर किया गया था । 6 एच के बाद, कोलेस्ट्रॉल समाप्ति में नियमितता खो दिया है, तो परिवर्तनशीलता के बाद 6 ABDS (चित्रा 3) के साथ मशीन के एच वृद्धि हुई है ।

हम इसके अतिरिक्त संतृप्ति सीमा और गतिशील रेंज परीक्षण के रूप में एचडीएल युक्त मीडिया (ABDS) के विभिंन प्रतिशत पर CE को मापने के द्वारा मानव ABDS के लिए लागू है । NBD-उच्च प्रवाह परख में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति (९६-well प्लेट) 1 के भीतर रैखिक विकसित-7% ABDS, जहां FI ABDS के साथ एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके में वृद्धि हुई, कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता के शिखर पर पहुंच 7% ABDS (चित्रा 4) । सांद्रता से अधिक 7%, FI ABDS प्रतिशत के साथ एक व्युत्क्रम संबंध में कमी आई । ऐसा इसलिए हुआ हो सकता है क्योंकि कोलेस्ट्रॉल मीडिया में मौजूद NBD-कोलेस्ट्रॉल लोडेड एचडीएल से कोशिकाओं को दोबारा दर्ज कर रहा था.

मानक विधि कोलेस्ट्रॉल समाप्ति को मापने के लिए रेडियो का उपयोग करता है-लेबल (3एच)16कोलेस्ट्रॉल । हमारे प्रतिदीप्ति आधारित विधि के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए, हम प्रदर्शन किया और दोनों फ्लोरोसेंट और रेडियो लेबल तकनीक की तुलना में । हमने पाया है कि पारंपरिक रेडियोधर्मिता तकनीक और हमारे NBD-कोलेस्ट्रॉल विधि अत्यधिक (पियरसन के आर = ०.९७; p < ०.००१) ABDS के विभिन्न सांद्रता का उपयोग कर (1 – 8%; चित्रा 5) । कुल मिलाकर, यह पता चलता है कि हमारे फ्लोरोसेंट विधि रेडियोधर्मी तकनीक की तुलना में एक सुरक्षित विकल्प हो सकता है ।

अंत में, हम NBD से अलग फ्लोरोसेंट जांच करने के लिए हमारे विधि की तुलना में । हम एक वाणिज्यिक उच्च प्रवाह सेल के लिए हमारे विधि-परख किट आधारित कोशिकाओं में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति निर्धारित करने के उद्देश्य से तुलना (कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख किट; सेल आधारित)। हमारे समूह में विकसित विधि 5 और 15% के बीच CE मूल्यों के भीतर स्वीकारकर्ता एकाग्रता (% ABDS) की वृद्धि के प्रति संवेदनशील था । हालांकि, वाणिज्यिक किट, निर्माता के निर्देशों के बाद प्रदर्शन किया, ABDS परख की सीमा के साथ 5% नीचे CE उपायों के परिणामस्वरूप; इस प्रकार, जिसके परिणामस्वरूप CE अनिवार्य रूप से अप्रभावित था जब ABDS बढ़ गया था (चित्रा 6).

Figure 1
चित्रा 1: प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल की आणविक संरचनाओं (क), 22-NBD-कोलेस्ट्रॉल (बी), और 25-NBD-कोलेस्ट्रॉल (सी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: NBD-कोलेस्ट्रॉल प्रतिदीप्ति तीव्रता (FI) इथेनॉल और बेरंग RPMI १६४० मध्यम के विभिन्न अनुपात के साथ. NBD-कोलेस्ट्रॉल 1:0, 3:1, 1:1, 1:3, और 0:1 इथेनॉल में पतला था: NBD-कोलेस्ट्रॉल सांद्रता में जलीय मध्यम अनुपात ०.५ और ५० के बीच µ m. FI सिग्नल luminometer द्वारा fluorimeter सॉफ़्टवेयर में ७० पर सेट संवेदनशीलता पैरामीटर के साथ पाया गया था । मीडिया और सेल lysate के FI सिग्नल सफेद ९६-well प्लेट्स का उपयोग कर मापा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा ३: समय-प्रगति NBD-THP में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति-१-व्युत्पन्न मैक्रोफेज. dmTHP-1 5 µ एम NBD-कोलेस्ट्रॉल के साथ भरी हुई थी और 5% ABDS के साथ मशीन । सेल मीडिया अलग timepoints (1-24 एच) में एक सफेद ९६ अच्छी तरह से थाली में मापा गया । मूल्यों quadruplicate कुओं का अर्थ ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । fluorimeter सॉफ़्टवेयर में ७० पर सेट संवेदनशीलता पैरामीटर के साथ luminometer द्वारा FI सिग्नल का पता लगाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: NBD-THP में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति-1-व्युत्पंन मैक्रोफेज में ९६-ABDS के विभिंन सांद्रता के साथ अच्छी तरह से थाली । dmTHP-1 कोशिकाओं 5 µ एम NBD के साथ इलाज किया गया-कोलेस्ट्रॉल, ABDS के विभिन्न प्रतिशत के साथ गर्मी, और इथेनॉल के साथ लीजड ड. मीडिया और सेल lysate के FI सिग्नल fluorimeter में 1:1 (इथेनॉल: lysis समाधान 1) में एक सफेद ९६-अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर मापा गया था । नकारात्मक नियंत्रण (ABDS अनुपचारित मीडिया) के उपायों प्रदान की स्तरों पर घटाया गया । मूल्यों तपसिल कुओं का अर्थ ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । fluorimeter सॉफ़्टवेयर में ५० पर सेट संवेदनशीलता पैरामीटर के साथ luminometer द्वारा FI सिग्नल का पता लगाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: NBD के सहसंबंध-कोलेस्ट्रॉल और [3एच]-THP में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति-1-व्युत्पन्न मैक्रोफेज. इसके बाद dmTHP-1 के साथ इसी बला-कोलेस्ट्रोल के लिए 6 ज. कोलेस्ट्रॉल समाप्ति 1-8% ABDS का उपयोग कर मापा गया था । NBD-कोलेस्ट्रॉल के नमूनों के लिए, फ्लोरोसेंट संकेत सफेद ९६-अच्छी तरह से fluorimeter में 1:1 इथेनॉल में प्लेटों का उपयोग कर पाया गया था: lysis समाधान 1 । fluorimeter सॉफ़्टवेयर में ५० पर सेट संवेदनशीलता पैरामीटर के साथ luminometer द्वारा FI सिग्नल का पता लगाया गया था । [3एच] के लिए-कोलेस्ट्रॉल के नमूने, रेडियोधर्मी संकेत मध्यम और कोशिका lysate के १०० µ एल का उपयोग कर पाया गया था और जुटाना कॉकटेल में लाल, कम एट अल.17 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के बाद । सहसंबंध दक्षता पियरसन के r सहसंबंध गुणांक का उपयोग करके निर्धारित की गई थी । नकारात्मक नियंत्रण (ABDS अनुपचारित मीडिया) के उपायों प्रदान की दोनों प्रतिदीप्ति और रेडियोधर्मी स्तर से घटाया गया । मूल्यों तपसिल कुओं का अर्थ ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: उच्च प्रवाह NBD-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख और एक व्यावसायिक फ्लोरोसेंट सेल आधारित परख किट के बीच तुलना । ABDS से कोलेस्ट्रॉल समाप्ति वर्णित प्रोटोकॉल के बाद मूल्यांकन किया गया था, lysis विलायक इथेनॉल के रूप में प्रयोग (५०%) या ८० के बीच (1%) । फ्लोरोसेंट सेल आधारित परख किट किट में निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मूल्यांकन किया गया था । मूल्यों तपसिल कुओं का अर्थ ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । FI संकेत संवेदनशीलता पैरामीटर fluorimeter सॉफ्टवेयर में ५० पर सेट के साथ luminometer द्वारा पाया गया था कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: कार्यप्रवाह आरेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक आंकड़ा 1: NBD-एचआईवी संक्रमित रोगियों और एक मानक सकारात्मक नियंत्रण से सीरम नमूनों की कोलेस्ट्रॉल समाप्ति (सी +) । NBD-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति विधि एचआईवी संक्रमित रोगियों का एक सेट करने के लिए लागू की अंतर व्यक्तिगत भिंनता दिखाया गया है । एक सकारात्मक आंतरिक नियंत्रण (सी +) डी NBD का प्रतिनिधित्व करता है-8 स्वस्थ रोगियों के सीरा नमूने के एक पूल से कोलेस्ट्रॉल समाप्ति । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन दिखाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

फ्लोरोसेंट लेबल कोलेस्ट्रॉल एक आशाजनक रणनीति का विश्लेषण और गुणों और प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल के चयापचय की जांच इन विट्रो में है । इसका मुख्य लाभ यह है कि यह कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है, intracellular और झिल्ली वितरण अध्ययन के लिए अनुमति देता है, और इस प्रोटोकॉल (चित्रा 7) के रूप में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख के लिए लागू किया जा सकता है । कुछ फ्लोरोसेंट-बला sterols कोलेस्ट्रॉल BODIPY सहित इन विट्रो में ट्रैकिंग की अनुमति-कोलेस्ट्रॉल, dansyl-कोलेस्ट्रॉल, dehydroegrosterol, और 22-और 25-NBD-कोलेस्ट्रॉल12. विशेष रूप से, 22-NBD-कोलेस्ट्रॉल अलग सेल प्रकार के साथ और रेडियो के एक विकल्प के रूप में कोलेस्ट्रॉल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है-18लेबल कोलेस्ट्रॉल । कोई आम सहमति विधि एक कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख में फ्लोरोसेंट संकेत का मूल्यांकन करने के लिए है । गीत एट अल.14 काटा मध्यम और सेल lysates अलग से मापने के लिए FI; लियू एट अल.14 अंय प्लेटों के माध्यम हस्तांतरित, और intracellular फ्लोरोसेंट संकेत संस्कृति की थाली में सीधे मापा गया था; और जांग एट अल.15 एक lysis बफर का इस्तेमाल किया कोशिकाओं लाइसे, फ्लोरोसेंट कोलेस्ट्रॉल की शुद्धि के लिए यह शुद्ध इथेनॉल में पतला और प्रतिदीप्ति तीव्रता संकेत19का पता लगाने के बाद । हमारे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख में, मीडिया और कोशिकाओं में ही अंतिम विलायक संरचना के उपयोग की अनुमति सेल मीडिया और lysate की माप के homogenization कुशलता से ।

वर्तमान अध्ययन NBD-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति समय के साथ फाइल की और एक समय पर निर्भर प्रगति पाया जब तक स्वीकारकर्ता ABDS, गीत एट अल.14 और लियू एट अल.14 और विपरीत जांग एट अल के साथ 6 ज की गर्मी । जो एक 1 एच मशीन की अवधि का इस्तेमाल किया लिपिड स्वीकार के साथ19. हमने पाया है कि गर्मी के 6 ज के बाद, effluxed कोलेस्ट्रॉल रैखिकता खो दिया; इसलिए, यह सर्वोपरि है 6 एच से अधिक नहीं है । हमारे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति की इष्टतम रेंज स्वीकार करने वालों को जोड़ने के बाद के बीच 3 से 6 एच था । हम कोलेस्ट्रॉल स्वीकार करने वालों के साथ 4 एच के लिए गर्मी कोशिकाओं का सुझाव । अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम बेरंग मीडिया का उपयोग करने के लिए स्वीकारकर्ता लागू करने के लिए पृष्ठभूमि से बचने के लिए कर रहे हैं, एक अर्द्ध-धाराप्रवाह सेल संस्कृति परत बोने, और प्लेट के लिए उन का एक सही पालन सुनिश्चित करने । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सफेद थाली के स्पष्ट नीचे एक व्युत्क्रम प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का पालन करने के लिए उपयोगी है ।

अधिकांश कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख बाहर कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परीक्षण में शुद्ध लिपिड स्वीकार का उपयोग किया जाता है । वर्तमान तकनीक मानव सीरम या प्लाज्मा नमूनों से कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था । हम आंतरिक कोलेस्ट्रॉल स्वीकार्यता सीरम में मौजूद का उपयोग करें, लेकिन यह apolipoprotein बी युक्त कणों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो20कोशिकाओंकेअंदर कोलेस्ट्रॉल अणुओं recirculat होगा,21. संशोधनों के रूप में, शुद्ध ApoAI और एचडीएल भी स्वीकारकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, सेल मानव THP-1 के अलावा अंय लाइनों को सफलतापूर्वक ऐसे कच्चे २६४.७ या J774A1 मैक्रोफेज के रूप में फ्लोरोसेंट कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख, में इस्तेमाल किया गया है और इस प्रकार की संभावना हमारे विधि में काम करेंगे15,22।

इस विधि की मुख्य सीमाएं है कि परिणाम विशिष्ट सेल लाइन, एक मानक सेल लाइन पर निर्भर है, लेकिन सेल मुक्त विधि एक के रूप में उपयोग करने के लिए लाभप्रद होगा । इसके अलावा, इस विधि को मानकीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया सीरा जम गया था; कोलेस्ट्रॉल पर NBD moiety रेडियो की तुलना में कम शारीरिक है-एक लेबल, और उसके अंतर्जात कोलेस्ट्रॉल से अलग है; और हम प्रक्रियाओं का एक सेट के अंतिम परिणाम का परीक्षण किया (यानी, सीरम कणों को शामिल, एक सेल लाइन, कोलेस्ट्रॉल की संभव esterification, कोलेस्ट्रॉल के संभव प्रसार या एक साथ समाप्ति और आमद प्रक्रियाओं). हालांकि, एक लाभ के रूप में, प्रतिदीप्ति आधारित तकनीक के लिए पारंपरिक रेडियो लेबल तकनीक के लिए विकल्प के रूप में उच्च क्षमता है और [3एच के प्रतिस्थापन में दिखाया गया है]-कोलेस्ट्रॉल, एक फ्लोरोसेंट बला अणु द्वारा की निगरानी के लिए कोलेस्ट्रॉल समाप्ति14परख ।

कोलेस्ट्रॉल समाप्ति23atherosclerosis के रूप में कार्य कर सकते हैं, के रूप में यह भविष्य के हृदय की घटनाओं के साथ संबद्ध24,25। एक संभावना atherosclerosis में मैक्रोफेज की भूमिका का अध्ययन करने के लिए शुद्ध डेंसिटी और इसकी संरचना के माध्यम से है; हालांकि, डेंसिटी शुद्धि एक दुरूह और समय लेने वाली प्रक्रिया है । इसके अलावा, शुद्धि के दौरान, atherogenic प्रभाव के साथ अंय सीरम घटकों को कम करके आंका जा सकता है या खो दिया है । कि कारण के लिए, ABDS लिपिड स्वीकारकर्ता के रूप में चुना गया था । उच्च प्रवाह पैमाने और समय में कटौती संभव एक प्लेट रीडर के लिए जुटाना काउंटर प्रतिस्थापन द्वारा किए गए थे, एक ही संस्कृति की थाली में फ्लोरोसेंट संकेत को मापने (सेल lysate के मामले में), और दो दिन से प्रोटोकॉल को कम करने । इसके अलावा, इस तकनीक उच्च संवेदनशीलता से पता चलता है जब कोशिकाओं को कोलेस्ट्रॉल समाप्ति का आकलन करने के लिए एक व्यावसायिक किट से प्राप्त उपायों से सीरम के विभिंन सांद्रता के लिए संपर्क कर रहे हैं ।

अंत में, एक NBD-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख है कि पारंपरिक रेडियोधर्मी विधि के साथ संबद्ध वर्णित किया गया है । हम इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए मानव नमूनों (सीरम या प्लाज्मा) से लिपिड स्वीकार ABDS के रूप में मशीन । हम सेल सीडिंग, भेदभाव, गतिशील रेंज, और तकनीक के संतृप्ति बिंदु अनुकूलित । इसके मुख्य नवीनता के लिए के रूप में, हम उच्च तीव्रता और एक बेहतर रैखिक रेंज प्राप्त करने के लिए माप में इस्तेमाल एक विलायक संयोजन अनुकूलित.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा की है कि वे पेटेंट आवेदन के अंवेषकों है इच्छा (ईपीओ; 18382337.6-1118; 17 मई २०१८) हकदार "कोलेस्ट्रॉल समाप्ति निर्धारित करने के लिए विधि" इस पद्धति के आधार पर ।

Acknowledgments

इस कार्य को Instituto डी Salud कार्लोस III, मैड्रिड, स्पेन से अनुसंधान अनुदान वित्तीय संस्थाओं (PS12/00866) द्वारा आंशिक रूप से समर्थित किया गया है; Fondo Europeo पैरा एल Desarrollo रिजनल (FEDER); Red de Investigación en सीडा (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) और CERCA कार्यक्रम/Generalitat डे Catalunya । लेखकों ने Institut d'Investigacions Biomèdiques अगस्त पीआई आइ Sunyer (IDIBAPS) की Retrovirology और वायरल Immunopathology प्रयोगशाला का धन्यवाद किया । हम Escribà, सी. Rovira, और सी. Hurtado उनकी सहायता के लिए धंयवाद और ज्ञान और प्रौद्योगिकी के स्थानांतरण कार्यालय से Cufí आविष्कार की रक्षा में उसके मार्गदर्शन के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well collecting plate Corning Inc Costar 3912 white 96-well plate with opaque clear bottom
96-well culture plate Corning Inc Costar 3610 white 96-well plate with flat clear bottom
Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) Abcam ab196985 commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux
colorless RPMI 1640 Sigma-Aldrich R7509 RPMI 1640 with no pehnol-red
Gen5 Data Analysis Software BioTek Version 2.0
Glycine Sigma-Aldrich G8790-100G Glycine, non-animal use
Luminometer Biotek SYNERGY HT Multi-Detection Microplate Reader
Lysis Solution 1 in-house 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O
Lysis Solution 2 in-house Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)
NBD-cholesterol Thermo-Fisher N1148 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol
PBS Sigma-Aldrich P3813 Phosphate-buffered saline
PEG 8000 Sigma-Aldrich 202452-250G polyethylene glycol
PMA Sigma-Aldrich 79346 Phorbol 12-merystate B-acetate.
R10 in-house RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin.
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758 RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose
THP-1 cells Sigma-Aldrich ATCC, #TIB-202 monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754

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References

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