Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Høj overførselshastighed Nitrobenzoxadiazole-mærket Cholesterol Efflux Assay

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58891
Automatic Translation
1, 1, 1
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

Summary

Måling af in vitro-cholesterol efflux kapacitet til serum eller plasma i makrofag cell modeller er et lovende redskab som en biomarkør for åreforkalkning. I den foreliggende undersøgelse, vi optimere og standardisere en fluorescerende NBD-cholesterol efflux metode og udvikle en høj overførselshastighed analyse ved hjælp af 96-brønd plader.

Abstract

Åreforkalkning fører til hjerte-kar-sygdom (CVD). Det er stadig uklart, om kolesterol-HDL (cHDL) koncentration spiller en kausal rolle for udvikling af åreforkalkning. Men en vigtig faktor i tidlige stadier af atheroma plaque dannelse er cholesterol efflux kapacitet til HDL (HDL partikler evne til at acceptere kolesterol fra makrofager) for at undgå skum celle dannelse. Dette er et vigtigt skridt for at undgå ophobning af kolesterol i endotelet og en del af reverse kolesterol transport (RCT) at fjerne kolesterol gennem leveren. Cholesterol efflux kapacitet til serum eller plasma i makrofag cell modeller er et lovende redskab, der kan bruges som biomarkør for åreforkalkning. Traditionelt [3H]-kolesterol er blevet brugt i cholesterol efflux assays. I denne undersøgelse, vi sigter mod at udvikle en sikrere og hurtigere strategi ved hjælp af fluorescerende mærket-kolesterol (NBD-kolesterol) i en cellulær assay at spore kolesterol optagelse og efflux proces i THP-1-afledt makrofager. Endelig, vi optimere og standardisere NBD-cholesterol efflux metode og udvikle en høj overførselshastighed analyse ved hjælp af 96-brønd plader.

Introduction

Ifølge World Health Organization er de nuværende hovedårsagerne til dødsfald på verdensplan iskæmisk hjertesygdom og slagtilfælde (regnskab for i alt 15,2 millioner dødsfald)1. Begge er hjerte-kar-sygdomme (CVD), der kan indledes med åreforkalkning og ruptur af atheroma plaques i blodkar2,3.

Åreforkalkning er en fartøj væg inflammatorisk sygdom, hvor makrofager, T-celler, mastceller og dendritiske celler infiltrere endotelet og akkumulere fra blodet, til sidst danner aterosklerotiske plaques. Aterosklerotiske plaques præsentere et lipid kerne og kolesterol krystaller, fremgår af høj opløsning B-mode ultralyd målinger af carotis intima media tykkelse4,5. I makrofager udføres cholesterol efflux mod lipid acceptor partikler af middel til ATP-binding kassetten (ABC) receptorer ABCA1, ATP bindende kassette underfamilie G medlem 1 (ABCG1) og scavenger-receptor SR-BI. Ubalance i kolesterol tilstrømning og efflux i makrofager betragtes som en vigtig proces i åreforkalkning indledning6. Cholesterol efflux betragtes som et afgørende skridt i kolesterol eliminering fra perifere væv til plasma og lever i en proces kaldet reverse kolesterol transport (RCT). Kolesterol er overført fra makrofager hovedsagelig til apolipoprotein A1 (ApoA1) fundet på overfladen af high-density lipoprotein (HDL) partikler. HDLs derefter transportere cholesterol til leveren for udskillelse og genanvendelse7,8,9.

Traditionelt, har tritium (3H) radioaktivt mærket kolesterol været brugt i cholesterol efflux10. Emission signal af radioisotoper er meget følsomme10; dog præsenterer radioaktivt mærket kolesterol indlysende ulemper såsom lang protokoller, risiko for udsættelse for ioniserende stråling, og behovet for særlige radioaktivitet faciliteter og udstyr for at sikre sikker håndtering af radioaktivt udslip. Tværtimod er fluorescens blevet med held indarbejdet i diagnostiske teknikker på grund af sin enkelhed i fluorescerende signal detection, en lang række fluorophores tilgængelige, og dets sikkerhed11. Flere lysstofrør-mærket steroler har været brugt til at studere kolesterol metabolisme herunder dehydroergosterol (med iboende fluorescens), dansyl kolesterol, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - kolesterol, og 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-kolesterol). Især præsenterer NBD-kolesterol en effektiv optagelse i humane celler12. To forskellige NBD mærket-kolesterol findes i øjeblikket: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) og 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figur 1). Kolesterol mærket med 22-NBD gruppe kan bedst passer til cholesterol efflux undersøgelser, mens 25-NBD-kolesterol bruges primært i cellulære membran dynamics forskning13,14.

Cellelinjer, der typisk anvendes i in vitro-cholesterol efflux assays er monocyt-lignende celler såsom leukæmi-afledte THP-1 celler, murine Raw 264.7 celler15eller J774.1. Alle disse celler kan være differentieret til makrofager i vitro ved hjælp af phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), men THP-1-afledt makrofager (dmTHP-1) bedste afspejler og efterligne det menneskelige makrofager16.

I den foreliggende undersøgelse, vi optimere og standardisere en Fluorescerende høj overførselshastighed metode til at bestemme cholesterol efflux kapaciteten af serumprøver på dmTHP-1, ved hjælp af 22-NBD-kolesterol som et alternativ til [3H]-kolesterol. Desuden, sammenligner vi den optimerede fluorescerende teknik med den standard radioaktive analog.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For denne undersøgelse, blev etiske udvalg godkendelse (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcelona, godkendelsesnummer 2014-HCB-0756) og skriftligt, informeret samtykke fra alle fag indhentet.

1. NBD-kolesterol forberedelse

  1. Opløse NBD-kolesterol (MW 494.63; Se Tabel af materialer) i ren ethanol for at hente stock (2 mM). En 10 mg hætteglas, opløse hele hætteglas indholdet i en 10.1 mL volumen af ethanol til at opnå en 2 mM bestand.
  2. Fortynd NBD-kolesterol fra bestanden i RPMI 1640 suppleret med 10% føtal bovint serum og 5% penicillin/streptomycin (R10 medium) at nå frem til en endelig koncentration på 5 μM (f.eks., få 10 mL af NBD-kolesterol på 5 μM endelige koncentration) ved fortynding 25 μL af NBD-kolesterol stock (2 mM) i R10 medium. Denne mængde er nok til en 96-brønd plade.

2. celle kultur og såning (dag-2)

  1. Kultur THP-1 celler i R10 medium ved 37 ° C, 5% CO2. Justere til 0,3 x 106 celler/mL hver 3 dage.
  2. Frø celler i en hvid 96-brønd plade med en flad, klare bund på 0,2 x 106 celler/brønd i R10 medium (100 μl pr. brønd).
  3. Behandling af celler med 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA; fra en 10 μM bestand) for 48-72 h, inkubation ved 37 ° C, 5% CO2 til at differentiere THP-1 celler til dmTHP-1.
    Bemærk: Det anbefales at bruge 5 μl af PMA stock (10 μM) i 500 μL af R10 medium. Forud for dette, forberede en 10 μM PMA lager ved at opløse et frysetørret 1 g hætteglas i 10 mL af dimethylsulfoxid (DMSO), alikvot, og bestanden ved-20 ° C.
  4. Alternativt (forslag) kombinere trin 2.2 og 2.3 for bedre homogenisering. Forberede 10 mL af THP-1 celler i en 15 mL tube, tilføje 200 μl af PMA stock (10 μM), blandes forsigtigt og straks frø 100 μl pr. brønd på pladen. Inkuber cellerne, som beskrevet i trin 2.3.

3. Apolipoprotein B forarmet Serum (ABDS) forberedelse (dag 2 eller 3)

  1. For at forberede en polyethylenglycol (PEG) løsning, fortyndes glycin i 10% PBS (med steril H2O) til en koncentration på 200 mM på pH 7,4. Tilsættes 40 mL 200 mM glycin til 10 g af PLØK 8000 at opnå PIND 20% (w/v). Bland løsning energisk at homogenisere.
  2. Anvende 4 dele af 20% PLØK pr. 10 dele af serum/plasma på hvert serum/plasma prøve i 1,5 mL rør og lad blandingen på is til 25 min17 (f.eks. for 100 μL af plasma- eller serumprøver, tilføje 40 μL af 20% PLØK løsning).
  3. Centrifugeres PIND-apolipoprotein B bundfaldet ved 13.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
  4. Kassér bundfaldet. Overføre supernatanten til en ny tube.
    Bemærk: Vi foreslår, at forberede ABDS på dag 3 (frisk). Hvis det ikke er muligt, forberede ABDS på dag 2 og holde det ved 4 ° C natten over.

4. NBD-kolesterol celle lastning (dag 2)

  1. Kassér substratet af dmTHP-1 og cellerne vaskes to gange med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
  2. Indlæse celler med 5 μM NBD-kolesterol (100 μl pr. brønd) i R10 medium og inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2.

5. inkubering med kolesterol acceptorer (dag 3)

  1. Kassér mediet og cellerne vaskes to gange med PBS.
  2. Inkuber celler med 2-5% ABDS eller den ønskede koncentration af renset lipid acceptor (HDL, ApoA, ApoE, etc.) fortyndet i farveløs RPMI 1640 medium (100 μl pr. brønd) i 4 – 6 timer ved 37 ° C.
    Bemærk: Omfatte en negativ kontrol (C-) bestående af farveløs RPMI 1640 medium uden acceptorer og en positiv kontrol (C +) (f.eks. ABDS fra en pulje af raske donorer) eller renset HDLs. Bemærk at den positive kontrol gælder især når patientprøver (sygdomstilstande) er analyseret (tillægs figur 1).
  3. Forberede en 200 mL bestand af celle lysis løsning 1 (50 mM Tris buffer, 150 mM NaCl, H2O). Bland celle lysis løsning 1 på 1:1 (v: v) forholdet med ren ethanol at opnå lysis løsning 2.

6. fluorescerende Signal Capture (dag 3)

  1. Media NBD-kolesterol påvisning
    1. Fjerne celle medium fra pladerne og samle det i en ny hvid 96-brønd plade med en uigennemsigtig flade bund.
    2. For en optimal fluorescens signal detektion i medier prøver, Tilsæt 100 μL af ren ethanol til 100 μL af hver medium prøve at opnå en 1:1 ratio i 96-brønd hvid plade.
    3. Holde pladen med de behandlede medier til yderligere foranstaltning fluorescens intensitet (FI) på en 463⁄536 nm (excitation/emission) bølgelængde i luminometrisk.
  2. Intracellulære NBD-kolesterol påvisning
    1. Cellerne vaskes to gange med PBS.
    2. For at opnå den intracellulære cholesterol, lyse celler ved at inkubere dem med 100 μL af lysis løsning 2 pr. brønd og ryste pladen ved stuetemperatur (RT) i 25 min.
    3. For en optimal fluorescens signal detektion i celle lysate prøver, fange fluorescens-intensiteten af cellelysater i det samme hvide 96-brønd plade med klare flad bund (den samme plade som celler var seedede i trin 2.2).
  3. 6.3 måle fluorescens intensitet (FI) i luminometrisk mens du justerer følsomheden parameter til 50 i softwaren (Se Tabel af materialer).

7. resultater analyse

  1. Express cholesterol efflux sats af en prøve i procent beregnes efter følgende formel:
    Equation
  2. Opnå den endelige foranstaltning af cholesterol efflux (CE) ved at fratrække CE af den negative kontrol (sample fyldt med NBD-kolesterol men inkuberes med farveløs RPMI 1640 medium, uden kolesterol acceptorer) fra CE af et givet prøver:
    Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cholesterol efflux assayet sigter mod at bestemme i vitro cholesterol efflux kapacitet på en given serum, plasma eller supernatanten indeholdende HDL partikler. Metoden består af Ilægning af mærket cholesterol i en kultur af en standard makrofag cellelinie og overtalelse kontakt med test prøven fortyndes i FBS-gratis medier med celler. Endelig, de fluorescerende niveauer fra NBD måles i medier og celle lysate. For at optimere målinger, blandes effluxed kolesterol fra cellerne til medierne med et volumen af et opløsningsmiddel, der indeholder ethanol. NBD-kolesterol tilbage i cellerne er genopslemmes i et opløsningsmiddel, der indeholder ethanol eller vaskemiddel før målinger. Endelig bestemmes forholdet mellem effluxed/total mærket-kolesterol. Hvis du vil konfigurere teknikken, blev apolipoprotein B-forarmet serum (ABDS) fra en pulje af raske donorer brugt.

De bedste fortynding betingelser for NBD-kolesterol i både mellemstore og ethanol blev undersøgt. Vi har testet gratis NBD-kolesterol fluorescerende adfærd i flere opløsningsmiddel miljøer, herunder forskellige nøgletal for ethanol og farveløs RPMI 1640. Fluorescens-intensiteten (FI) af NBD-kolesterol fortyndet i den vandige opløsning viste de laveste FI værdier, mens NBD-kolesterol inden for ren ethanol udsendes den højeste FI. Dette tyder på, at fluorescens emission af 22-NBD-kolesterol molekyle er stærkt afhængige af det medium, hvori det er indeholdt. I overensstemmelse hermed, fluorescens signalet fra 22-NBD-kolesterol er betydeligt højere, når de placeres i en ethanol indeholdende medier. Vi bemærkede, at i forholdet 1:1 medier: ethanol, fluorescens intensitet signal stiger proportionalt med koncentrationen af kolesterol analog i intervallet 0,5-50 μm, tyder på en passende opførsel af sonden i dette tilfælde (figur 2 ). Den lineære opførsel i 1:1 tilstand (media: ethanol) er repræsenteret ved følgende ligning: y = 20.88 x + 146.7 med R2 = 0.9341.

Et vigtigt skridt i denne metode er den tid inkubere indlæst cellerne med kolesterol acceptorer så kolesterol er i stand til efflux. For at bestemme den påkrævede inkubationstiden, blev celle medier høstet på forskellige timepoints (1 til 24 h; Figur 3). Cholesterol efflux i området fra 0 til 6 h udviklet sig lineært (p < 0,0001; y = 18.2 x + 127.3) i en tidsafhængig måde. Den maksimale signal fanget var på 6 h efter ABDS blev tilføjet til cellerne. Efter 6 h, kolesterol mistede regelmæssighed i efflux, så variabilitet øges efter 6 h inkubation med ABDS (figur 3).

Vi har desuden testet mætning tærskel og dynamikområde som anvendes til menneskelige ABDS ved at måle CE på forskellige procentdele af HDL-holdige medier (ABDS). NBD-cholesterol efflux i høj overførselshastighed assay (96-brønd plade) udviklet sig lineært inden for 1 – 7% ABDS, hvor FI steg i en koncentration-afhængige måde med ABDS, at nå toppen af cholesterol efflux kapacitet på 7% ABDS (figur 4). Ved koncentrationer højere end 7% faldt FI i et omvendt forhold med ABDS procent. Dette kan skyldes kolesterol genindtaste celler fra NBD-kolesterol indlæst HDL stede i medierne.

Standardmetode til måling af cholesterol efflux bruger radio-mærket (3H) kolesterol16. For at evaluere effektiviteten af vores fluorescens-baserede metode, vi udførte og sammenlignet både fluorescerende og radio-mærket teknikker. Vi fandt, at den traditionelle radioaktivitet teknik og vores NBD-kolesterol metode var stærkt korreleret (Pearson's r = 0.97; p < 0,001) ved hjælp af forskellige koncentrationer af ABDS (1-8%; Figur 5). Alt tyder dette på, at vores fluorescerende metode kan være en sikrere erstatning end den radioaktive teknik.

Endelig, vi sammenlignet vores metode til fluorescerende sonde forskellige fra NBD. Vi sammenlignet vores metode til en kommerciel høj overførselshastighed cellebaserede assay kit har til formål at bestemme cholesterol efflux i celler (cholesterol efflux assay kit, celle-baserede). Metoden udviklet i vores gruppe var følsomme over for en stigning af acceptoren koncentration (% ABDS) inden for CE værdier mellem 5 og 15%. Men den kommercielle kit, udført efter producentens anvisninger, resulterede i CE foranstaltninger under 5% langs vifte ABDS analyseres; således, den deraf følgende CE var stort set upåvirket, da ABDS blev øget (figur 6).

Figure 1
Figur 1: molekylære strukturer i naturlige kolesterol (A), 22-NBD-kolesterol (B) og 25-NBD-kolesterol (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: NBD-kolesterol fluorescens intensitet (FI) med forskellige nøgletal for ethanol og farveløs RPMI 1640 medium. NBD-kolesterol blev fortyndet 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 og 0:1 ethanol: vandigt medium nøgletal på NBD-kolesterol koncentrationer mellem 0.5 og 50 µM. FI signal blev opdaget af en luminometrisk med følsomhed parameteren sat til 70 i fluorimeter software. FI-signal i media og celle lysate blev målt ved hjælp af hvid 96-brønd plader. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: tid-progression NBD-cholesterol efflux i THP-1-afledt makrofager. DmTHP-1 var lastet med 5 µM NBD-kolesterol og inkuberes med 5% ABDS. Cell media blev målt i en hvid 96-brønd plade på forskellige timepoints (1-24 h). Værdierne, der præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelsen for forsøgsbetingelse brønde. FI signal blev opdaget af en luminometrisk med følsomhed parameteren sat til 70 i fluorimeter software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: NBD-cholesterol efflux i THP-1-afledt makrofager i 96-brønd plade med forskellige koncentrationer af ABDS. DmTHP-1 celler blev behandlet med 5 µM NBD-kolesterol, inkuberes med forskellige procentdele af ABDS og mængden med ethanol. FI-signal i media og celle lysate blev målt ved hjælp af en hvid 96-brønd plade i fluorimeter på 1:1 (ethanol: lysis løsning 1). Foranstaltninger af negative kontroller (ABDS ubehandlet media) blev trukket på de niveauer, der er fastsat. Værdierne, der præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse af tredobbelt brønde. FI signal blev opdaget af en luminometrisk med følsomhed parameteren sat til 50 i fluorimeter software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Korrelation af NBD-cholesterol og [3H]-cholesterol efflux i THP-1-afledt makrofager. Følgende dmTHP-1 med den tilsvarende mærket-kolesterol til 6 h. Cholesterol efflux blev målt ved hjælp af 1-8% ABDS. For NBD-kolesterol prøver, blev den fluorescerende signal fundet ved hjælp af hvid 96-brønd plader i fluorimeter på 1:1 ethanol: lysis løsning 1. FI signal blev opdaget af en luminometrisk med følsomhed parameteren sat til 50 i fluorimeter software. For [3H]-kolesterol prøver, radioaktive signalet blev fundet ved hjælp af 100 µL af medium og celle lysate blandet med scintillation cocktail og rød i tælleren scintillation, efter protokollen beskrevet af lav et al.17. Korrelation effektivitet blev bestemt ved hjælp af Pearson's r korrelationskoefficienten. Foranstaltninger af negative kontroller (ABDS ubehandlet media) blev trukket fra både fluorescens og radioaktive niveauer forudsat. Værdierne, der præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse af tredobbelt brønde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: sammenligning mellem høj overførselshastighed NBD-cholesterol efflux assay og en kommercialiseret cellebaserede fluorescenstest kit. Cholesterol efflux fra ABDS blev vurderet efter den beskrevne protokol, bruger som lysering opløsningsmidler ethanol (50%) eller Tween 80 (1%). Celle-baserede fluorescenstest kit blev vurderet efter producentens protokol i sættet. Værdierne, der præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse af tredobbelt brønde. FI signal blev opdaget af en luminometrisk med følsomhed parameteren sat til 50 i fluorimeter software venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: arbejdsprocesdiagram. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 1
Tillægs figur 1: NBD-cholesterol efflux af serumprøver fra HIV-inficerede patienter og standard positiv kontrol (C +). Den indbyrdes individuel variation af NBD-cholesterol efflux metode anvendes et sæt af HIV-smittede patienter er vist. En positiv intern kontrol (C +) repræsenterer de NBD-cholesterol efflux fra en pulje af sera prøver af 8 raske patienter. Fejllinjer Vis standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lysstofrør-mærket kolesterol er en lovende strategi for at analysere og undersøge de egenskaber og metabolisme af naturlige kolesterol in vitro. Dens vigtigste fordele er at det kan tages op af celler, giver mulighed for intracellulære og membran distribution undersøgelser, og kan anvendes på cholesterol efflux assays som i denne protokol (figur 7). Nogle fluorescerende-mærket steroler tillade kolesterol sporing af in vitro-herunder BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol og 22 - og 25-NBD-kolesterol12. Især, er 22-NBD-kolesterol passende for at studere cholesterol dynamics med forskellige celletyper og som en erstatning af radio-mærket kolesterol18. Der er ingen konsensus metode til at evaluere de fluorescerende signal i en cholesterol efflux assay. Sang et al.14 høstet medium og celle lysates til at måle FI separat; Liu et al.14 overført medium til andre plader, og den intracellulære fluorescerende signal blev målt direkte i kultur plade; og Zhang et al.15 anvendes en lysisbuffer til lyse celler, efterfulgt af rensning af fluorescerende kolesterol til at fortynde det i ren ethanol og påvise fluorescens intensitet signal19. I vores cholesterol efflux assay, brug af den samme endelige opløsningsmiddel sammensætning i medier og celler tilladt homogenisering af celle medier og målinger af lysate effektivt.

Den nuværende undersøgelse profileret NBD-cholesterol efflux over tid og fundet en tidsafhængig progression indtil 6 h inkubation med acceptor ABDS, svarende til sangen et al.14 og Liu et al.14 og i modsætning til Zhang et al. der brugte en 1 h inkubationstiden med lipid acceptorer19. Vi fandt, at efter 6 h inkubation, effluxed kolesterol mistet linearitet; Det er derfor afgørende ikke at overstige 6 h. Vores optimale sortiment af cholesterol efflux var mellem 3-6 h efter tilføjer acceptorer. Vi foreslår, at inkubere celler for 4 h med kolesterol acceptorer. Yderligere kritisk trin er brugen af farveløs medierne til at anvende acceptorer for at undgå baggrund, såning en semi-sammenflydende celle kultur lag, og at sikre en korrekt overholdelse af dem på pladen. Det skal bemærkes, at den hvide plade klare bund er nyttigt at følge celler under en invers lysmikroskop.

De fleste cholesterol efflux assays udføres ved hjælp af renset lipid acceptorer i cholesterol efflux test. Den nuværende teknik blev udviklet for at opnå cholesterol efflux kapaciteten fra humane serum- eller plasmaprøver. Vi bruger de iboende kolesterol acceptorer i serum, men det er afgørende for at fjerne de partikler, der indeholder apolipoprotein B, som ville recirkulerer kolesterol molekyler inde i celler20,21. Som ændringer, renset ApoAI og HDL kan også bruges som acceptorer. Også, cellelinjer end menneskelige THP-1 held har været anvendt i fluorescerende cholesterol efflux assays, såsom Raw 264.7 eller J774A1 makrofager og ville således sandsynligvis arbejde i vores metode15,22.

De vigtigste begrænsninger af denne metode er, at resultater afhænger af den specifikke cellelinie, en standard cellelinie men celle-fri metode ville være en fordel at bruge som en biomarkør. Også, de sera, der bruges til at standardisere denne metode var frosset; NBD gruppe på kolesterol er mindre fysiologiske end den radio-mærket, og dens udbredelse er forskellig fra den endogene kolesterol; og vi testede det endelige resultat af et sæt af processer (dvs., der involverer serum partikler, en cellelinje, muligt esterificering af kolesterol, mulige udbredelse af kolesterol eller samtidige efflux og tilstrømning processer). Imidlertid som en fordel, fluorescens-baserede teknikker har vist for at have stort potentiale som erstatninger for traditionelle radio-mærket teknikker og substitution af [3H]-kolesterol, af et fluorescerende-mærkede molekyle til at overvåge cholesterol efflux-undersøgelser,14.

Cholesterol efflux kan fungere som biomarkør for åreforkalkning23, som det korrelerer med fremtidige hjertekarsygdom24,25. En mulighed for at studere rollen af makrofager i åreforkalkning er gennem renset HDLs og sammensætning; HDLs rensning er imidlertid en vanskelig og tidskrævende proces. Desuden under rensningen, andre serum komponenter med atherogene virkning kan være undervurderet eller mistet. Derfor blev ABDS valgt som lipid acceptor. Høj overførselshastighed skala og tid reduktion blev muliggjort ved at erstatte tælleren scintillation en Pladelæser, måling af fluorescerende signal i den samme kultur plade (i tilfælde af cellen lysate) og reducere protokollen af to dage. Desuden, denne teknik viser højere følsomhed, når cellerne er udsat for forskellige koncentrationer af serum end de foranstaltninger, der er fremstillet af en kommercialiseret kit til at vurdere cholesterol efflux.

Afslutningsvis er en NBD-cholesterol efflux assay, der korrelerer med den traditionelle radioaktive metode blevet beskrevet. Vi fast besluttet på det optimale tidspunkt at udruge lipid acceptorer fra menneskelige prøver (serum eller plasma) i form af ABDS. Vi optimeret den celle såning, differentiering, dynamikområde og mætningspunkt af teknikken. Med hensyn til sine vigtigste nyhed optimeret vi opløsningsmiddel kombinationer anvendes i målinger for at opnå høje intensiteter og en forbedret lineære område.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ønsker at erklære, at de er opfinderne af patentansøgning (EPO; 18382337.6-1118, 17 maj 2018) med titlen "Metode til bestemmelse af cholesterol efflux" baseret på denne metode.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet delvist understøttet af forskningen tilskud FIS (PS12/00866) fra Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien; Fondo Europeo para el Desarrollo regionale (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) og CERCA program / Generalitat de Catalunya. Forfatterne takke Retrovirology og Viral Immunopathology laboratorium af Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Vi takker T. Escribà, C. Rovira og C. Hurtado for deres bistand og S. Cufí fra viden og Technology Transfer Office for hendes vejledning i beskyttelse af opfindelsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well collecting plate Corning Inc Costar 3912 white 96-well plate with opaque clear bottom
96-well culture plate Corning Inc Costar 3610 white 96-well plate with flat clear bottom
Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) Abcam ab196985 commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux
colorless RPMI 1640 Sigma-Aldrich R7509 RPMI 1640 with no pehnol-red
Gen5 Data Analysis Software BioTek Version 2.0
Glycine Sigma-Aldrich G8790-100G Glycine, non-animal use
Luminometer Biotek SYNERGY HT Multi-Detection Microplate Reader
Lysis Solution 1 in-house 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O
Lysis Solution 2 in-house Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)
NBD-cholesterol Thermo-Fisher N1148 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol
PBS Sigma-Aldrich P3813 Phosphate-buffered saline
PEG 8000 Sigma-Aldrich 202452-250G polyethylene glycol
PMA Sigma-Aldrich 79346 Phorbol 12-merystate B-acetate.
R10 in-house RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin.
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758 RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose
THP-1 cells Sigma-Aldrich ATCC, #TIB-202 monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
  2. Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
  3. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
  4. Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
  5. Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
  6. Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
  7. Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
  8. Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
  9. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
  10. Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
  11. Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
  12. Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
  13. Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
  14. Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
  15. Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
  16. Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
  17. Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
  18. Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
  19. Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
  20. Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
  21. Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
  22. Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
  23. Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
  24. Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
  25. Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).

Tags

Medicin spørgsmål 143 NBD-kolesterol makrofag HDL cholesterol efflux fluorescens apolipoprotein B-forarmet serum åreforkalkning reverse kolesterol transport
Høj overførselshastighed Nitrobenzoxadiazole-mærket Cholesterol Efflux Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pastor-Ibáñez, R., Arnedo, … More

Pastor-Ibáñez, R., Arnedo, M., Tort, O. High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay. J. Vis. Exp. (143), e58891, doi:10.3791/58891 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter