Summary
Измерение холестерина в пробирке измеряем способность сыворотки или плазмы в макрофагов ячейки модели является перспективным средством как биомаркер для атеросклероза. В настоящем исследовании мы оптимизации и стандартизировать флуоресцентный метод измеряем NBD-холестерина и высок объём анализа с помощью 96-луночных пластины.
Abstract
Атеросклероз приводит к сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). До сих пор неясно, является ли концентрации холестерина ЛПВП (cHDL) играет причинную роль в развитии атеросклероза. Однако, важным фактором в ранних стадиях формирования атеромы доска является способности измеряем холестерина ЛПВП (способность HDL частиц принять холестерина из макрофагов) для того, чтобы избежать образование клеток пены. Это ключевой шаг в избегая накопление холестерина в эндотелия и частью обратного холестерина транспорта (РКИ), чтобы устранить холестерина через печень. Холестерин измеряем способность сыворотки или плазмы в макрофагов ячейки модели является многообещающим инструментом, который может использоваться в качестве биомаркеров для атеросклероза. Традиционно [3H]-холестерина был использован в холестерин измеряем анализов. В этом исследовании мы стремимся разработать стратегию безопаснее и быстрее, с использованием флуоресцентных помечены холестерина (NBD-холестерин) в клеточном assay проследить процесс поглощения и измеряем холестерина в THP-1-производные макрофагов. Наконец мы оптимизации и стандартизировать метод измеряем NBD-холестерина и высок объём анализа с помощью 96-луночных пластины.
Introduction
По данным Всемирной организации здравоохранения текущий главных причин смерти во всем мире являются ишемическая болезнь сердца и инсульта (приходится в общей сложности 15,2 миллиона смертей)1. Оба являются сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), которые могут предшествовать атеросклероза и разрыв атеромы бляшки в сосудах2,3.
Атеросклероз является судно стены воспалительное заболевание в котором макрофагов, Т-клетки, тучные клетки и дендритных клеток проникнуть эндотелия и накапливаются в крови, в конечном итоге формирование атеросклеротических бляшек. Атеросклеротические бляшки представляют липидного ядра и холестерина кристаллы, подтверждается разрешением измерения B-режим УЗИ сонных интима медиа толщина4,5. В макрофагах холестерин измеряем сторону липидов акцептора частиц осуществляется средствами СПС привязки кассеты (ABC) рецепторов ABCA1, АТФ привязки кассеты член subfamily G 1 (ABCG1), и мусорщик рецептор SR-Би. Дисбаланс приток холестерина и измеряем в макрофагах считается ключевой процесс атеросклероза инициации6. Холестерин измеряем считается ключевым шагом в ликвидации холестерина от периферических тканей к плазме крови и печени в процессе, называемом обратный холестерина транспорта (РКИ). Холестерин переносится из макрофагов, главным образом для Аполипопротеин А1 (ApoA1) на поверхности частиц липопротеидов высокой плотности (ЛПВП). HDL затем транспорт холестерина в печени для выведения и повторного использования7,8,9.
Традиционно тритий (3H) цианокобаламина, меченного холестерин используется в холестерин измеряем10. Сигнал выбросов радиоизотопов является весьма деликатным10; Однако цианокобаламина, меченного холестерин представляет очевидные недостатки как долго протоколы, риска воздействия ионизирующего излучения и потребность в специальных радиоактивности объектов и оборудования для обеспечения безопасной обработки радиоактивных выбросов. Напротив флуоресценции была успешно включена в методы диагностики благодаря своей простоте в флуоресцентного сигнала, широкий спектр доступных флуорофоров и ее безопасности11. Несколько флуоресцентные, меченного стерины были использованы для изучения метаболизма холестерина включая dehydroergosterol (с внутренней флуоресценции), Дансил холестерина, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - холестерин и 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-холестерин). В частности НБД холестерин представляет эффективное усвоение в клетки человека12. В настоящее время имеются два различных NBD помечены холестерин: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) и 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-НБД; Рисунок 1). Холестерин, помечены 22-NBD остаток может лучше всего подходят для исследования измеряем холестерина, в то время как 25-NBD-холестерин используется главным образом в клеточной мембраны динамика исследований13,14.
Линии клетки обычно используется в пробирке холестерина измеряем анализов являются Моноцит подобных клеток, таких как клетки человека лейкоз производные THP-1, мышиных Raw 264.7 клетки15или J774.1. Все эти клетки могут быть дифференцированы в макрофагов в пробирке с использованием phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA), но THP-1-производные макрофагов (dmTHP-1) лучший отражают и имитировать человека макрофаги16.
В настоящем исследовании, мы оптимизации и стандартизировать флуоресцентный метод высокой пропускной способностью для определения способности измеряем холестерина сыворотки образцов на dmTHP-1, используя 22-NBD-холестерина в качестве альтернативы [3H]-холестерина. Кроме того мы сравниваем оптимизированный флуоресцентные технику с стандартного аналогового радиоактивных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для этого исследования были получены утверждения этического Комитета (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, больницы, Барселона; номер утверждения ГХБ/2014/0756) и письменного информированного согласия от всех субъектов.
1. NBD-холестерин подготовка
- Растворите NBD-холестерина (494.63 МВт; см. Таблицу материалы) в чисто этанола для получения акций (2 мм). Для 10 мг флакон растворяют содержимое весь флакон в объеме 10.1 мл этанола для получения запас 2 мм.
- Разбавить NBD-холестерин из запасов в RPMI 1640 с 10% плода говядину сыворотки и 5% пенициллина/стрептомицина (средний R10) до конечной концентрации 5 мкм (например, получить 10 мл NBD-холестерина в конечной концентрации 5 мкм), Разбавление 25 мкл акций NBD-холестерина (2 мм) в среде R10. Этот объем является достаточным для 96-луночных пластины.
2. клетки культуры и заполнения (день-2)
- Культура клетки THP-1 в среде R10 при 37 ° C, 5% CO2. Приспособиться к 0,3 x 106 клеток/мл каждые 3 дня.
- Заполнение ячеек в белой 96-луночных плита с плоской, четкое дно на 0,2 х 106 клеток/колодец в среде R10 (100 мкл на хорошо).
- Лечить клетки с 100 Нм phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA; от 10 мкм запас) для 48-72 ч инкубации при 37 ° C, 5% CO2 дифференцировать THP-1 клеток в dmTHP-1.
Примечание: Рекомендуется использовать 5 мкл PMA акций (10 мкм) в 500 мкл R10 среды. До этого подготовьте 10 мкм PMA запасов путем растворения лиофилизированные 1 g флакон 10 мл диметилсульфоксида (ДМСО), аликвота и запасов при-20 ° C. - В качестве альтернативы (предложение) объединить шаги 2.2 и 2.3 для лучшего гомогенизации. Подготовка 10 мл THP-1 клеток в 15 мл, добавить 200 мкл PMA акций (10 мкм), осторожно перемешать и сразу же семян 100 мкл в колодец на пластину. Инкубируйте клетки, как описано в шаге 2.3.
3. аполипопротеина B обедненный сыворотки (ABDS) подготовка (день 2 или 3)
- Подготовить раствор полиэтиленгликоля (PEG), разбавляют Глицин в PBS 10% (с стерильных H2O) к концентрации 200 мм на рН 7,4. Добавление 10 g PEG 8000 для получения ПЭГ 40 мл 200 мм глицин 20% (w/v). Mix решение энергично для гомогенизации.
- Применить 4 частей 20% КОЛЫШЕК на 10 частей сыворотки/плазмы на каждом образце сыворотки/плазмы в 1,5 мл трубку и оставить смесь на льду 25 мин17 (например, 100 мкл плазмы или сыворотки, добавить 40 мкл 20% PEG решение).
- Центрифуга PEG-аполипопротеина B осадок на 13 000 x g 15 мин при 4 ° C.
- Слейте осадок. Супернатант передать новой трубки.
Примечание: Мы предлагаем подготовку ABDS на день 3 (свежие). Если это не возможно, подготовить ABDS на 2 день и держать его при температуре 4 ° C на ночь.
4. NBD-холестерин клеток загрузки (день 2)
- Отказаться от культуры среднего dmTHP-1 и вымыть клетки дважды с 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
- Тензометрические силоизмерители с 5 мкм NBD-холестерина (100 мкл на хорошо) в среде R10 и инкубировать на ночь при 37 ° C, 5% CO2.
5. инкубации с акцепторами холестерина (день 3)
- Отказаться от среднего и вымыть клетки дважды с PBS.
- Инкубировать клетки с 2-5% ABDS или желаемого концентрация акцепторной очищенный липидов (HDL, АПД, ароЕ и т.д.) разводят в бесцветных RPMI 1640 среднего (100 мкл на хорошо) для 4-6 ч при 37 ° C.
Примечание: Включить отрицательный контроль (C-) состоящий из бесцветных RPMI 1640 среды без позитивного управления (C +) (например, ABDS из числа здоровых доноров) или очищенного HDL и акцепторов. Обратите внимание что положительный контроль применяется, особенно когда пациент образцы (болезнь условия), анализ (дополнительный рис. 1). - Подготовьте запас 200 мл раствора лизис клетки 1 (буфер Tris 50 мм, 150 мм NaCl, H2O). Смешайте раствор 1 на 1:1 (v: v) соотношение лизис клеток с чистого этанола для получения лизис решения 2.
6. флуоресцентного сигнала захвата (день 3)
-
Обнаружение средств массовой информации NBD-холестерин
- Удалите средство клеток из пластин и собирают его в новой белой 96-луночных плита с непрозрачной плоским дном.
- Для оптимального флуоресценции обнаружения сигнала в образцах СМИ добавьте 100 мкл чистого этанола в 100 мкл каждого среднего образца, чтобы получить в соотношении 1:1 в 96-луночных белые пластины.
- Держите пластины с обработанной СМИ дальнейшие меры интенсивности флуоресценции (FI) на длине волны 463⁄536 Нм (возбуждение/излучение) в люминометра.
-
Внутриклеточные NBD-холестерин обнаружение
- Вымойте клетки дважды с PBS.
- Для получения внутриклеточных холестерина, Лизируйте клетки путем инкубации их с 100 мкл раствора 2 лизиса на колодец и встряхнуть пластины при комнатной температуре (RT) 25 мин.
- Для оптимального флуоресценции обнаружения сигнала в образцах lysate клетки, захват интенсивности флуоресценции lysates клетки в том же белый 96-луночных пластины с четкой плоский снизу (же пластины, в котором клетки были посеяны в шаге 2.2).
- 6.3 измеряют интенсивность флуоресценции (FI) в Люминометр при настройке параметра чувствительность до 50 в программном обеспечении (см. Таблицу материалы).
7. результаты анализа
- Уровень холестерина измеряем образца выражают в процентах рассчитывается по следующей формуле:
- Получить окончательные меры измеряем холестерина (CE) путем вычитания CE отрицательного контроля (образец загружен с НБД холестерин, но инкубировали с бесцветными RPMI 1640 средний, без холестерина акцепторов) от CE из образцов с учетом:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель анализа измеряем холестерина необходимо определить в vitro измеряем потенциала данного сыворотка, плазма или супернатанта, содержащей частицы HDL холестерина. Этот метод состоит из загрузки обозначены холестерина в культуру клеточной линии стандартного макрофагов и вызывая контакт с тестирования образца, разбавляют в FBS-свободных СМИ с клетками. Наконец флуоресцентный уровней от НБД измеряются в средствах массовой информации и lysate. Для оптимизации измерений, effluxed холестерина от клеток к средствам массовой информации смешивается с одной объем растворителя, содержащие этанол. НБД холестерин, оставаясь в клетках высокомобильна в растворитель, содержащих этанол или моющего средства до измерения. Наконец определяется соотношение effluxed/всего маркировку холестерина. Чтобы настроить метод, был использован аполипопротеина B обедненный сыворотки (ABDS) из числа здоровых доноров.
Были исследованы самые лучшие условия разрежения для NBD-холестерина как среднего, так и этанола. Мы протестировали флуоресцентные поведение бесплатно NBD-холестерина в нескольких растворителей средах, включая различные соотношения этанола и бесцветный RPMI 1640. Интенсивность флуоресценции (FI) NBD-холестерина разбавляют в водном растворе показали низкие значения FI, хотя NBD-холестерина в рамках чистого этанола излучаемого высокий Интернет. Это свидетельствует о том, что флуоресценции выбросов 22-NBD-холестерол молекула сильно зависит от среды, в которой он содержится. Соответственно сигнал флуоресценции 22-NBD-холестерина значительно выше, помещенный в этаноле, содержащий средства массовой информации. Мы отметили, что в соотношении 1:1 СМИ: этанол, сигнал интенсивности флуоресценции увеличивается пропорционально концентрации холестерина аналоговый в диапазоне 0,5-50 мкм, предложив в этом случае соответствующее поведение зонда (Рисунок 2 ). Линейное поведение в состоянии 1:1 (СМИ: этанол) является уравнением следовать: y = 20.88 x + 146,7 с R2 = 0.9341.
Ключевым шагом в этом методе является время, затрачиваемое инкубации загруженного клетки с акцепторами холестерина, так что холестерин может измеряем. Чтобы определить время необходимые инкубации, ячейки СМИ было собрано в разных timepoints (1-24 ч; Рисунок 3). Измеряем холестерина в диапазоне от 0 до 6 ч развивается линейно (p < 0,0001; y = 18,2 х + 127.3) в зависимости от времени. Максимальный сигнал захватили был в 6 ч после ABDS была добавлена к клеткам. После 6 часов холестерин потерял регулярность измеряем, поэтому изменчивость увеличилось после 6 ч инкубации с ABDS (рис. 3).
Мы дополнительно проверили порог насыщения и динамический диапазон применительно к человеческой ABDS, измеряя CE на разных процентных показателей HDL-содержащих СМИ (ABDS). Измеряем NBD-холестерина в assay высокой пропускной способности (96-луночных Латы) линейно развивались в течение 1-7% ABDS, где FI увеличено в зависимости от концентрации с ABDS, достигая пика потенциала измеряем холестерина на 7% ABDS (рис. 4). В концентрациях выше, чем 7% FI уменьшилась в обратная связь с ABDS процент. Это может быть вызвано потому что переподключения холестерин что клетки от НБД холестерин загружен HDL в средствах массовой информации.
Стандартный метод для измерения холестерина измеряем использует радио меченых (3H) холестерина16. Для оценки эффективности нашего метода на основе флуоресценции, мы выступали и сравнении флуоресцентные и радио меченых методов. Мы обнаружили, что техника традиционной радиоактивности и наш метод NBD-холестерина высокой коррелировали (Пирсона r = 0,97; p < 0,001) с использованием различных концентраций ABDS (1 – 8%; Рисунок 5). В целом это предполагает, что наш флуоресцентный метод может быть заменителя безопаснее чем радиоактивных техника.
Наконец мы сравнили наш метод флуоресцентного зонда отличаются от НБД. Мы сравнили наш метод для коммерческих высокой пропускной способностью на основе ячеек пробирного комплект, направленных для определения холестерина измеряем в клетках (комплект пробирного измеряем холестерина; на основе ячеек). Метод, разработанный в нашей группе был чувствителен к повышению концентрации акцептора (% ABDS) в пределах CE значения между 5 и 15%. Однако коммерческих комплект, выполненных следуя инструкциям производителя, привели к CE мер ниже 5% вдоль диапазона ABDS assayed; Таким образом, результирующая CE была по существу неизменным когда ABDS был увеличен (рис. 6).
Рисунок 1: молекулярные структуры природных холестерина (A), 22-NBD-холестерина (B) и 25-NBD-холестерина (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: интенсивности флуоресценции NBD-холестерина (FI) с различных соотношениях этанола и бесцветный RPMI 1640 среднего. НБД холестерина было разводят в 1:0 и 3:1, 1:1, 1:3, 0:1 этанола: водный среднего соотношения в концентрациях NBD-холестерин от 0,5 до 50 мкм. FI сигнал был обнаружен Люминометр с параметром чувствительности на 70 fluorimeter программного обеспечения. FI сигнала СМИ и lysate была измерена с помощью белого 96-луночных пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: измеряем время прогрессии NBD-холестерина в THP-1-производные макрофагов. DmTHP-1 были загружены с 5 мкм NBD-холестерина и инкубировали с 5% ABDS. Ячейки СМИ были измерены в белом фоне 96-луночных на разных timepoints (1 – 24 ч). Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение quadruplicate скважин. FI сигнал был обнаружен Люминометр с параметром чувствительности на 70 fluorimeter программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: измеряем NBD-холестерина в THP-1-производные макрофагов в 96-луночных пластины с различной концентрации ABDS. DmTHP-1 клетки обрабатывали 5 мкм NBD-холестерин, инкубировали с различными процент ABDS и анализироваться с этанолом. FI сигнала СМИ и lysate была измерена с помощью белого плиту 96-луночных в fluorimeter 1:1 (раствор 1 этанола: lysis). На уровнях предусмотрено были вычтены меры негативный контроль (ABDS неочищенных средств массовой информации). Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение тройные скважин. FI сигнал был обнаружен Люминометр с параметром чувствительности в 50 в fluorimeter программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Корреляция NBD-холестерина и [3H]-измеряем холестерина в макрофагах, производные THP-1. После dmTHP-1 с соответствующей маркировкой холестерина за 6 ч. Измеряем холестерина была измерена с помощью ABDS 1-8%. Для образцов NBD-холестерин флуоресцентные сигнал был обнаружен с помощью белого 96-луночных пластин в fluorimeter 1:1 этанола: лизис решения 1. FI сигнал был обнаружен Люминометр с параметром чувствительности в 50 в fluorimeter программного обеспечения. Для [3H]-образцы холестерина, радиоактивных сигнал был обнаружен с помощью 100 мкл среднего и клеточной lysate смешивается с сцинтилляционным коктейль и красный в сцинтилляционных счетчиков, после протокол, характеризуется низким et al.17. Взаимосвязь эффективности было определено с помощью коэффициента корреляции Пирсона r. Меры негативный контроль (ABDS необработанных СМИ) были вычитается из флуоресценции и радиоактивных уровней, предоставляемых. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение тройные скважин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: сравнение между высок объём NBD-холестерин измеряем пробирного и набор коммерциализированной флуоресцентные на основе ячеек пробирного. Измеряем холестерина из ABDS оценивали после описанных протокола, используя в качестве лизис растворителем этанола (50%) или анимации 80 (1%). Флуоресцентный на основе ячеек пробирного комплект оценивалась по данным производителя протокол в комплекте. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение тройные скважин. FI сигнал был обнаружен Люминометр с параметром чувствительности в 50 в программное обеспечение fluorimeter пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: схема рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный рисунок 1: NBD-холестерин измеряем образцов сыворотки от ВИЧ инфицированных пациентов и стандартный положительный контроль (C +). Отображается между индивидуальной вариативности метода измеряем NBD-холестерин, применяемую к набору ВИЧ инфицированных пациентов. Позитивные внутреннего контроля (C +) представляет измеряем де NBD-холестерин из пула образцов сывороток 8 здоровых пациентов. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Флуоресцентные, меченного холестерин является перспективной стратегией для анализа и изучения свойств и метаболизма природных холестерина в пробирке. Его основными преимуществами являются, что он может быть take up клетки, позволяет для внутриклеточного и мембраны исследования распределения и может быть применен к холестерина измеряем анализы как этот протокол (рис. 7). Некоторые люминесцентные, меченного стерины позволяют холестерина отслеживания в пробирке, включая BODIPY-холестерин, Дансил холестерин, dehydroegrosterol и 22 - и 25-NBD-холестерина12. В частности 22-NBD-холестерин подходит для изучения динамики холестерина с различных типов клеток и как замену радио меченых холестерина18. Существует без консенсуса метод для оценки флуоресцентного сигнала в assay измеряем холестерина. Песня et al.14 собирают среднего и клеток лизатов измерить FI отдельно; Лю et al.14 средних переданы другие плиты, и внутриклеточных флуоресцентного сигнала измерялась непосредственно на пластину культуры; и Zhang et al.15 буфера lysis Лизируйте клетки, следуют очистки флуоресцентные холестерина развести его в чистый этанол и обнаружения сигнала интенсивности флуоресценции19. В assay измеряем наш холестерина использование же окончательный состав растворителей в средствах массовой информации и клетки, разрешено гомогенизации ячейки СМИ и измерения lysate эффективно.
Настоящее исследование профилированного NBD-холестерин измеряем временем и нашли время зависимых прогрессии до 6 ч инкубации с акцепторной ABDS, похожа на песню et al.14 и Лю et al.14 и в отличие от et al. Чжан, которые используются 1 h инкубационный период с акцепторами липидов19. Мы обнаружили, что после 6 ч инкубации, effluxed холестерина потерял линейности; Таким образом важно не превышать 6 ч. Наш Оптимальный спектр холестерина измеряем был между 3-6 ч после добавления акцепторами. Мы предлагаем инкубации клеток для 4 h с акцепторами холестерина. Дополнительные критические шаги являются использование средств бесцветным применить акцепторов избежание фон, посев полу вырожденная клетки культуры слой и правильного соблюдения тех к пластине. Следует отметить, что ясно нижней белой плиты полезно следовать клетки под обратной световой микроскоп.
Большинство холестерина измеряем анализы проводятся с использованием очищенного липидов акцепторов в тесте измеряем холестерина. Настоящий метод был разработан для получения возможности измеряем холестерина от человеческой сыворотки или плазмы образцов. Мы используем акцепторов внутренние холестерина в сыворотке крови, но важно, чтобы удалить частицы, содержащие аполипопротеина B, который будет разослать холестерина молекул внутри клетки20,21. Как изменения очищенный ApoAI и HDL может также использоваться в качестве акцепторов. Кроме того клеточных линий, за исключением человека THP-1 были успешно использованы в флуоресцентные холестерина измеряем анализов, например Raw 264.7 или J774A1 макрофагов и таким образом будет скорее всего работать в нашем метод15,22.
Основные ограничения этого метода, что результаты зависят от конкретных клеток линии, стандартная ячейка, но клетки, свободной метод будет выгодным для использования в качестве биомаркеров. Кроме того сера, используется для стандартизации этот метод был заморожен; NBD остаток на уровень холестерина менее физиологических, чем радио помечены, и его поглощение отличается от эндогенных холестерина; и мы протестировали итоговый набор процессов (т.е., , с участием сыворотки частицы, линии клеток, возможные этерификации холестерина, распространения холестерина или одновременных процессов, измеряем и приток). Однако, как преимущество, методы, основанные на флуоресценции показали, чтобы иметь высокий потенциал в качестве заменителей для традиционных методов, цианокобаламина, меченного и замещении [3H]-холестерин, люминесцентные, меченного молекулы для мониторинга холестерин измеряем assays14.
Измеряем холестерина может выступать в качестве биомаркера атеросклероза23, как он соотносится с будущим сердечно-сосудистых событий24,25. Возможность изучения роли макрофагов в атеросклероза является очищенный HDL и его состава; Однако HDL очистки является трудным и длительным процессом. Кроме того во время очистки, другие компоненты сыворотки с атерогенные эффект может недооценивать или потеряли. По этой причине ABDS был выбран в качестве акцептора липидов. Масштаб высокой пропускной способности и сокращения времени стало возможным благодаря подставляя сцинтилляционный счетчик для читателя пластины, измерения флуоресцентного сигнала в пластину же культуры (в случае lysate клетки) и сокращения протокол на два дня. Кроме того этот метод показывает более высокой чувствительности, когда клетки подвергаются различной концентрации сыворотки, чем меры, полученные от коммерциализации комплект для оценки измеряем холестерина.
В заключение был описан assay измеряем NBD-холестерин, который коррелирует с традиционным методом, радиоактивных. Мы определили оптимальное время для инкубации акцепторов липидов из человеческих образцов (сыворотки или плазмы) в форме ABDS. Мы оптимизировали заполнения ячейки, дифференциация, динамический диапазон и точки насыщения техники. Что касается его основной новизна мы оптимизировали сочетание растворителей, используемых в измерений для получения высокой интенсивности и улучшение диапазона линейной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы хотели бы заявить, что они являются изобретателей заявки на патент (ЕПВ; 18382337.6-1118; 17 мая 2018) под названием «Метод для определения холестерина измеряем» на основе этого метода.
Acknowledgments
Эта работа частично поддерживается исследовательских грантов FIS (PS12/00866) из Instituto de Salud Карлоса III, Мадрид, Испания; Fondo Europeo Comisión para el Desarrollo региональных (ФЕДЕР); Красный де инвестигасьон en СИДА (рис), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) и CERCA программы / Женералитата Каталонии. Авторы благодарят Retrovirology и вирусная лаборатория иммунопатологии Institut d'Investigacions Pi Biomèdiques августа I Сунийе (IDIBAPS). Мы благодарим т. Escribà, C. Ровира и C. Уртадо за их помощь и S. Cufí от знания и технологии передачи управления за ее руководство в деле защиты изобретения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A.
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D.
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K.
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
