Summary
Mätning av in vitro-kolesterol efflux kapacitet att serum eller plasma i makrofag cellmodeller är ett lovande verktyg som en biomarkör för åderförkalkning. I den aktuella studien, vi optimera och standardisera en fluorescerande NBD-kolesterol efflux metod och utveckla en hög genomströmning analys med 96 brunnar.
Abstract
Åderförkalkning leder till hjärt-kärlsjukdom (CVD). Det är fortfarande oklart om kolesterolet-HDL (cHDL) koncentration spelar en kausal roll i utveckling av åderförkalkning. Men en viktig faktor i tidigt skede av aterom plack är kolesterol efflux kapacitet att HDL (HDL partiklar förmåga att acceptera kolesterol från makrofager) för att undvika skum cellnybildningen. Detta är ett viktigt steg i att undvika ansamling av kolesterol i endotelet och en del av omvänd kolesterol transport (RCT) för att eliminera kolesterol genom levern. Kolesterol efflux kapacitet att serum eller plasma i makrofag cellmodeller är ett lovande verktyg som kan användas som biomarkör för åderförkalkning. Traditionellt, [3H]-kolesterol har använts i kolesterol efflux analyser. I denna studie, vi strävar efter att utveckla en strategi för säkrare och snabbare som använder fluorescerande märkt-kolesterol (NBD-kolesterol) i en cellulär analysen att spåra kolesterol upptag och efflux processen i THP-1-härledda makrofager. Slutligen, vi optimera och standardisera metoden NBD-kolesterol efflux och utveckla en hög genomströmning analys med 96 brunnar.
Introduction
Enligt Världshälsoorganisationen är nuvarande huvudsakliga dödsorsakerna över hela världen ischemisk hjärtsjukdom och stroke (redovisning för totalt 15,2 miljoner dödsfall)1. Båda är hjärt-kärlsjukdom (CVD) som kan föregås av åderförkalkning och bristning av aterom plack i blodkärlen2,3.
Åderförkalkning är en fartyget vägg inflammatorisk sjukdom där makrofager, T-celler, mastceller och dendritiska celler infiltrera endotelet och ackumuleras från blodet, så småningom bilda aterosklerotiska plack. Aterosklerotiska plack presenterar en lipid core och kolesterol kristaller, framgår av högupplösta B-mode ultraljud mätningar av den carotid intima-media tjocklek4,5. I makrofager utförs kolesterol efflux mot lipid acceptor partiklar med medel av ATP-bindande kassett (ABC) receptorer ABCA1, ATP bindande kassett underfamilj G medlem 1 (ABCG1), och gatsopare receptorn SR-BI. Obalansen av kolesterol inflödet och utflödet i makrofager anses vara en viktig process i åderförkalkning inledande6. Kolesterol efflux anses vara ett viktigt steg i kolesterol elimination från perifer vävnad till plasma och lever i en process som kallas omvänd kolesterol transport (RCT). Kolesterol är överförs från makrofager främst till apolipoprotein A1 (ApoA1) finns på ytan av high-density lipoprotein (HDL) partiklar. HDLs sedan transporterar kolesterol till levern för utsöndring och återanvändning7,8,9.
Tritium (3H) isotopmärkt kolesterol har traditionellt använts i kolesterol efflux10. Utsläpp signalen av radioisotoper är mycket känsliga10; isotopmärkt kolesterol presenterar emellertid uppenbara nackdelar såsom lång protokoll, risk för exponering för joniserande strålning och behovet av särskilda radioaktivitet faciliteter och utrustning för att garantera säker hantering av radioaktivt utsläpp. Tvärtom, har fluorescens integrerats framgångsrikt i diagnosmetoder tack vare sin enkelhet i fluorescerande signaldetektion, en stor mängd fluorophores tillgänglig och dess säkerhet11. Flera lysrör-märkt växtsteroler har använts för att studera kolesterol metabolism inklusive dehydroergosterol (med inneboende fluorescens), dansyl kolesterol, 4,4-difluor-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - kolesterol och 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-kolesterol). Särskilt, presenterar NBD-kolesterol ett effektivt upptag i mänskliga celler12. Två olika NBD märkt-kolesterol är för närvarande tillgängliga: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) och 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; (Se figur 1). Kolesterol märkt med 22-NBD biexponentiellt kan bäst passa kolesterol efflux studier, medan 25-NBD-kolesterol används främst i cellulära membran dynamics forskning13,14.
Cellinjer som normalt används i in vitro-kolesterol efflux analyser är monocyt-liknande celler såsom mänskliga leukemi-derived THP-1 celler, murina Raw 264,7 celler15eller J774.1. Alla dessa celler kan differentieras till makrofager i vitro använder phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA), men THP-1-härledda makrofager (dmTHP-1) bästa reflektera och efterlikna det mänskliga makrofager16.
I den aktuella studien, vi optimera och standardisera en fluorescerande hög genomströmning metod för att bestämma kolesterol efflux kapacitet serumprover på dmTHP-1, med 22-NBD-kolesterol som ett alternativ till [3H]-kolesterol. Dessutom jämför vi optimerade fluorescerande tekniken med standard radioaktiva analog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För denna studie erhölls godkännande från etiska kommittén (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcelona, godkännandenummer HCB/2014/0756) och skriftlig, informerade samtycke från alla ämnen.
1. NBD-kolesterol förberedelse
- Lös upp NBD-kolesterol (MW 494.63, se Tabell för material) i ren etanol för att få beståndet (2 mM). För en 10 mg injektionsflaska, lös hela flaskans innehåll i en 10,1 mL volym etanol att erhålla en 2 mM lager.
- Späd den NBD-kolesterolhalt från lager i RPMI 1640 kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 5% penicillin/streptomycin (R10 medium) att nå en slutlig koncentration på 5 μM (t.ex., erhålla 10 mL av NBD-kolesterol på 5 μM slutlig koncentration) av späda 25 μL av NBD-kolesterol lager (2 mM) i R10 medium. Denna volym är tillräckligt för en plattan med 96 brunnar.
2. cell kultur och sådd (dag-2)
- Kultur THP-1 celler i R10 medium vid 37 ° C, 5% CO2. Justera till 0,3 x 106 celler/mL varje 3 dagar.
- Utsäde cellerna i en vit plattan med 96 brunnar med en platta, tydlig botten på 0,2 x 106 celler per brunn i R10 medium (100 μl per brunn).
- Behandla cellerna med 100 nM phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA; från en 10 μM lager) för 48-72 h, inkubation vid 37 ° C, 5% CO2 att skilja THP-1-celler in i dmTHP-1.
Obs: Det rekommenderas att använda 5 μL av PMA lager (10 μM) i 500 μL av R10 medium. Dessförinnan, förbereda en 10 μM PMA lager genom att lösa en lyofiliserad 1 g injektionsflaska på 10 mL av dimetyl sulfoxid (DMSO), alikvotens och lager vid-20 ° C. - Alternativt (förslag) kombinera steg 2.2 och 2.3 för bättre homogenisering. Förbereda 10 mL THP-1 celler i en 15 mL tub, tillsätt 200 μl av PMA lager (10 μM), blanda försiktigt och omedelbart utsäde 100 μl per brunn på plattan. Inkubera cellerna som beskrivs i steg 2,3.
3. Apolipoprotein B utarmat Serum (ABDS) förberedelse (dag 2 eller 3)
- För att förbereda en polyetylenglykol (PEG) lösning, späd glycin i 10% PBS (med steril H2O) till en koncentration av 200 mM vid pH 7,4. Tillsätt 40 mL 200 mM glycin till 10 g av PEG 8000 att få PEG 20% (w/v). Blanda lösningen kraftigt för att homogenisera.
- Applicera 4 delar av 20% PEG per 10 delar av serum/plasma på varje serum/plasma prov i ett 1,5 mL rör och låt blandningen på is för 25 min17 (t.ex. för 100 μl plasma eller serum, tillsätt 40 μl 20% PEG lösning).
- Centrifugera PEG-apolipoprotein B fällningen vid 13 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Kassera fällningen. Överför supernatanten till en ny tub.
Obs: Vi föreslår att förbereda ABDS på dag 3 (färsk). Om det inte är möjligt, förbereda ABDS på dag 2 och hålla det vid 4 ° C över natten.
4. NBD-kolesterol Cell lastning (dag 2)
- Kassera odlingssubstratet av dmTHP-1 och tvätta cellerna två gånger med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Ladda cellerna med 5 μM NBD-kolesterol (100 μl per brunn) i R10 medium och inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
5. inkubation med kolesterol acceptorer (dag 3)
- Kassera mediet och tvätta cellerna två gånger med PBS.
- Inkubera cellerna med 2 – 5% ABDS eller önskad koncentration av renad lipid acceptor (HDL, ApoA, ApoE, etc.) utspätt i färglösa RPMI 1640 medium (100 μl per brunn) för 4 – 6 timmar vid 37 ° C.
Obs: Inkludera en negativ kontroll (C-) bestående av färglös RPMI 1640 medium utan acceptorer och en positiv kontroll (C +) (t.ex. ABDS från en pool av friska donatorer) eller renat HDLs. Observera att den positiva kontrollen gäller särskilt när patientprover (sjukdomstillstånd) är analyseras (kompletterande Figur1). - Förbereda en 200 mL lager av cell lysis lösningen 1 (50 mM Tris buffert, 150 mM NaCl, H2O). Blanda cell lysis lösning 1 på 1:1 (v: v) förhållandet med ren etanol att skaffa Lys lösning 2.
6. fluorescerande Signal Capture (dag 3)
-
Media NBD-kolesterol upptäckt
- Ta bort cellen mediet från plattorna och samla det i en ny vit plattan med 96 brunnar med en ogenomskinlig platt botten.
- För en optimal fluorescens signal upptäckt i media prover, tillsätt 100 μL av ren etanol till 100 μL av varje medium prov att få förhållandet 1:1 i 96 brunnar vit plåt.
- Hålla plattan med behandlade media ytterligare åtgärd fluorescensintensiteten (FI) vid en 463⁄536 nm (excitation/utsläpp) våglängd i luminometern.
-
Intracellulära NBD-kolesterol upptäckt
- Tvätta cellerna två gånger med PBS.
- För att få den intracellulära kolesterolet, lyse celler genom inkubering med 100 μL av Lys lösning 2 per brunn och skaka plattan vid rumstemperatur (RT) i 25 min.
- För en optimal fluorescens signaldetektion i cell lysate prover, fånga fluorescensintensiteten hos den cellen lysates i samma vita botten plattan med 96 brunnar med tydlig platt (samma platta där celler var seedad i steg 2.2).
- 6.3 Mät fluorescensintensiteten (FI) i luminometern medan du justerar känsligheten parametern till 50 i programvaran (se Tabell för material).
7. resultat analys
- Express efflux kolesterolhalt av ett prov som en procentsats som beräknas av formeln:
- Erhålla de slutliga måttet på kolesterol efflux (CE) genom att subtrahera CE av den negativa kontrollen (prov lastad med NBD-kolesterol men inkuberas med färglös RPMI 1640 medium, utan kolesterol acceptorer) från CE av en tanke prover:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med kolesterol efflux analysen är att bestämma in vitro-kolesterol efflux kapaciteten hos ett givet serum, plasma eller supernatanten innehållande HDL partiklar. Metoden består av lastning märkt-kolesterol till en kultur av en standard makrofag cellinje och förmå kontakt med testning provet spädas i FBS-fria medier med celler. Slutligen mäts de fluorescerande nivåerna från NBD i media och cell lysate. För att optimera mätningar, blandas effluxed kolesterol från cellerna till media med en volym av en vätska som innehåller etanol. NBD-kolesterol kvar i cellerna är resuspended i ett lösningsmedel som innehåller etanol eller diskmedel innan mätningar. Slutligen bestäms förhållandet mellan märkta effluxed/total-kolesterol. Ställ in tekniken, användes apolipoprotein B-utarmat serum (ABDS) från en pool av friska donatorer.
De bästa utspädning förutsättningarna för NBD-kolesterol i både medium och etanol undersöktes. Vi testade gratis NBD-kolesterol fluorescerande beteende i flera lösningsmedel miljöer, inklusive olika nyckeltal av etanol och färglös RPMI 1640. Fluorescensintensiteten (FI) av NBD-kolesterol utspädd i vattenlösningen visade de lägsta FI-värden, medan NBD-kolesterol i ren etanol som avges av högsta FI. Detta tyder på att fluorescens utsläpp av 22-NBD-kolesterol molekylen är starkt beroende av det medium i vilket det ingår. Fluorescens signalen av 22-NBD-kolesterol är således betydligt högre när den placeras i en etanol som innehåller media. Vi observerade att i förhållandet 1:1 media: etanol, fluorescens intensitet signalen ökar proportionellt med koncentrationen av kolesterol analoga i intervallet 0,5 – 50 μM, föreslå ett lämpligt beteende av sonden i detta fall (figur 2 ). Det linjära uppförandet i villkoret 1:1 (media: etanol) representeras av följa ekvationen: y = 20,88 x + 146,7 med R2 = 0.9341.
Ett viktigt steg i denna metod är den tid ruvar de laddade cellerna med kolesterol acceptorer så kolesterol kan efflux. För att fastställa nödvändiga inkubationstiden, skördades cell media vid olika tidpunkter (1 till 24 h. (Se figur 3). Av kolesterol utflödet i intervallet 0 till 6 h utvecklats linjärt (p < 0,0001; y = 18,2 x + 127,3) på en tidsberoende sätt. Maximala signalen fångas var på 6 h efter ABDS lades till celler. Efter 6 h, kolesterol förlorade regelbundenhet i efflux, så variabilitet ökade efter 6 h inkubation med ABDS (figur 3).
Vi testade dessutom mättnad tröskeln och dynamiskt omfång som tillämpas för mänskliga ABDS genom att mäta CE på olika procentsatser av HDL-innehållande media (ABDS). NBD-kolesterol utflödet i hög genomströmning-analysen (plattan med 96 brunnar) utvecklats linjärt inom 1 – 7% ABDS, där FI ökade på ett koncentrationsberoende sätt med de ABDS, når toppen av kolesterol efflux kapacitet på 7% ABDS (figur 4). Vid koncentrationer som är högre än 7% minskade FI i ett omvänt förhållande med procentsatsen som ABDS. Detta kan ha uppstått eftersom kolesterol reentering cellerna från NBD-kolesterol laddad HDL i media.
Den vanliga metoden att mäta kolesterol efflux använder radioaktivt märkt (3H) kolesterol16. Utvärdera prestanda för vår fluorescens-baserade metod, vi utfört och jämfört både lysrör och radioaktivt märkt tekniker. Vi hittade att den traditionella radioaktivitet metod och våra NBD-kolesterol var starkt korrelerade (Pearson's r = 0,97; p < 0,001) använder olika koncentrationer av ABDS (1 – 8%. (Se figur 5). Övergripande, detta tyder på att vår fluorescerande metod kan vara en säkrare ersättning än den radioaktiva tekniken.
Slutligen, vi jämfört med vår metod fluorescerande sonden skiljer sig från NBD. Vi jämförde vår metod till en kommersiell hög genomströmning cellbaserade test kit syftar till att fastställa kolesterol utflödet i celler (kolesterol efflux analyssats; cellbaserade). Den metod som utvecklats i vår grupp var känslig för en ökning av acceptor koncentration (% ABDS) inom CE-värden mellan 5 och 15%. Den kommersiella kit, utförs efter tillverkarens instruktioner, resulterade dock i CE åtgärder under 5% längs det utbud av ABDS analyseras; Således, den resulterande CE var väsentligen opåverkad när ABDS var ökat (figur 6).
Figur 1: molekylära strukturer naturliga kolesterol (A), 22-NBD-kolesterol (B) och 25-NBD-kolesterol (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: NBD-kolesterol fluorescensintensiteten (FI) med olika nyckeltal för etanol och färglös RPMI 1640 medium. NBD-kolesterol var utspädd i 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 och 0:1 etanol: vattenhaltigt medium nyckeltal på NBD-kolesterol koncentrationer mellan 0,5 och 50 µM. FI signal upptäcktes av luminometern med parametern känslighet inställd på 70 i programvaran fluorimeter. FI signalen för media och cell lysate mättes med vita 96 brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tid-progression NBD-kolesterol efflux THP-1-härledda makrofager. Den dmTHP-1 var lastade med 5 µM NBD-kolesterol och inkuberas med 5% ABDS. Cell media mättes i en vit plattan med 96 brunnar vid olika tidpunkter (1 – 24 h). Värdena presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen för quadruplicate wells. FI-signalen upptäcktes av luminometern med parametern känslighet inställd på 70 i programvaran fluorimeter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: NBD-kolesterol efflux THP-1-härledda makrofager i plattan med 96 brunnar med olika koncentrationer av ABDS. DmTHP-1 cellerna behandlades med 5 µM NBD-kolesterol, inkuberas med olika procentsatser av ABDS och lyserat med etanol. FI signalen för media och cell lysate mättes med en vit platta med 96 brunnar i fluorimeter 1:1 (etanol: lysis lösning 1). Åtgärderna av negativa kontroller (ABDS obehandlad media) var subtraheras vid de nivåer som. Värdena presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen av tre exemplar brunnar. FI-signalen upptäcktes av luminometern med parametern känslighet inställd på 50 i programvaran fluorimeter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Korrelation av NBD-kolesterol och [3H]-kolesterol efflux THP-1-härledda makrofager. Följande dmTHP-1 med det motsvarande märkta-kolesterolhalt för 6 h. Av kolesterol utflödet mättes med 1-8% ABDS. För NBD-kolesterol prover upptäcktes fluorescerande signalen med vita 96 brunnar i fluorimeter på 1:1 etanol: lysis lösning 1. FI-signalen upptäcktes av luminometern med parametern känslighet inställd på 50 i programvaran fluorimeter. För [3H]-kolesterol prover, radioaktiva signalen upptäcktes med hjälp av 100 µL av medium och cell lysate blandat med scintillation cocktail och röda i den scintillationsräknare, efter protokollet beskrivs av låg et al.17. Korrelation effektivitet bestämdes med hjälp av korrelationskoefficienten till Pearsons r. Åtgärderna av negativa kontroller (ABDS obehandlad media) var subtraheras från både fluorescens och radioaktiva nivåer som tillhandahålls. Värdena presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen av tre exemplar brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: jämförelse mellan hög genomströmning NBD-kolesterol efflux analys och en kommersialiserad fluorescerande cellbaserade analyssats. Kolesterol efflux från ABDS bedömdes efter protokollet beskrivs, använda som lysis lösningsmedel etanol (50%) eller Tween 80 (1%). Den fluorescerande cellbaserade analyssats bedömdes enligt tillverkarens protokollet i kit. Värdena presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen av tre exemplar brunnar. FI-signalen upptäcktes av luminometern med parametern känslighet inställd på 50 i programvaran fluorimeter vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: arbetsflödesdiagram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: NBD-kolesterol utflödet av serumprover från HIV-infekterade patienter och en standard positiv kontroll (C +). Den interindividuella variationen av NBD-kolesterol efflux metoden tillämpas till en uppsättning av HIV-infekterade patienter visas. En positiv inre kontroll (C +) representerar de NBD-kolesterol utflödet från en pool av sera prover av 8 friska patienter. Felstaplar visar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lysrör-märkt kolesterol är en lovande strategi för att analysera och undersöka egenskaper och metabolismen av naturliga kolesterol in vitro. Dess främsta fördelar är att det kan tas upp av celler, möjliggör intracellulära och membran distributionsstudier, och kan tillämpas på kolesterol efflux analyser såsom i detta protokoll (figur 7). Vissa lysrör-märkt steroler tillåta kolesterol spårning in vitro-inklusive BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol och 22 - och 25-NBD-kolesterol12. 22-NBD-kolesterol är särskilt lämpliga för att studera kolesterol dynamics med olika celltyper och som en ersättning av radioaktivt märkt kolesterol18. Det finns ingen konsensus metod att utvärdera fluorescerande signalen i en kolesterol efflux-analys. Låt et al.14 skördas medium och cell lysates att mäta FI separat. LiU et al.14 överförs mediet till andra plåtar och intracellulära fluorescerande signalen mättes direkt på kultur plattan; och Zhang et al.15 används en lyseringsbuffert för att lysera celler, följt av rening av fluorescerande kolesterol att späda ut det i ren etanol och upptäcka fluorescens intensitet signal19. I vårt kolesterol efflux assay, använda samma slutliga lösningsmedel sammansättning i media och celler tillåts homogenisering av cell media och mätningar av lysat effektivt.
Föreliggande studie profilerad NBD-kolesterol utflödet över tiden och hittade en tidsberoende progression tills 6 h inkubation med de acceptor ABDS, liknande låt et al.14 och Liu et al.14 och till skillnad från Zhang et al. som används en 1 h inkubationstid med lipid acceptorer19. Vi hittade att effluxed kolesterol efter 6 h inkubation, förlorat linjäritet; Därför är det avgörande att inte överstiga 6 h. Vår optimala utbudet av kolesterol efflux var mellan 3 till 6 h efter tillägger acceptorer. Vi föreslår att ruva celler för 4 h med de kolesterol acceptorer. Ytterligare viktiga steg är användning av färglösa medier att tillämpa acceptorer för att undvika bakgrund, sådd en semi konfluenta celllagrar kultur, och att säkerställa en korrekt efterlevnad av de till plattan. Det bör noteras att tydlig botten av den vita plattan är användbart att följa cellerna under ett inverterat ljusmikroskop.
De flesta kolesterol efflux analyser utförs med hjälp av renad lipid acceptorer i kolesterol efflux testet. Den nuvarande tekniken utvecklades för att erhålla kolesterol efflux kapacitet från humant serum- eller plasmaprover. Vi använder de inneboende kolesterol acceptorer närvarande i serum, men det är viktigt att ta bort partiklar som innehåller apolipoprotein B, som skulle återcirkulera kolesterol molekylerna inuti celler20,21. Som modifieringar, kan renat ApoAI och HDL också användas som acceptorer. Även cell linjer än mänskliga THP-1 har använts framgångsrikt i fluorescerande kolesterol efflux analyser, såsom rå 264,7 eller J774A1 makrofager och skulle således sannolikt arbete i vår metod15,22.
De viktigaste begränsningarna med denna metod är att resultaten beror på den specifika cellinje, en standard cellinje men cellfria metod skulle vara fördelaktigt att använda som en biomarkör. Också, med referensserum som används för att standardisera denna metod var frusen; den NBD biexponentiellt på kolesterol är mindre fysiologiska än det radioaktivt märkt och dess upptag skiljer sig från det endogent kolesterolet; och vi testade det slutliga resultatet av en uppsättning processer (dvs., med serum partiklar, en cellinje, möjligt förestring av kolesterol, möjlig spridning av kolesterol eller samtidiga efflux och tillströmningen processer). Dock som en fördel, fluorescens-baserade tekniker har visat sig ha hög potential som substitut för traditionella isotopmärkt tekniker och substitution av [3H]-kolesterol, av en fluorescerande-märkt molekyl att övervaka kolesterol efflux-analyser14.
Kolesterol efflux kan fungera som biomarkör för åderförkalkning23, som det korrelerar med framtida kardiovaskulära händelser24,25. En möjlighet att studera rollen av makrofager i åderförkalkning är genom renade HDLs och dess sammansättning. HDLs rening är dock en mödosam och tidskrävande process. Dessutom under rening, kan andra serum komponenter med aterogena effekt underskattas eller förlorat. Därför valdes ABDS som de lipid acceptorn. Hög genomströmning omfattning och tid minskning möjliggjordes genom att ersätta scintillationsräknare för en Plattläsare, mäta den fluorescerande signalen i samma kultur plattan (när det gäller cellen lysate) och minska protokollet med två dagar. Dessutom visar denna teknik högre känslighet när celler utsätts för olika koncentrationer av serum än de åtgärder som erhålls från en kommersialiserad kit att bedöma kolesterol efflux.
Sammanfattningsvis har en NBD-kolesterol efflux analysmetod som korrelerar med den traditionella radioaktiva metoden beskrivits. Vi fastställt den optimala tiden att ruva lipid acceptorer från mänskliga prover (serum eller plasma) i form av ABDS. Vi har optimerat den cell sådd, differentiering, dynamiskt omfång och mättnad av tekniken. När det gäller dess viktigaste nyhet, vi har optimerat en lösningsmedel kombination används i mätningar för att erhålla hög intensitet och en förbättrad linjära området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna vill deklarera att de är uppfinnare av patentansökan (EPO; 18382337.6-1118; 17 maj 2018) rätt ”metod för att bestämma kolesterol efflux” baserat på denna metod.
Acknowledgments
Detta arbete har varit delvis stöds av forskningen ger FIS (PS12/00866) från Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien. Fondo Europeo para el Desarrollo regionala (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) och CERCA programmet / Generalitat de Catalunya. Författarna tackar Retrovirology och Viral Immunopathology laboratorium av den Institut d'Investigacions Biomèdiques augusti Pi I Sunyer (IDIBAPS). Vi tackar T. Escriba, C. Rovira och C. Hurtado för deras stöd och S. Cufí kunskap och teknologi Transfer Office för henne vägledning i skydd av uppfinningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A.
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D.
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K.
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
