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Bioengineering

Lucifer पीला - मानव रक्त मस्तिष्क बैरियर के एक सेल मॉडल में एक मजबूत Paracellular स्थायित्व मार्कर

Published: August 19, 2019 doi: 10.3791/58900
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical, Administrative and Social Sciences, Duquesne University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky

Summary

हम एक फ्लोरोसेंट परख प्रस्तुत करने के लिए प्रदर्शित करता है कि Lucifer पीला (LY) एक मजबूत मार्कर hCMEC/D3 सेल monolayers, मानव रक्त मस्तिष्क बाधा के एक इन इन इन इन इन इन इन इन इन इन इन विट्रो मॉडल की स्पष्ट paracellular पारगम्यता निर्धारित करने के लिए है. हमने इस परख का उपयोग सुसंस्कृत एचसीएमईसी/डी 3 कोशिकाओं में एक-प्रवाही मोनोलेयर गठन की गतिज ताक का प्रयोग किया।

Abstract

रक्त मस्तिष्क बाधा BBB endothelial कोशिकाओं है कि प्रणालीगत परिसंचरण और मस्तिष्क के बीच एक बाधा फार्म गैर जरूरी आयनों और विषाक्त पदार्थों के आदान प्रदान को रोकने के होते हैं. तंग जंक्शनों (टीजे) प्रभावी ढंग से एक परतों में paracellular अंतरिक्ष एक बरकरार बाधा में जिसके परिणामस्वरूप सील. यह अध्ययन एक LY-आधारित फ्लोरोसेंट परख का वर्णन करता है जिसका उपयोग इसकी स्पष्ट पारगम्यता गुणांक (पीऐप)निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और बदले में इसका उपयोग संप्रवाही मोनोलेयरों के गठन की गतिजता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और परिणामस्वरूप तंग जंक्शन HCMEC/D3 मोनोलेयर्स में बाधा अखंडता। हम आगे transfected कोशिकाओं में TJ कार्यात्मक अखंडता निर्धारित करने के लिए इस परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता प्रदर्शित करता है. एलई पीएप्लिकेशन परख से हमारे डेटा से पता चलता है कि hCMEC/D3 कोशिकाओं को एक ट्रांसवेल सेटअप में वरीयता प्राप्त प्रभावी ढंग से LY paracellular परिवहन 7 दिन के बाद संस्कृति सीमा. प्रस्तुत परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता के रूप में, हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि डीएनए नैनोकण transfection एचसीएमईसी/डी 3 मोनोलेयर्स में LY paracellular परिवहन को परिवर्तित नहीं करता है।

Introduction

रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) मस्तिष्क के ऊतकों में प्लाज्मा घटकों के प्रवाह को सीमित सुरक्षात्मक बाधा है और इस तरह के pericytes के रूप में समर्थन कोशिकाओं के साथ मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के होते हैं. बीबीबी की प्रमुख भूमिका एक अवरोध के रूप में काम करना है जो परिधीय रक्त और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के बीच की जगह को सील करता है ताकि तंत्रिका सूक्ष्म पर्यावरण1,2के हेमोस्टेसिस को बनाए रख सके . मस्तिष्क केशिका अंत:संवदेलिया कोशिकाएं अंतरकोशिकीय तंग जंक्शनों (टीजे)1के गठन के माध्यम से परकोशिकीय मार्ग को प्रभावी ढंग से सील करती हैं। यह सुरक्षात्मक बाधा ग्लूकोज और चयनित पोषक तत्वों मस्तिष्क में प्रवेश करने की अनुमति देता है, जबकि यह आयनों के बहुमत को रोकता है, विषाक्त पदार्थों और दवाओं इस तंग बाधा के माध्यम से गुजर से. इसकी सुरक्षात्मक भूमिका के अलावा, बीबीबी का प्राकृतिक अवरोध समारोह सीएनएस को लक्षित करने वाली दवा वितरण प्रणालियों के विकास में एक गंभीर चुनौती बन गया है।

BBB के इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल अपने जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए और TJ बाधा अखंडता पर दवा उपचार के प्रभाव को समझने के लिए उपयोगी उपकरण हैं. हम एक इन विट्रो मॉडल के रूप में मानव मस्तिष्क microvascular endothelial सेल लाइन (hCMEC/D3) का इस्तेमाल किया क्योंकि यह मानव मस्तिष्क endothelium3 के एक स्वीकार किए जाते हैं मॉडल है और मानव BBB के कई कार्यों recapitulates. hCMEC/D3is इन विट्रो4,5,6,7,8,9में BBB मॉडलिंग के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सेल लाइनों में से एक . transendothelial विद्युत प्रतिरोध (टीईईईईआर) के अपने अपेक्षाकृत कम मूल्यों के बावजूद, बाधा जकड़न का एक उपाय है, इस सेल लाइन मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के रूप में रूपात्मक और कार्यात्मक गुणों के अधिकांश बरकरार रखती है, यहां तक कि की अनुपस्थिति में एक मोनोकल्चर के रूप में सहकृषि ग्लिल कोशिकाएं6,7. HCMEC/D3 सेल लाइन सक्रिय ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स सहित कई BBB मार्करों व्यक्त करता है जब तक लगभग मार्ग 35 अस्थिर phenotypes6,7,9 के लिए dedifferentiation के दौर से गुजर के बिना ,10,11. इन विट्रो बीबीबी मॉडल के रूप में एचसीएमईसी/डी 3 सेल लाइन की सबसे उल्लेखनीय विशेषता टीजे5,9,11,12बनाने की क्षमता है . यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि स्टेम सेल व्युत्पन्न BBB मॉडल hCMEC/D3 सेल लाइन के साथ तुलना में कई अध्ययनों में उच्च पारगम्यता से पता चला है और वे कुछ BBB मार्करों व्यक्त करते हैं, वे अभी तक सबसे आम BBB सेल मॉडल13के रूप में विकसित करने के लिए कर रहे हैं. महत्वपूर्ण बात यह है कि स्टेम सेल व्युत्पन्न BBB मॉडल अधिकतम मार्ग संख्या है कि कोशिकाओं को स्थिर BBB phenotypes14बनाए रखने के लिए अनुमति देने के संबंध में विशेषता होना शेष है.

तीन प्राथमिक तरीकों आमतौर पर टीजे बाधा अखंडता निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, TEER की माप सहित, स्पष्ट पारगम्य गुणांक की माप (पीअनुप्रयोग) इस तरह के सुक्रोज, inulin, Lucifer पीला के रूप में छोटे हाइड्रोफिलिक अनुरेखक अणुओं की, आदि और TJs के ज्ञात आणविक मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग जैसे कि क्लाउडिन-5, जेडओ-1, ऑक्लूडिन, आदि5. टीईईईआर एक अपेक्षाकृत सरल और मात्रात्मक विधि है जो छिद्रयुक्त झिल्ली पर सुसंस्कृत कोशिका मोनोलेयरों के पार विद्युत प्रतिरोध को मापता है. हालांकि, TEER मूल्यों इस तरह की संस्कृति माध्यम की संरचना और माप साधन के प्रकार के रूप में प्रयोगात्मक चर से प्रभावित किया जा सकता है। इन कारकों के संभावित संयोजन से 2-21 दिनों 13 के लिए सुसंस्कृत एचसीएमईसी/डी 3 सेल लाइन में2 से 1150 सेमी2 तक के टीईईआर मूल्यों का व्यापक वितरण होता है। इम्यूनोस्टेनिंग एंटीबॉडी का उपयोग करलक्षित प्रोटीन लेबलिंग द्वारा टीजे प्रोटीन की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक दृश्य विधि है। हालांकि, इम्यूनोस्टेनिंग में प्रयोगात्मक चरणों की एक श्रृंखला शामिल है, जिसमें प्रयोगात्मक कलाकृतियों में परिणाम हो सकने वाली कोशिकाओं को ठीक करने/परमेबिलाइज़ करने की आवश्यकता शामिल है और फ्लोरोसेंट सिग्नल समय के साथ फीका हो सकते हैं। उपरोक्त कारकों व्यक्तिपरक त्रुटियों डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

इस कार्य का प्राथमिक फोकस एक LY-आधारित स्पष्ट पारगम्यता परख को सुसंस्कृत hCMEC/D3 कोशिकाओं में एक confluent मोनोलेयर गठन की गतिज निर्धारित करने के लिए प्रस्तुत करने के लिए है। हालांकि अन्य उन्नत इन विट्रो BBB सिस्टम, जैसे सह-संस्कृति प्रणाली, microfluidic सिस्टम, शारीरिक रूप से काफी सुधार बाधा समारोह15,16,17, hCMEC / ट्रांसवेल सेटअप टीजे गठन की गतिज ताकने और बाधा समारोह पर विभिन्न दवा योगों के प्रभाव को तेजी से स्क्रीन करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय मॉडल है। सामान्य में, पीएप्लिकेशन मूल्यों hCMEC/D3 monolayers में विभिन्न हाइड्रोफिलिक विलेय के लिए संगत कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, विभिन्न कम आणविक द्रव्यमान विलेय के लिए रिपोर्ट किए गए पीऐप मान (जैसे कि सुक्रोज, मैनिटॉल, एलई, आदि) विभिन्न इन विट्रो बीबीबी मॉडल में 10 -4 सेमी/ , 20.हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में, मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं कोशिका लगाव और monolayer गठन के लिए एक कोलेजन लेपित microporous झिल्ली पर बीज रहे हैं में विवो बाधा की नकल. शीर्ष पक्ष में जोड़ा गया लया गया अंतरकोशिकीय तंग संधिओं को पार करने और बासोपार्श्विक पक्ष में जमा होने की आशा है। बासोपार्श्व पक्ष में एलएचई की अधिक सांद्रता एक अपरिपक्व, पूर्ण रूप से कार्यात्मक बाधा का संकेत देती है, जबकि कम सांद्रता एक परिपक्व बाधा में जिसके परिणामस्वरूप कार्यात्मक टीजे की उपस्थिति के कारण प्रतिबंधित परिवहन को प्रतिबिंबित करती है।

एलई एक हाइड्रोफिलिक डाई है जिसमें अलग-अलग उत्तेजना/उत्सर्जन चोटियों होती है और सुक्रोज, मैनिटॉल या इनुलिन जैसे रेडियोलेबल ट्रेसर अणुओं की आवश्यकता से बचा जाता है। इस प्रकार, एलई के फ्लोरोसेंट मानों का उपयोग BBB मोनोलेयर्स में इसकी पारकोशिकीयता की प्रत्यक्ष गणना करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, जैव चिकित्सा क्षेत्रों में उपयोग किए जाने वाले कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंगों की तुलना में जो फ्लोरोरेसिन21जैसे छोटे स्टोक्स शिफ्ट से पीड़ित हैं, एलआई के स्टोक्स शिफ्ट पर्याप्त वर्णक्रमीय जुदाई के साथ लगभग 108 एनएम है, इस प्रकार एलआई फ्लोरोसेंस डेटा को एक के रूप में अनुमति देता है paracellular पारगम्यता निर्धारित करने के लिए मजबूत readout. हम एक orthogonal तकनीक के रूप में पश्चिमी blotting का इस्तेमाल किया तंग जंक्शन मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए, $O-1, संस्कृति के समय पर. ओओ-1 अभिव्यक्ति पश्चिमी blotting के माध्यम से पता चला LY Pएप्लिकेशन डेटा के पूरक और संयोजन में प्रयोग किया जाता है, इन आंकड़ों का सुझाव है कि LY Pअनुप्रयोग मूल्यों में मनाया परिवर्तन में क्रमिक वृद्धि के साथ एक मोनोलेयर के गठन के चिंतनशील है तंग जंक्शन मार्कर की अभिव्यक्ति, $O-1.

जैसा कि पहले बताया गया है, इस काम का केंद्रीय ध्यान कार्यात्मक तंग जंक्शनों के साथ एक confluent monolayer के गठन की निगरानी के लिए एक सरल तकनीक के रूप में एक LY परख प्रदर्शित करने के लिए है. हालांकि, विकसित परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए, हम डीएनए नैनोकण में LY पीएप्लिकेशन को मापा-transfected hCMEC / न्यूक्लिक अम्लों को पॉलिमर के धनावेशित समूहों तथा न्यूक्लिक अम्लों के ऋणावेषित फॉस्फेट समूहों के बीच स्थिर वैद्युत अन्योन्यक्रिया के माध्यम से 100-200 दउ के व्यास वाले पॉलीइलेक्ट्रोलाइट नैनोकणों में संघनित किया जा सकताहै, 23हम अपने काम में डीएनए नैनोकणों (डीएनए एन पी एस) के रूप में इन परिसरों का उल्लेख करते हैं। जबकि हमारा इरादा कोशिकाओं transfect और वांछित प्रोटीन व्यक्त करने के लिए है, हम यह सुनिश्चित करना चाहिए कि hCMEC/D3 monolayers के बाधा गुण समझौता नहीं कर रहे हैं. हमारे डेटा से पता चलता है कि एक मानक 4 एच luciferase जीन transfection शासन measurably LY Pएप्लिकेशन परख की उपयोगिता का प्रदर्शन TJ बाधा अखंडता में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए परिवर्तन नहीं करता है.

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Protocol

1. जनरल hCMEC / डी 3 सेल संस्कृति

  1. जमे हुए कोशिकाओं का पुनर्जीवन
    नोट: सभी सेल संस्कृति रखरखाव और प्रयोगों एक बाँझ biosafety हुड के अंदर प्रदर्शन किया गया. संस्कृति मीडिया, पूरक और अभिकर्मकों या तो बाँझ उत्पादों के रूप में खरीदा गया था या निस्पंदन के माध्यम से बाँझ एक 0.22 डिग्री झिल्ली फिल्टर का उपयोग करने के लिए माइक्रोबियल संदूषण को रोकने के.
    1. एक ऊतक संस्कृति फ्लास्क (75 सेमी2 विकास क्षेत्र) में कोलेजन समाधान (0.15 मिलीग्राम/एमएल) के 8.5 एमएल जोड़ें; अब से T75 के रूप में संदर्भित करें और इसे एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में 1 एच के लिए रखें।
    2. कोलेजन समाधान निकालें और धीरे बाँझ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ फ्लास्क धो लें। फ्लास्क के लिए पूर्ण विकास माध्यम के 15 एमएल जोड़ें और 15 मिनट के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में छोड़ दें।
      नोट: पूरा माध्यम (अंतिम एकाग्रता) Endothelial सेल विकास बेसल मध्यम-2 (500 एमएल) भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक (5%), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%), hydrocortisone (1.4 $M), एसिड एस्कोबिक (5 डिग्री/ ध्यान केंद्रित (1/100), HEPES (10 मीटर) और बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक (1 एनजी /
    3. तरल नाइट्रोजन टैंक से जमे हुए HCMEC/D3 कोशिकाओं के एक क्रायोविएल ले जाएँ और तेजी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में शीशी thaw (और lt; 1 मिनट).
    4. एक बार केवल बर्फ का एक छोटा सा परत दिखाई देता है, जल्दी से aspirate और पूर्व गर्म माध्यम युक्त फ्लास्क के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित. विकास माध्यम के साथ कोशिकाओं के मिश्रण की अनुमति देने के लिए फ्लास्क को धीरे से हिलाएं।
    5. इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2) में फ्लास्क रखें और कोशिकाओं को संलग्न सुनिश्चित करने के लिए 2 ज के बाद एक हल्के सूक्ष्मदर्शी के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
    6. एक बार जब कोशिकाएं फ्लास्क के तल से जुड़ जाए, तो पुराने विकास माध्यम को हटा दें और पुराने विकास माध्यम24में डाइमेथिलसल्फोक्साइड को बदलने के लिए 10 एमएल ताजा पूर्व-वार्म्ड ग्रोथ मीडियम जोड़ें।
    7. 24 ज के बाद, धुरी के आकार की कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें और पुराने विकास माध्यम को पूर्व-गर्म ताजा विकास माध्यम के साथ बदलें।
  2. सेल संस्कृति रखरखाव
    1. विकास के माध्यम को हर दूसरे दिन 100% संगम तक पूरा करें। पुराने विकास माध्यम को हटाने से पहले और ताजा विकास माध्यम जोड़ने के बाद भी माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें। इनक्यूबेटर से फ्लास्क बाहर निकालो और चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत hCMEC/D3 कोशिकाओं की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे स्वस्थ दिखाई देते हैं.
      नोट: कोशिकाओं के बहुमत फ्लास्क के नीचे से जुड़ा होना चाहिए, एक धुरी के आकार की आकृति विज्ञान है और अक्सर बार, प्रकाश उनकी झिल्ली के आसपास refracting भी देखा जाता है. विकास माध्यम पारदर्शी (गैर-बादल) और गुलाबी-नारंगी रंग होना चाहिए।
    2. फ्लास्क से पुराने विकास माध्यम निकालें और फ्लास्क में पूर्व-गर्म ताजा माध्यम के 10 एमएल को स्थानांतरित करें।
      नोट: माध्यम को फ्लास्क के शीर्ष पक्ष में जोड़ा जाना चाहिए और कोशिकाओं के अनुलग्नक को प्रभावित करने से बचने के लिए सीधे कोशिकाओं की सतह पर नहीं जोड़ा जाना चाहिए।
    3. फ्लास्क को क्षैतिज स्थिति में वापस मोड़ें और धीरे से इसे कई बार रॉक करें और इनक्यूबेटर को फ्लास्क कोलौटने से पहले माइक्रोस्कोप के नीचे hCMEC/D3 कोशिकाओं की जांच करें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO 2)।
    4. नियमित संस्कृति कार्य के दौरान और प्रयोगों के दौरान कोशिकाओं को संभालने से पहले और बाद में हर बार एक उल्टे प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के नीचे कोशिकाओं का प्रेक्षण कीजिए। प्रयोगशाला नोटबुक में सेल संख्या या आकारिकी में कोई भी सूचना योग्य परिवर्तन रिकार्ड करें।
  3. कोशिका पारण
    1. इनक्यूबेटर में 1 एच के लिए कोलेजन समाधान के 8.5 एमएल के साथ एक नया T75 फ्लास्क इनक्यूबेट करें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
    2. कोलेजन समाधान निकालें और धीरे बाँझ पीबीएस के साथ फ्लास्क धो लें। नए फ्लास्क में प्री-वार्म्ड एचसीएमईसी/डी 3 माध्यम के 10 एमएल जोड़ें और इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस2)में फ्लास्क रखें।
    3. इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकाल लें और एक चरण विपरीत सूक्ष्मदर्शी के तहत एचसीएमईसी/डी3 कोशिकाओं की जांच करें ताकि यह पता लगाया जा सके कि कोशिकाएं 100% अनुकूल हैं या नहीं।
    4. कोशिकाओं युक्त फ्लास्क से एचसीएमईसी/डी 3 सेल माध्यम निकालें और पीबीएस के 10 एमएल के साथ एचसीएमईसी/डी 3 कोशिकाओं को धोएं।
      नोट: एफबीएस विकास माध्यम में जोड़ा प्रोटीज़ inhibitors जैसे कि $ 1-antitrypsin और $ 2-macroglobulin शामिल हैं। ये ट्रिप्सिनाइजेशन प्रक्रिया को रोकते हैं। इस प्रकार, यह pबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने के लिए FBS के निशान को दूर करने के लिए trypsinization प्रक्रिया के निषेध को रोकने के लिए आवश्यक है.
    5. 0.02% EDTA युक्त 0.25% trypsin समाधान के 1 एमएल जोड़ें और इनक्यूबेटर में 2-5 मिनट के लिए trypsinize (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) (अलग होने में मदद करने के लिए पक्षों पर धीरे से फ्लास्क नल)।
      नोट: कभी भी कोशिकाओं को 6 मिनट से अधिक के लिए ट्रिप्सिन/EDTA पर न छोड़ें।
    6. trypsinization प्रक्रिया को रोकने के लिए पूर्व-वार्म्ड HCMEC/D3 माध्यम के 10 एमएल जोड़ें और कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा hCMEC/D3 सेल को पुन: निलंबित करें। फिर, फ्लास्क से पूरे सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में निकाल दें।
    7. 15 एमएल ट्यूब से सेल निलंबन के 1 एमएल को पूर्व-वार्म्ड ताजा माध्यम (विभाजन कोशिकाओं 1:10) के साथ नए फ्लास्क में स्थानांतरित करें और नए फ्लास्क को इनक्यूबेटर पर वापस लौटादें।
      नोट: नई फ्लास्क को स्थानांतरित करने से पहले, सेल निलंबन को सेल एकाग्रता ग्रेडिएंट को कम करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।

2. सेल चढ़ाना

  1. जगह ऊतक संस्कृति microporous झिल्ली के साथ सम्मिलित करता है (पोर आकार: 0.4 डिग्री, सामग्री: polyethylene terephthalate (पीईटी)) एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में.
  2. प्रत्येक ऊतक संस्कृति डालने और सीओ2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में 1 एच के लिए इनक्यूबेटमें कोलेजन प्रकार I (0.15 मिलीग्राम/एमएल) का 400 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। 24-वेल प्लेट को धीरे से रॉक करें ताकि ऊतक संस्कृति में माइक्रोपोरस झिल्ली पर कोलेजन समाधान के प्रसार की अनुमति दी जा सके।
  3. कोलेजन समाधान निकालें और धीरे 1x पीबीएस बफर के 0.4 एमएल के साथ microporous झिल्ली धो लो.
  4. प्लेट hCMEC/D3 कोशिकाओं के घनत्व के साथ 50,000 कोशिकाओं / सेमी2 सेल आवेषण में (15,000 कोशिकाओं में 500 डिग्री सेल्सियस मध्यम के).
    नोट: प्रत्येक ऊतक संस्कृति डालने में सेल संख्या में अंतर को कम करने के लिए, सेल निलंबन आवेषण करने के लिए कोशिकाओं को जोड़ने से पहले एक 10 एमएल पिपेट के साथ फिर से निलंबित किया गया था।
  5. सेल लगाव और प्रसार की अनुमति देने के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में ऊतक संस्कृति सेटअप के साथ 24-वेल प्लेट रखें।
  6. कोशिकाओं को 100% संगम तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए 7 दिनों के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। हर दूसरे दिन विकास माध्यम निकालें और ऊतक संस्कृति आवेषण में पूर्व-गर्म ताजा मीडिया के 0.5 एमएल हस्तांतरण।
  7. चढ़ाना प्रक्रिया दोहराएँ (चरण 2-2.6) एक 12 अच्छी तरह से थाली, 48 अच्छी तरह से थाली और 96 अच्छी तरह से थाली पर. $O-1 अभिव्यक्ति में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए पश्चिमी सोख्ता के लिए 12-वेल प्लेट का उपयोग करें। डीएनए एनपी ट्रांसफेक्शन के लिए 48-वेल प्लेट का उपयोग करें। transfected कोशिकाओं में सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एटीपी परख के लिए 96-वेल प्लेट का उपयोग करें।

3. कोशिका विकास के काइनेटिक्स.

  1. कोलेजन लेपित 24-वेल ऊतक संस्कृति प्लेट में 50,000 सेल/सेमी2 के घनत्व पर कोशिकाओं को बीज।
  2. प्रयोग के प्रत्येक दिन, विकास माध्यम को हटा दें और धीरे से 1x PBS के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें. फिर, 0.02% EDTA युक्त 0.25% trypsin समाधान के 30 $L जोड़ें और एक इनक्यूबेटर में लगभग 2-5 मिनट के लिए थाली छोड़ (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)।
    नोट: confluent monolayer के क्रमिक गठन सेल टुकड़ी की सीमा को प्रभावित कर सकते हैं और यह trypsin/EDTA की मात्रा में वृद्धि के रूप में यहाँ संकेत दिया आवश्यक है: 1-5 दिनों के बाद बीज के लिए 30 $L, 60 के लिए 60 $L बीज बोने और 8-10 दिनों के बाद बीज बोने के लिए 100 $L .
  3. प्रत्येक कुएं में 500 डिग्री सेल्सियस सेल निलंबन तैयार करने के लिए चरण 3.2 में जोड़े गए ट्रिप्सिन/EDTA समाधान की मात्रा के आधार पर 470 $L, 440 $L या 400 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि माध्यम जोड़ें।
  4. प्रत्येक कुएं में कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को निलंबित करें और यह सुनिश्चित करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें कि विकास माध्यम में सभी कोशिकाओं को निलंबित कर दिया गया है। यदि कुछ कोशिकाओं को अभी भी कई बार pipeting के बाद प्लेट नीचे से जुड़े रहे हैं, धीरे सेल टुकड़ी की सुविधा के लिए एक प्लास्टिक सेल खुरचनी का उपयोग कर कोशिकाओं को स्क्रैप.
  5. चरण 3.3 में 500 $L सेल निलंबन से 0.1 एमएल सेल निलंबन निकालें और 1.5 एमएल ट्यूब में जोड़ें। फिर, सेल निलंबन के लिए 0.4% Trypan नीले समाधान के 0.1 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण.
  6. 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ एक हेमाकिटोमीटर को साफ करें। वी-नाली में प्रत्येक पक्ष पर चरण 3.5 से मिश्रण का 20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और माइक्रोस्कोप के नीचे 16 वर्गों का पता लगाएं। 16 वर्गों को एक ग्रिड के रूप में माना जाता है। हेमीस्टोमीटर के प्रत्येक पक्ष पर दो यादृच्छिक ग्रिड का पता लगाएँ और सभी जीवित, गैर-नीली कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: वे कक्ष जो गिनती से बाहर से नीले रंग में दिखाई देते हैं, और सभी समय बिंदुओं पर नीले रंग के अंकों पर स्थित कक्षों का 1%।
  7. निम्नलिखित सूत्रों केआधार पर सेल घनत्व (कोशिकाओं/सेमी 2) की गणना कीजिए।
    कोशिकाओं/ग्रिड Equation 1 का औसत [(EQ.1)
    Dilution Factor] Equation 2 (EQ.2)
    कोशिका घनत्व (व्यवहार्य कोशिकाओं/सेमी2)
    Equation 3
    (EQ.3)
    समीकरण 1-3. व्यवहार्य कोशिकाओं प्रत्येक ग्रिड में गिना कोशिकाओं की संख्या, ग्रिड की संख्या माइक्रोस्कोप के नीचे स्थित ग्रिड की संख्या के अनुरूप हैं, सेल निलंबन के मिश्रण की मात्रा और 0.4% Trypan नीले चरण 3.5 में तैयार मात्रा है, सेल निलंबन की मात्रा हटा दिया है चरण 3.5 में 500 डिग्री सेल्सियस सेल निलंबन से हटा दिया गया मात्रा, प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन की मात्रा चरण 3.3 से 500 डिग्री सेल्सियस सेल निलंबन है, ऊतक संस्कृति प्लेट का विकास क्षेत्र 24-वेल प्लेट में एकल कुएं का विकास क्षेत्र है।

4. Lucifer पीला स्पष्ट पारगम्यता (LY P अनुप्रयोग ) परख

  1. प्रत्येक दिन के बाद बीज बोने पर LY Pएप्लिकेशन का निर्धारण करने के लिए, 4.3 शुरू चरणों का पालन करें। ट्रांसफेक्टेड एचसीएमईसी/डी3 कोशिकाओं में पीअनुप्रयोग का निर्धारण करने के लिए, ट्रांसफेक्शन तैयार करने के 8.3 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (चित्र 1) पूर्ण विकास माध्यम के 50 डिग्री सेल्सियस के साथ मिश्रित और 4 ज के लिए इनक्यूबेट का वर्णन खंड 5 में किया गया है।
  2. 4 एच transfection के बाद, धीरे से किसी भी अवशिष्ट transfection मिश्रण को दूर करने के लिए बाँझ 1x पीबीएस बफर का उपयोग कर शीर्ष पक्ष दो बार धो लें। हटाने के बाद पीछे छोड़ दिया PBS बफर के विभिन्न मात्राओं शीर्ष पक्ष में LY की एकाग्रता को प्रभावित कर सकते हैं. ध्यान रखना सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक संस्कृति आवेषण में अवशिष्ट PBS बफर पूरी तरह से हटा दिया जाता है. सावधानी से अवशिष्ट अभिकर्मकों और मध्यम आशंकित कोशिका टुकड़ी को कम करने के लिए.
    नोट: hCMEC/D3 कोशिकाओं के हर दिनस्पष्ट पारगम्यता (पी एप्लिकेशन) को मापने जब यह कदम छोड़ दिया है।
  3. विकास माध्यम निकालें और पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) परिवहन बफर (25 एमएम हेप, 145 एम एम नैकल, 3 एमएम केसीएल, 1 एमएमकेसीएल 2, 0.5 एमएम सीएल2,1 एमएम नाएच2पीओ4, 5 एमएम ग्लूकोज, पीएच 7.4) को जोड़ें।
    नोट: सभी basolateral डिब्बों में परिवहन बफर की मात्रा पारगम्यता गुणांक गणना की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए बराबर होना चाहिए.
  4. प्रत्येक ट्रांसवेल डालने के शीर्ष पक्ष के लिए 20 डिग्री एम एल एल समाधान का 58.3 डिग्री एल जोड़ें। फ्लोरेसेंस माप के लिए 20 डिग्री एम एलई समाधान का 50 डिग्री सेल्सियस बचाएं। पूरी तरह से शीर्ष पक्ष से अवशिष्ट पीबीएस बफर को हटाने के बाद, HCMEC/D3 कोशिकाओं सुखाने से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके LY समाधान जोड़ें। शीर्ष पक्ष में LY समाधान की सही मात्रा सुनिश्चित करें।
    नोट: LY फ्लोरोसेंट तीव्रता के क्षय को कम करने के लिए, प्रकाश जोखिम सीमित किया जाना चाहिए. एक बार जब LY पाउडर का पुनर्गठन किया जाता है, तो समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए, जो प्रकाश से सुरक्षित है।
  5. 60 मिनट के लिए एक रोटरी प्लेट शेकर (37 डिग्री सेल्सियस, 100 आरपीएम) में इनक्यूबेट। फिर, प्रत्येक शीर्ष डिब्बे से LY नमूने के 30 डिग्री सेल्सियस को हटा दें। फिर पूर्व लेबल ट्यूबों के लिए 20 डिग्री एम एलई समाधान और शीर्ष पक्ष के नमूने हस्तांतरण और नमूना पतला 10 गुना परिवहन बफर का उपयोग कर।
    नोट: यह इन नमूनों की उच्च फ्लोरोसेंट तीव्रता संभावित अधिभार और फ्लोरोसेंट माइक्रोप्लेट रीडर के फ्लोरोसेंट डिटेक्टर को नुकसान हो सकता है क्योंकि 20 डिग्री एलई स्टॉक समाधान और शीर्ष पक्ष के नमूने को पतला करने के लिए आवश्यक है।
  6. प्रत्येक basolateral डिब्बे से 500 डिग्री सेल्सियस निकालें और पूर्व लेबल ट्यूबों के लिए नमूना हस्तांतरण.
    नोट: नमूने संकेत समय बिंदुओं पर अलग ट्रांसवेल से हटा रहे हैं। समय अंक प्रत्येक दिन के बाद बीज दिन 10 तक 1 दिन से शुरू कर रहे हैं.
  7. मानक वक्र (39.00 एनएम, 78.13 एनएम, 156.25 एनएम, 312 एनएम, 625 एनएम, 1250 एनएम, 2500 एनएम) के लिए LY मानकों की एक श्रृंखला तैयार करें।
  8. प्रत्येक मानक के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (डुप्लिकेट में), शीर्ष और basolateral नमूना प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक काले 96 अच्छी तरह से थाली में (चित्र 1).
    नोट: काले प्लेटें प्रकाश को अवशोषित और कुओं के बीच पृष्ठभूमि और फ्लोरोसेंट विदेशी कम.
  9. पीएप्लिकेशनकी गणना करने के लिए एलई फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोप्लेट रीडर (सेट अंक: उत्तेजना 428 एनएम, उत्सर्जन 536 एनएम) का उपयोग करें। इस अध्ययन के लिए एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का प्रयोग किया जाता है।
  10. पांडुलिपि पाठ में वर्णित के रूप में Pअनुप्रयोग और %LY पुनर्प्राप्ति मानों की गणना करें।
    समीकरण 4. Pअनुप्रयोग मानों की गणना के लिए सूत्र|
    निम्न समीकरणों का उपयोग करके स्पष्ट पारगम्यता (Pअनुप्रयोग) गुणांक और %LY पुनर्प्राप्ति परिकलित करें. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पीएप्लिकेशन मूल्यों या तो बड़े पैमाने पर25 या LY की एकाग्रता के आधार पर गणना की जा सकती है।
    Equation 4 याEquation 5
    VA - शीर्ष डिब्बे में मात्रा
    वीबी - basolateral डिब्बे में मात्रा
    A - ट्रांसवेल डालने झिल्ली की सतह क्षेत्र (0.3 सेमी2)
    एमए0 - शीर्ष डिब्बे में प्रारंभिक द्रव्यमान
    $MB/t - बैसोपार्श्व डिब्बे में समय के साथ बड़े पैमाने पर परिवर्तन
    CA0 - शीर्ष डिब्बे में प्रारंभिक एकाग्रता
    $CB/t - बासोपार्श्व डिब्बे में समय के साथ एकाग्रता में परिवर्तन।
    समीकरण 5. % LY पुनर्प्राप्ति की गणना के लिए सूत्र|
    वसूली (%) ] Equation 6
    एमए एफ अंत समय बिंदु पर शीर्ष डिब्बे में द्रव्यमान है, एम बीएफ अंत समय बिंदु पर बासोपार्श् विक डिब्बे में द्रव्यमान है, एमए0 शीर्ष डिब्बे में प्रारंभिक द्रव्यमानहै। 26 नोट: प्रारंभिक द्रव्यमान की गणना चरण 4ण्5 में 20 डिग्री द ल ए विलयन के आयतन के आधार पर की जाती है। यह प्रयोग हमेशा मार्ग संख्या 35 के तहत कोशिकाओं का उपयोग कर किया गया था और चार स्वतंत्र बार आयोजित किया गया.

5. कैल्शियम की कमी

  1. ट्रांसवेल आवेश और 12-वेल प्लेट से विकास माध्यम निकालें और ट्रांसवेल आवेषण से कैल्शियम आयनों को हटाने के लिए पूर्व-वार्म्ड कैल्शियम-मुक्त माध्यम (न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल स्पिनर (एस-एमईएम) माध्यम का उपयोग करके शीर्ष पक्ष और 12-वेल प्लेट को धीरे से धो लें और 12 अच्छी तरह से थाली.
  2. सम्मिलित करता है या 12 अच्छी तरह से प्लेट और इनक्यूबेटर में 24 एच के लिए इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) के लिए पूर्व-वार्म्ड एस-एमईएम 1xmedium के 500 डिग्री एल या 2 एमएल जोड़ें। ऊष्मायन के बाद, एस-एमईएम 1x माध्यम को हटा दें और पहले से तैयार 1x पीबीएस बफर का उपयोग करके कोशिकाओं को एक बार धो लें।
  3. 4-4-4-10 खंड 4 में LY उपचार और उसके बाद के चरणों के लिए वर्णित चरणों का पालन करें. 8-1-8.2.4 का पालन करें जो पश्चिमी सोखने और उसके बाद के चरणों के लिए अनुभाग 8 में वर्णित हैं.

6. ट्रांसफेक्शन

  1. डीएनए नैनोकणों (डीएनए एनपीएस) की तैयारी।
    1. 10 एमएम सोडियम एसीटेट (NaAc) बफर (पीएच 5.0) में gWIZ-ल्यूक प्लाज्मिड के स्टॉक समाधान को दूर करें और डीएनए समाधान को कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए खड़े होने की अनुमति दें।
      नोट: डीएनए एनपी जिसमें मुख्य रूप से एकल डीएनए अणु होते हैं, डीएनए सांद्रता 20-40 ग्राम/एमएल23पर तैयार किया जा सकता है। इस प्रकार, gWIZ-ल्यूक प्लाज्मिड स्टॉक समाधान को पतला करने की आवश्यकता है। जमे हुए GWI$-ल्यूक प्लाज्मिड स्टॉक को तापमान तनाव को कम करने के लिए बर्फ पर पूरी तरह से thawed की जरूरत है। धीरे घुंडी स्थिति 3-5 पर सेट एक मानक बेंचटॉप भंवर पर 30 s के लिए पतला डीएनए शेयर समाधान भंवर.
    2. एनपी संरचना को प्रतिबिंबित करने के लिए एक संख्यात्मक पैरामीटर के रूप में यहाँ प्रयुक्त वांछित N/P अनुपातों की गणना करें।
      Equation 7
      समीकरण 6. N/P अनुपात गणना: डीएनए के फॉस्फेट समूहों के लिए धनात्मक बहुलकों के amine समूहों के moles का अनुपात. धनायनी बहुलकों के द्रव्यमान का अर्थ होता है, कुल तौला हुआ धनात्मक बहुलक; (मास/प्रभार) धनायनी बहुलक धनात्मक बहुलक (पॉली (एथिलीग्लीकोल) 5k-ब्लॉक-पॉलीएस्पार्टमाइड के आण्विक भार को निर्दिष्ट करता है जिसमें 48 डाइएथिलेनट्राइमिन साइड चेन (PEG-DET)) चार्ज किए गए प्राथमिक amines (48) प्रति cationic बहुलक (48) की संख्या के लिए सामान्यीकृत होता है mol/mol), हमारे बहुलक के लिए यह मूल्य 306 दा है; डीएनए के द्रव्यमान का अर्थ होता है, मिलीग्राम/एमएल में मात्रा और सांद्रता को गुणा करके प्राप्त किए गए निर्माण में उपयोग किए जाने वाले डीएनए की कुल मात्रा; (मास/प्रभार) डीएनए डीएनए के आणविक वजन को संदर्भित करता है जो डबल-स्लेड डीएनए प्रति फॉस्फेट समूह की संख्या को सामान्यीकृत करता है (325 दा प्रति न्यूक्लिओबेस)।
      नोट: डीएनए एनपी तैयारी तालिका (तालिका 1) हमारे प्रयोगों में परीक्षण विभिन्न नमूनों के लिए तैयार नुस्खा शामिल हैं. डीएनए एनपी एक तेजी से अनुमापन तकनीक का उपयोग कर तैयार किए गए थे. PEG-DET बहुलक समाधान ट्यूब की दीवारों के साथ जोड़ा गया था, जबकि एक क्षैतिज स्थिति में ट्यूब पकड़े. फिर ट्यूब एक ऊर्ध्वाधर स्थिति के लिए बंद कर दिया गया था, जल्दी से 10s के लिए अधिकतम गति से भंवर द्वारा पीछा किया. डीएनए एनपी का उपयोग करने से पहले आरटी में 30 मिनट के लिए खड़े करने की अनुमति दी गई थी। डीएनए एनपी डोसिंग के लिए नियम-ऑफ-थंब ca. 1 सेमी2 विकास क्षेत्र के लिए 0.5 ग्राम डीएनए है। अतः प्रत्येक ट्रांसवेल insert/each well in a 48-well plate/each well in a 96-well plate, DNA NP को N/P 10 पर तैयार करें जिसमें 0.157/0.5/0.195 gWI$/Luc DNA है।
    3. Poloxamer P84 (P84) के संकेत एकाग्रता युक्त नमूनों के लिए, डीएनए एनपी और 5 s के लिए भंवर के लिए P84 जोड़ें. प्रत्येक नमूने में P84 के अंतिम एकाग्रता या तो 0.01% या 0.03% wt है.
  2. 48-वेल प्लेट सेटअप में डीएनए एनपी ट्रांसफेक्शन
    1. 48 अच्छी प्लेट में 50,000 सेल/सेमी2 के घनत्व वाली कोशिकाओं को बीज दें और इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस2)में संगम तक बढ़ें।
    2. प्रत्येक उपचार समूह के लिए, संकेत नमूना के 25 डिग्री एल मिश्रण (transfection निर्माण) और 150 डिग्री पूर्ण विकास माध्यम के और प्रत्येक अच्छी तरह से इस मिश्रण के 175 डिग्री सेल्सियस.
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं स्वस्थ दिखाई दें और प्रयोग के समय 100% अनुकूल हों, एक माइक्रोस्कोप के नीचे एचसीएमईसी/डी 3 कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
    4. कुओं से विकास माध्यम निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 175 डिग्री सेल्सियस transfection मिश्रण. फिर, इनक्यूबेटर में 4 एच के लिए प्लेट को इनक्यूबेटकरें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व् 2)।
    5. 4 ज के बाद, ट्रांसफेक्शन मिश्रण को हटा दें और एचसीएमईसी/डी 3 कोशिकाओं को प्री-वार्म्ड बाँझ 1x पीबीएस बफर के साथ धो लें।
      नोट: धोने के चरणों के दौरान प्लेट/इन्सर्ट सतह से एचसीएमईसी/डी 3 कोशिकाओं की आकस्मिक टुकड़ी को कम करने के लिए, कुओं की दीवारों के साथ पर्याप्त बाँझ पीबीएस को ध्यान से पाइपेट करें और अवशिष्ट संस्कृति मीडिया में किसी भी नैनोकणों को हटा दें।
    6. धीरे से थाली में कई बार रॉक और ध्यान से aspirate और पीबीएस धोने त्याग और hCMEC/D3 पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम के 500 $L जोड़ें.
    7. सूक्ष्म रूप से कोशिकाओं और सेल आकारिकी और transfection के किसी भी संभावित प्रभाव पर रिकॉर्ड टिप्पणियों की जांच.
    8. 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 24 एच के लिए इनक्यूबेट ल्यूसिफेरेस उत्पादन की अनुमति देने के लिए। 24 ज के बाद, विकास माध्यम को पूरी तरह से हटा दें और कोशिकाओं को एक बार प्री-वार्म्ड 1x पीबीएस के साथ धो लें।
    9. अच्छी तरह से प्रति बर्फ ठंडा luciferase सेल संस्कृति lysis 1x अभिकर्मक के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़कर transfected कोशिकाओं Lyse.
    10. ल्यूसिफेस प्रोटीन सामग्री के मापन के लिए, सेल lysate के 20 डिग्री सेल्सियस और luciferase परख बफर के 100 डिग्री एल जोड़ें (20 एमएम ग्लिसिलिजन (पीएच 8), 1 एमएम एमजीसीएल2, 0.1 एमएम ईडीटीए, 3.5 एमएम डीटीटी, 0.5 एम एम एटीपी, 0.27 एम एम कोएंजाइम ए) एक 1.5 मीटर ट्यूब में जोड़ें।
    11. एक एकल ऑटो इंजेक्शन के साथ एक Luminometer पर चरण 6.2.10 में वर्णित नमूना की संदीप्ति पढ़ें.
      नोट: luminescence पढ़ने से पहले 10 s पर एकीकृत किया जाना चाहिए.
    12. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करके एक bicinoninic एसिड परख (BCA परख) किट का उपयोग कर lysate में सेलुलर प्रोटीन की कुल राशि को मापने.
    13. कुल सेलुलर प्रोटीन प्रति सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (RLU) के रूप में luciferase जीन अभिव्यक्ति की गणना और व्यक्त करें।

7. चमकदार एटीपी परख

  1. 96 अच्छी प्लेट में 50,000 सेल/सेमी2 के घनत्व वाली कोशिकाओं को बीज दें और इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस2)में संगम तक बढ़ें।
  2. ट्रांसफेक्शन फॉर्मूलेशन के 9.7 डिग्री एल के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें (तैयारी विवरण अनुभाग 6 में हैं) और 4 ज के लिए पूर्ण वृद्धि माध्यम के 58.4 डिग्री एल।
  3. transfection मिश्रण निकालें और धीरे से पूर्व गर्म पीबीएस 1x बफर के साथ कोशिकाओं को धोने के लिए दो बार उपचार अभिकर्मकों को पूरी तरह से हटा दें.
    नोट: अवशिष्ट बफर के विभिन्न संस्करणों अलग हद तक एटीपी परख अभिकर्मकों पतला सकता है और संभावित रूप से डेटा को प्रभावित कर सकते हैं.
  4. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर एक 1:1 कमजोर पड़ने में ताजा पूर्व-गर्म मध्यम और एटीपी परख अभिकर्मक के 75 डिग्री एल मिक्स। सुनिश्चित करें कि सभी मल्टीचैनल पिपेट युक्तियों में तरल स्तर समान है।
  5. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एक nutating शेकर पर प्लेट रखें. अभिकर्मकों को जोड़ने के 15 मिनट के बाद, एक सफेद 96-अच्छी प्लेट में प्रत्येक नमूने के 60 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण.
    नोट: सफेद प्लेटें स्पष्ट या काले प्लेटों की तुलना में उत्पादन प्रकाश को प्रतिबिंबित करने के लिए बेहतर कर रहे हैं.
  6. थाली पढ़ने से पहले एक सुई का उपयोग कर किसी भी हवा बुलबुले पॉप. एक 1 s एकीकरण समय के साथ एक luminometer पर प्लेट पढ़ें. एटीपी परख अभिकर्मकों को जोड़ने के बाद 20 मिनट के भीतर थाली पढ़ें. समय विभिन्न प्लेटों भर में तुलना के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि संदीप्ति संकेत एक तेजी से क्षय दर के साथ क्षणिक है.
  7. प्रतिशत की गणना करें (%) इस सूत्र का उपयोग कर सेल व्यवहार्यता: (ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं की चमक / नियंत्रण के संदीपन, अनुपचारित कोशिकाओं) x 100.

8. तंग जंक्शन प्रोटीन की माप के लिए पश्चिमी सोख्ता $O-1

  1. सेल lysis और प्रोटीन निष्कर्षण
    नोट: कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सभी चरणों 2-8 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए।
    1. कोलेजन लेपित 12-वेल ऊतक संस्कृति प्लेट में 50,000 सेल/सेमी2 के घनत्व पर कोशिकाओं को बीज।
    2. दिन 3, दिन 5, दिन 7, दिन 10 के बाद बीज और 7 दिन (कोशिकाओं कैल्शियम मुक्त माध्यम के साथ पूर्व इनक्यूबेट्ड), विकास माध्यम को हटाने और धीरे से बर्फ ठंडा 1x PBS के 2 एमएल के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें. फिर, प्रत्येक कुएं में 3 ग्राम/एमएल एप्रोटिनिन युक्त बर्फ-ठंडा 1x RIPA lysis बफर का 300 डिग्री एल मिश्रण जोड़ें।
      नोट: मिश्रण ताजा बनाया और बर्फ पर रखा जाना चाहिए. एप्रोटिनिन का उपयोग लाइसेट्स में मौजूद प्रोटीज़ को ब्याज के प्रोटीन को नीचा दिखाने से रोकने के लिए किया जाता है।
    3. दो फ्रीज-थॉव चक्र (-80 डिग्री सेल्सियस) के बाद, एक ठंडे प्लास्टिक सेल खुरचनी का उपयोग कर कोशिकाओं को परिमार्जन करें। माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में कोशिका lysates लीजिए. फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रण।
    4. साफ ट्यूबों में supernatant ले लीजिए और उन्हें बर्फ पर जगह है। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करके बीसीए परख किट का उपयोग lysates में सेलुलर प्रोटीन की कुल राशि को मापने.
  2. तंग जंक्शन प्रोटीन का पता लगाने के लिए पश्चिमी सोख्ता $O-1
    1. 95 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट और इलेक्ट्रोफोरोसिस के अधीन 6-7.5% सोडियम डोडिसिल सल्फेट पॉलीऐक्रिलमाइड जेल (एसडीएस-पेज) (90 वी, 10 मिंथ के माध्यम से जेलिंग जेलिंग के माध्यम से 10 मिनिंग, 10 मिनिंग के साथ कुल प्रोटीन के 40 ग्राम युक्त) के डिनेचर एलिजेनेट्स हल जैल).
      नोट: जब नमूने या मानकों लोड हो रहा है, धीरे धीरे और ध्यान से प्रत्येक लेन में लोड करने के लिए याद है, इस प्रक्रिया में अच्छी तरह से तोड़ने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है.
    2. पीएच 8.5 हस्तांतरण बफर के साथ एक नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली पर अलग प्रोटीन स्थानांतरण जिसमें 192 एम एम ग्लिसिन, 25 एम एम ट्राइस बेस, 10% मेथनॉल और 0.1% एसडीएस (75 वी, कमरे के तापमान पर 110 मिनट) शामिल हैं।
      नोट: झिल्ली को मत छूओ। झिल्ली को संभालने के लिए 70% आइसोप्रोपेनॉल-वॉश्ड प्लास्टिक संदंश का उपयोग करें। $O-1 प्रोटीन (MW 200 kDa) को झिल्ली में सफलतापूर्वक स्थानांतरित करने के लिए, पीएच 8.3-8.5 के आसपास होना चाहिए। यदि स्थानांतरण बफर उससे अधिक अम्लीय है, तो स्थानांतरण नहीं होगा। यदि सीढ़ी बैंड जेल पर अभी भी दिखाई दे रहे हैं, यह हस्तांतरण समय और एसडीएस एकाग्रता बढ़ाने के लिए उपयोगी होगा.
    3. 0.1%Tween 20 (टी-टीबीएस) युक्त Tris-buffered नमकीन का उपयोग करके झिल्ली धोने के बाद, 60 मिनट के लिए झिल्ली को ब्लॉक करने के लिए ब्लॉक समाधान (1:1 LiCOR-Odysey ब्लॉक: 1x Tris बफर नमकीन) का उपयोग करें।
    4. ध्यान से दो स्ट्रिप्स में झिल्ली में कटौती. दो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट (जेडओ-1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, कमजोर पड़ने, 1: 900, और ग्लिसरलेडिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजेनेज (जीएपीडीएच) एंटीबॉडी, तनुकरण, 1: 10,000) रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर। फिर, जेडओ-1 और गैपडीएच झिल्ली को गधे एंटी-माउस आईजीजी (डिल्यूशन, 1:50,000) के साथ इनक्यूबेट करें। टी-टीबीएस का उपयोग करके झिल्ली धोने के बाद, 16-बिट इमेजर पर 700 चैनल में झिल्ली को छवि बनाएं।

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Representative Results

सबसे पहले, हम TJ गठन की स्पष्ट गतिजता निर्धारित करने के लिए LY पारगम्यता पर समय culturing के प्रभाव का निर्धारण किया. दिन 1 से 10-पोस्ट बोने के लिए मतलब LY Pएप्लिकेशन मान चित्र 2aमें दिखाए गए हैं। 1 दिन, मतलब पीएप्लिकेशन 4.25 x 10-4 सेमी/ मतलब पीएप्लिकेशन मान थोड़ा 3 पर 3.93 x 10-4 सेमी/ पीएप्लिकेशन मूल्यों काफी दिन 1 (पी एंड एलटी; 0.05) की तुलना में दिन 7 पर 2.36 x 10-4 सेमी/ पीएप्लिकेशन मान 2.14 x 10-4 और 2.36 x 10-4 सेमी/मिनट के बीच की सीमा में स्थिर 7 दिन से 10 दिन के लिए, जो निहित बाधा गठन पूरा हो गया था और कार्यात्मक कम LY paracellular परिवहन में जिसके परिणामस्वरूप. हमने प्रतिशत की गणना की (%) LY ca. 80% होने के लिए प्रत्येक दिन पर बरामद, मज़बूती से पीएप्लिकेशन मान27 (Figure 2b)की गणना करने के लिए इष्टतम माना जाता है कि एक मूल्य। वसूली% LY परख में एक महत्वपूर्ण सूचकांक है. उदाहरण के लिए, यदि कोशिकाओं को सबसे अधिक metabolize, LY कोशिकाओं में स्थिर है या कोशिका झिल्ली या ऊष्मायन के दौरान LY degrades के लिए चिपक जाती है, यह व्याख्या करने के लिए गलत होगा कि basolateral डिब्बे में कम LY संकेत मनाया एक तंग बाधा इंगित करता है. इस प्रकार, recovery% अधिक विश्वास है कि हम एक या अधिक के कारण LY की महत्वपूर्ण राशि खो नहीं था ऊपर संभावनाओं में से एक और देता है और आत्मविश्वास से LY पीएप्लिकेशन मूल्यों का अनुमान लगाने के लिए अनुमति देता है देता है। जैसा कि परिचय अनुभाग में पहले उल्लेख किया गया है, बासोपार्श्व पक्ष में लए अधिक सांद्रता एक अपूर्ण बाधा को इंगित करती है जबकि निम्न सांद्रता प्रतिबंधित परिवहन को प्रतिबिंबित करती है, कार्यात्मक की उपस्थिति के कारण परिपक्व, पूर्ण अवरोध का सुझाव देती है टी.जे.एस. हम भी एक लंबकोणीय तकनीक का उपयोग कर अतिरिक्त सबूत प्रस्तुत, $O-1 प्रोटीन के पश्चिमी blotting का पता लगाने (चित्र4), पुष्टि करने के लिए कि एलई पीअनुप्रयोग में मनाया परिवर्तन तंग जंक्शनों के गठन के साथ संबंधित है.

चूंकि ट्रांसवेल डालने सेटअप सीधे सेल घनत्व में परिवर्तन को ट्रैक करने की अनुमति नहीं है, हम एक मानक Trypan नीले बहिष्करण परख का उपयोग कर सेल घनत्व में परिवर्तन निर्धारित किया. इसलिए हम एक पारदर्शी ऊतक संस्कृति प्लेट है कि आसानी से हमें सेल विकास गतिजता की निगरानी करने की अनुमति पर सेल घनत्व में परिवर्तन निर्धारित किया. सेल घनत्व में 5.5 से वृद्धि 1.0 x 104 कोशिकाओं/सेमी2 से 1.9 तक 0.2 x 105 कोशिकाओं/सेमी2 दिन 1 से 10-पोस्ट सीडिंग (चित्र 3) 0.94 के प्रतिगमन गुणांक के साथ रैखिक थी। इन आंकड़ों से यह भी पता चलता है कि लपके हुए पप (चित्र 2क)में प्रेक्षित परिवर्तन 10 दिन की अवधि में एक प्रवाही मोनोलेयर के गठन का परिणाम है। हम प्रत्येक दिन पर एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को देखा और नेत्रहीन कोशिका संख्या और मोनोलेयर गठन में एक क्रमिक वृद्धि प्रलेखित.

हमने समय के साथ तंग जंक्शन प्रोटीन $ओ-1 की अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाने के लिए पश्चिमी सोख्ता का उपयोग किया (चित्र 4)। $O-1 अभिव्यक्ति में परिवर्तन orthogonally LY Pएप्लिकेशन डेटा के पूरक और LY Pअनुप्रयोग में मनाया परिवर्तन एक तंग बाधा के गठन को इंगित करता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। $O-1 बैंड तीव्रता densitometry द्वारा विश्लेषण किया गया और एक हाउसकीपिंग जीन की अभिव्यक्ति के सापेक्ष सामान्यीकृत, GAPDH. चित्र 3क के दो बैंड दो $ओ-1 समरूपों (जO-1़् + तथा जो्व-1$-28का प्रतिनिधित्व करते हैं । डेन्सिटोमेट्री विश्लेषण से पता चला है कि $O-1 के पिक्सेल मूल्य दिन से वृद्धि हुई 3-7 के बाद बीज, सुझाव है कि TJ प्रोटीन $O-1 दिन से लगातार गठन 3-7. दिन 7 के बाद बीज पर कैल्शियम की कमी उपचार के बाद, $O-1 के बैंड लगभग undetectable था, जो इंगित करता है कि $O-1 कैल्शियम आयनों के अभाव में फार्म करने में असमर्थ था. इसके अलावा, $O-1 के पिक्सेल मूल्य उल्लेखनीय रूप से दिन में कमी आई 10 के बाद बीज. दिन 3-10 से GAPDH के संकेत तीव्रता तुलनीय दिखाई दिया, 7 दिन को छोड़कर जब कोशिकाओं कैल्शियम मुक्त माध्यम के साथ इलाज किया गया. कैल्शियम का इलाज कोशिकाओं में कम GAPDH अभिव्यक्ति के लिए एक संभावित कारण कम कुल प्रोटीन के कारण हो सकता है (28.9 ग्राम कुल प्रोटीन), फिर से, कैल्शियम की कमी के कारण होने की संभावना. कुल मिलाकर, बैंड densitometry विश्लेषण दिन 7 तक $O-1 अभिव्यक्ति (GAPDH के सापेक्ष) में एक क्रमिक वृद्धि और दिन 10 पर अभिव्यक्ति में कमी से पता चला जब कोशिकाओं को पूरा विकास के माध्यम में सुसंस्कृत. विश्लेषण भी कैल्शियम मुक्त माध्यम के साथ इलाज कोशिकाओं में 7 दिन पर $O-1 (GAPDH के सापेक्ष) की एक कम अभिव्यक्ति से पता चला.

जबकि इस काम का ध्यान एक monolayer गठन की गतिज निर्धारित करने के लिए एक विधि के रूप में LY Pअनुप्रयोग परख पेश करने के लिए है, विकसित परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए, हम निर्धारित किया है कि डीएनए एनपी transfection TJ बाधा को प्रभावित किया HCMEC/D3 कोशिकाओं के माध्यम से LY Pअनुप्रयोग को मापने के द्वारा अखंडता 4 ज पोस्ट-ट्रांसफेक्शन (चित्र 5)। हमारे डीएनए एन पी एस जिसमें पोलोक्सामर पी84 हार्ड-टू-ट्रांसफेक्ट एचसीएमईसी/डी 3 सेल लाइन में जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को नियंत्रित करते हैं (चित्र 6क)। विशेष रूप से, हम यह निर्धारित करना चाहते थे कि हमारे डीएनए एनपी में पोलोक्सामर पी 84 के हाइड्रोफोबिक डोमेन ट्रांसफेेक्टेड कोशिकाओं में टीजे अखंडता को परेशान कर सकते हैं या नहीं। प्रत्येक उपचार समूह में बरामद %LY ca. 92% था, यह सुझाव देता है कि परिकलित Pऐप मान विश्वसनीय हैं (चित्र 5b)। हमने नोट किया कि विभिन्न योगों का उपयोग कर transfection प्रक्रिया LY Pअनुप्रयोगको प्रभावित नहीं किया, अकेले LY के संपर्क में गैर-transfected कोशिकाओं के सापेक्ष. बाह्य कोशिकीय कैल्शियम विभिन्न कोशिकाओं में सेल-सेल जंक्शनों के रखरखाव के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है29,30,31, मस्तिष्क microvesel endothelial कोशिकाओं सहित. इस प्रकार, कैल्शियम मुक्त माध्यम (सीएफएम) में कोशिकाओं को बनाए रखने के कारण टीजे32,33का विघटन होता है। इसलिए, हम एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 24 एच के लिए CFM के साथ इलाज कोशिकाओं का इस्तेमाल किया.

हमारे डेटा से पता चलता है कि CFM के साथ incubated कोशिकाओं के लिए LY पीएप्लिकेशन को नियमित रूप से विकास के माध्यम के साथ incubated नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में 2 गुना अधिक था। पीअनुप्रयोग में यह 100% वृद्धि से पता चलता है कि कोशिकाओं को अपने गठन के लिए आवश्यक कैल्शियम आयनों के नुकसान की वजह से अपने TJs खो दिया था. विशेष रूप से, वास्तविक मूल्य (5.14 x 10-4 सेमी/मिनट) दिन 1-6 पोस्ट सीडिंग से औसत पीएप्लिकेशन मूल्य से थोड़ा अधिक था (चित्र 2) जब TJs अभी तक पूरी तरह से गठन नहीं किया गया था। Albeit महत्वपूर्ण नहीं है, 0.01-0.03% Poloxamer P84 युक्त डीएनए एनपी के साथ transfected कोशिकाओं नियमित संस्कृति माध्यम में बनाए रखा अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में LY पीएप्लिकेशन मूल्यों में एक छोटे से वृद्धि दिखाई. इस अवलोकन से पता चला कि डीएनए एनपी + पी 84 ट्रांसफेक्शन का टीजे बाधा अखंडता पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा। कुल मिलाकर, transfected कोशिकाओं में एलई पीएप्लिकेशन मान लगभग औसत करने के लिए 2.5x10-4 सेमी/ कार्यात्मक TJs है कि प्रभावी ढंग से LY paracellular परिवहन प्रतिबंधित की उपस्थिति का सुझाव.

हम यह दिखाने के लिए अतिरिक्त ट्रांसफ़ेक्शन डेटा प्रस्तुत करते हैं कि LY Pअनुप्रयोग में परिवर्तनों की कमी (चित्र 5) असंगत प्रेक्षण नहीं है. डीएनए एन पी एस + पी 84 समूह में पाए जाने वाले ट्रांसफेक्शन के उच्च स्तर के बावजूद, हमने LY Pऐप में कोई परिवर्तन नहीं नोट किया है जो यह सुझाव देता है कि हमारे योगTJ बाधा को परेशान न करें। नग्न डीएनए का इलाज कोशिकाओं में अपेक्षाकृत कम transfection दक्षता विशिष्ट है क्योंकि प्लाज्मिड डीएनए के anionic प्रकृति (अपनी रीढ़ की हड्डी में फॉस्फेट समूहों के कारण) और इसकी हाइड्रोफिलिक प्रकृति सीमा सेलुलर तेज. डीएनए एनपी में सघन डीएनए एनपी ने नग्न पी डी ए की तुलना में ट्रांसफेक्शन में 50 गुना वृद्धि की (चित्र 6). डीएनए एनपी में 0.01% पी 84 के अलावा डीएनए एनपी-अलोन (पी एंड एलटी; 0.01) की तुलना में 18 गुना वृद्धि हुई। 0.03 wt.% करने के लिए P84 एकाग्रता में वृद्धि डीएनए एनपी अकेले की तुलना में 30 गुना वृद्धि हुई (पी एंड एलटी; 0.001). ये परिणाम उल्लेखनीय हैं कि मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं एक हार्ड-टू-ट्रांसफेक्ट सेल प्रकार हैं.

हमने यह पुष्टि करने के लिए विभिन्न परिस्थितियों में ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं की कोशिका व्यवहार्यता को मापा कि ट्रांसफेलेशन प्रक्रिया सेल तनाव का कारण नहीं है। एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) जीवन की ऊर्जा मुद्रा है और सेलुलर चयापचय समारोह को दर्शाता है। हम एक luciferase आधारित एटीपी परख जहां luminescence मूल्यों सीधे एटीपी स्तर के लिए आनुपातिक हैं इस्तेमाल किया. Posime एट अल ने बताया कि luminescence एटीपी परख चयापचय कोशिका व्यवहार्यता34का एक मजबूत उपाय था. विभिन्न फार्मूलों द्वारा ट्रांसफेक्टेड एचसीएमईसी/डी3 कोशिकाओं की कोशिका व्यवहार्यता अनुपचारित कोशिकाओं के बराबर थी ( चित्र 5ख), यह सुझाव देते हुए कि एटीपी स्तर भी समान थे। इसलिए, POLOxamer P84 युक्त डीएनए एन पी (0.01% से 0.03% w/w) सुरक्षित जीन वितरण योगहैं हैं।

Figure 1
चित्र 1 . LY P के लिए प्रायोगिक सेटअप ऐप अध्ययन| 24-वेल आवेषण युक्त 24-वेल प्लेट सेटअप (एक उदाहरण के रूप में डीएनए नैनोकण ट्रांसफेक्शन को दिखाने के लिए अनुकूलित, चित्र 5में डेटा)। प्रत्येक स्तंभ 4 ज नियंत्रण के लिए संकेत नमूने के साथ इलाज किया गया था hCMEC/D3 कोशिकाओं को पूर्ण विकास माध्यम के साथ इलाज इंगित करता है, जबकि कैल्शियम कमी 24 एच इंगित करता है कि कोशिकाओं को कैल्शियम मुक्त माध्यम के साथ incubated LY जोखिम से पहले किया गया. सही टेम्पलेट एक काले 96 अच्छी तरह से थाली में LY फ्लोरोसेंट तीव्रता माप दर्शाया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . TJ बाधा गठन की जाहिरा गतिजता LY P का उपयोग कर निर्धारित ऐप परख| (एक) लई पी ट्रांसवेल आवेषण पर सुसंस्कृत hCMEC/D3 मोनोलेयर्स के माध्यम से एप्लिकेशन को हर रोज पोस्ट-सीडिंग कोशिकाओं को मापा जाता था। (ख) %LY प्रत्येक उपचार समूह में बरामद. डेटा औसत का प्रतिनिधित्व करता है - दो स्वतंत्र प्रयोगों के एसडी (n $3/प्रयोग). सांख्यिकीय तुलना unpaired टी परीक्षण का उपयोग कर किए गए (*पीऔर lt; 0.05, एन एस महत्वपूर्ण नहीं). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 3
चित्र 3 . कोशिका विकास के काइनेटिक्स एक ट्रिपन ब्लू बहिष्करण परख का उपयोग कर निर्धारित किया। hCMEC/D3 कोशिकाओं को 50,000 कोशिकाओं/सेमी2के सेल घनत्व पर 24-वेल प्लेट में बीजित किया गया था। प्रयोग के प्रत्येक दिन, कोशिकाओं को अलग किया गया और एक हेमीस्टोमीटर पर व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती से पहले 0.4% Trypan नीले रंग की बराबर मात्रा के साथ मिश्रित. डेटा तीन स्वतंत्र माप के औसत - एसडी का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . ओओ-1 अभिव्यक्ति की स्पष्ट गतिजता पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके पाई गई। (ं)एचसीएमईसी/डी3 कोशिकाओं को 12 कूप प्लेट में 50,000 कोशिकाओं/ प्रयोग के प्रत्येक दिन (दिन 3, दिन 5, दिन 7 और दिन 10-पोस्ट बोने), कोशिकाओं 1x RIPA बफर के 400 $L द्वारा lysed थे 3 g/ कुल प्रोटीन के 40 डिग्री ग्राम युक्त सेल lysates एक 4-7.5% एसडीएस-पॉलीऐक्रिलमाइड जेल पर लोड किए गए थे। (ख) बैंड डेन्सिटोमेट्री विश्लेषण ने जीएपीडीएच को $ओ-1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सामान्य करने की अनुमति दी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 5
चित्र 5 . टीजे बाधा जकड़न पर डीएनए एनपी transfection के प्रभाव LY पी का उपयोग कर मापा ऐप परख| (क) hCMEC/D3 कोशिकाओं को 7 दिनों के लिए ट्रांसवेल आवेषण पर सुसंस्कृत किया गया था, खूंटी-डीईटी के साथ ट्रांसफेक्ट किया गया जिसमें gWIZLuc प्लाज्मिड डीएनए के साथ/ HCMEC/D3 कोशिकाओं 4 एच के लिए विकास के माध्यम के साथ incubated LY जोखिम के बाद (n $4, *Pऔर lt;0.05, एन एस महत्वपूर्ण नहीं). (ख) %LY प्रत्येक उपचार समूह में बरामद, प्रस्तुत मूल्यों औसत हैं - एसडी (द ] 4) . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 6
चित्र 6 . डीएनए एन पी एस एच सीएमईसी/डी 3 मोनोलेयर्स में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तरको मध्यस्थता करता है। (क) hCMEC/D3 कोशिकाओं को 7 दिन सुसंस्कृत किया गया था और PEG-DET के साथ transfected युक्त gWIZLuc प्लाज्मिड डीएनए के साथ / जीन अभिव्यक्ति को मापने से पहले मध्यम. ल्यूसिफेस जीन अभिव्यक्ति के स्तर को सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरएलयू) के रूप में व्यक्त किया गया था जो कुल सेलुलर प्रोटीन सामग्री के लिए nornalized था। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत एसडी प्रस्तुत करता है. सांख्यिकीय तुलना unpaired टी-परीक्षण (* * पीएंड एलटी; 0.01, * * पीऔर 0.001) का उपयोग कर बनाया गया था। (ख) डी एन एन एन एच सी एम सी/डी 3 मोनोलेयरों में सुरक्षित ट्रांसफेक्शन फॉर्मूलेशन हैं। सेल व्यवहार्यता पर डीएनए डीएनए एनपी ट्रांसफेक्शन के प्रभाव का मूल्यांकन एक चमकदार एटीपी परख का उपयोग करके किया गया था। hCMEC/D3 कोशिकाओं 4 एच के लिए संकेत नमूनों के साथ transfected थे जिसके बाद एटीपी परख निम्नलिखित निर्माता के प्रोटोकॉल द्वारा आयोजित किया गया था. प्रतिशत (%) कोशिका व्यवहार्यता की गणना इस प्रकार की गई थी: (ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं/नियंत्रण की संदीप्ति, अनुपचारित कोशिकाओं)x100. डेटा औसत का प्रतिनिधित्व करता है - दो स्वतंत्र प्रयोगों के एसडी (n $3/प्रयोग). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रायोगिक सेटअप नमूना नाम 1mg/एमएल प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा (जेडएल) 10 एमएम NaAc बफर की मात्रा, पीएच 5 (जेडएल) 5 मिलीग्राम/एमएल बहुलक (जेडएल) की मात्रा 10% w/w. P84 ($L) की मात्रा वृद्धि माध्यम की मात्रा (जेडएल)
ऊतक संस्कृति एकसम्मिलित करता है नियंत्रण, अनुपचारित कक्ष 0 0 0 0 58.3
नग्न डीएनए 0.157 8.143 50
डीएनए एनपी 7.843 0.3
डीएनए एनपी + 0.01%P84 7.6681 0.1749
डीएनए एनपी + 0.03%P84 7.26 0.0583
48-वेल प्लेट नियंत्रण, अनुपचारित कक्ष 0 0 0 0 175
नग्न डीएनए 0.5 24.5 150
डीएनए एनपी 23.56 0.94
डीएनए एनपी + 0.01%P84 23.385 0.175
डीएनए एनपी + 0.03%P84 23.035 0.525
96-वेल प्लेट नियंत्रण, अनुपचारित कक्ष 0 0 0 0 68.1
नग्न डीएनए 0.195 58.4
डीएनए एनपी 9.35 0.37
डीएनए एनपी + 0.01%P84 8.9307 0.0681
डीएनए एनपी + 0.03%P84 9.0669 0.2043

तालिका 1. रिपोर्ट किए गए आंकड़ों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एनपी फार्मूलेशन।

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Discussion

BBB की एक महत्वपूर्ण भूमिका के लिए प्रणालीगत परिसंचरण और मस्तिष्क के बीच गैर जरूरी आयनों और विषाक्त पदार्थों के आदान-प्रदान को रोकने के लिए तंत्रिका microenvironment के hemostasis बनाए रखने के लिए है. BBB की विशेषता विशेषताओं में से एक प्रभावी ढंग से परिवहन के paracellular मार्ग सील कि तंग जंक्शनों (TJs) बनाने के लिए केशिका endothelial कोशिकाओं की क्षमता है। हम सुसंस्कृत HCMEC/D3 monolayers में टीजे बाधा गठन के स्पष्ट गतिजता निर्धारित करने के लिए एक मात्रात्मक विधि के रूप में एक LY Papp परख का प्रदर्शन किया। ओओ-1 अभिव्यक्ति पश्चिमी blotting orthogonally LY Pअनुप्रयोग अध्ययन से डेटा मान्य के रूप में निम्नलिखित पैरा में विस्तार से चर्चा के माध्यम से पता चला. विकसित परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता के रूप में, हम आगे प्रदर्शन किया है कि डीएनए एनपी transfection measurably एक प्रयोगात्मक सेटअप में टीजे बाधा विशेषताओं में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस परख की उपयुक्तता का संकेत LY पीएप्लिकेशन को बदल नहीं किया।

पश्चिमी दाग के आंकड़ों से पता चला है कि दिन 3, 5, 7-पोस्ट सीडिंग और दिन में मामूली कमी के दिन ओ-1 अभिव्यक्ति में स्पष्ट वृद्धि हुई है (चित्र 4क). चित्रा 1से, यह देखा जा सकता है कि एलई पीएप्लिकेशन टीजे के गठन का सुझाव देते हुए दिन 1-7 के बाद बीज से कम हो गया है। कैल्शियम की कमी के उपचार के बाद , लपने एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई (चित्र 2क) जबकि ज़ो-1 अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय कमी दिखाई दी ( चित्र4क). बाह्य कोशिकीय कैल्शियम विभिन्न कोशिकाओं में सेल-सेल जंक्शनों के रखरखाव के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है29,30,31, मस्तिष्क microvesel endothelial कोशिकाओं सहित. विकास माध्यम में कैल्शियम की कमी ने टीजे33को बाधित और असंबद्ध कर दिया . जैसा कि उम्मीद थी, कैल्शियम से वंचित कोशिकाओं का पीऐप मान अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक था और रिक्त आवेषण ोंवाला के पीऐप मान के करीब था जिसमें कोई कक्ष नहीं था ( चित्र2क). लय ने पीऐप मूल्यों में एक स्थिर पठार का पता लगाया जो दिन 7-10 के बाद -सीडिंग (चित्र 2क) से यह सुझाव देता है कि अवरोध 7 दिन तक पूरी तरह से बन गया था जिसके परिणामस्वरूप बैसोपार्श्व की ओर लड परिवहन प्रतिबंधित हो गया था। पश्चिमी दाग डेटा दिन 7 पोस्ट बोने की तुलना में 10 दिन पर $O-1 अभिव्यक्ति में थोड़ी कमी दिखाई. प्रेक्षण में यह अंतर बाधा जकड़न को बनाए रखने में अन्य extracellular प्रोटीन के योगदान के कारण होने की संभावना है, $O-1 के अलावा. संक्षेप में, हमने बीबीबी के मानव कोशिका मॉडल में तंग संधि अवरोध निर्माण की गतिजता निर्धारित करने के लिए दो लंबकोणीय तकनीकों के आंकड़ों का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। जबकि LY Pएप्लिकेशन परख TJ बाधा की कार्यक्षमता मापा, पश्चिमी धब्बा डेटा एक मार्कर प्रोटीन के रूप में जेडओ -1 का उपयोग कर TJs के गठन का पता लगाया.

विकसित परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता के रूप में, हमने पुष्टि की है कि एचसीएमईसी/डी 3 मोनोलेयर्स में डीएनए एनपी ट्रांसफेक्शन टीजे की अखंडता को प्रभावित नहीं करता है (चित्र 5)। विकास माध्यम के साथ इनक्यूबेट की गई अशोधित कोशिकाओं का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था और 24 एच के लिए कैल्शियम मुक्त माध्यम के साथ पूर्व इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। कोशिकाओं में TJs कैल्शियम की कमी का एक परिणाम के रूप में बाधित किया गया अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में एलआई पीअनुप्रयोग में 210% वृद्धि दिखाई. हमारे डेटा से पता चलता है कि डीएनए एनपी transfection या तो उपस्थिति या P84 की अनुपस्थिति में TJ अखंडता को प्रभावित नहीं करता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि transfected कोशिकाओं में LY Pएप्लिकेशन परिवर्तन की कमी एक अप्रासंगिक अवलोकन नहीं है। वास्तव में, हमारे डीएनए एन पी एस हार्ड-टू-ट्रांसफेक्ट एचसीएमईसी/डी 3 मोनोलेयर्स9,35,36,37में जीन अभिव्यक्ति के महत्वपूर्ण स्तरों को मध्यस्थता करते हैं । डीएनए एनपी युक्त 0.01 या 0.03 wt. % P84 वृद्धि हुई luciferase जीन अभिव्यक्ति ca. 18 और 30 गुना, क्रमशः, डीएनए NPs की तुलना में अकेले (चित्र 6a)। हमने यह भी प्रदर्शित किया है कि हमारे एनपी उपचार सेलुलर एटीपी स्तर पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं डालते हैं, जो यहां कार्यात्मक सेल व्यवहार्यता के सूचक के रूप में प्रयुक्त होते हैं (चित्र 6ख)। हमारे परिणाम एक प्रयोगात्मक transfection सेटअप में TJ बाधा अखंडता निर्धारित करने के लिए इस LY Pएप्लिकेशन परख का विस्तार उपयोगिता को रेखांकित.

लय परख के निष्पादन में एक महत्वपूर्ण कदम यह है कि संपूर्ण प्रयोग में विभिन्न समय बिंदुओं के पार शीर्ष पक्ष में लब्नेस की समान मात्रा और परिवहन बफर की समान मात्रा को बनाए रखना है। यदि यातायात बफर के LY या असमान मात्रा में विभिन्न मात्रा में कुओं में इस्तेमाल किया गया था, पीअनुप्रयोग की गणना अविश्वसनीय होगा, कृत्रिम रूप से बड़े मानक विचलन में जिसके परिणामस्वरूप. एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू LY फ्लोरोसेंट तीव्रता के क्षय को कम करने के लिए प्रकाश जोखिम को सीमित करने के लिए है। इसके अलावा, तरल को पूरी तरह से हटाने की जरूरत है LY समाधान की सटीक एक ही मात्रा जोड़ने से पहले और शीर्ष पक्ष और basolateral पक्ष में परिवहन बफर, क्रमशः. यह सुनिश्चित करता है कि फ्लोरोसेंट readout मज़बूती से पीअनुप्रयोग गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रयोग में एक और महत्वपूर्ण कदम तुरंत basolateral नमूनों की LY फ्लोरोसेंट को मापने और संग्रह के बाद नमूने फ्रीज करने की आवश्यकता से बचने के लिए है. LY युक्त नमूनों को फ्रीज-थॉव चक्र के अधीन करने के परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट सिग्नल का एक बड़ा अंतर-समूह भिन्नता होती है। ट्रांसवेल सेटअप का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि लाइव कोशिकाओं को पारंपरिक माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करना मुश्किल है या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि बनाई गई है। इसके अलावा, यह आसान एक सेटअप है कि सह विभिन्न सेल प्रकार की अनुमति देता है में अनुवाद नहीं करता है जब तक कहते हैं, glial और endothelial कोशिकाओं के मिश्रित culturing एक संभावना है. फिर भी, LY परख निम्नलिखित फायदे हैं: LY अलग उत्तेजना / उत्सर्जन चोटियों के साथ एक डाई है और सोडियम fluorescein जैसे रंगों की तुलना में एक अपेक्षाकृत बड़े Stokes बदलाव, जो BBB पार जांच के एक मजबूत माप के लिए अनुमति देता है और बचा जाता है इस तरह के सुक्रोज या मैनिटॉल के रूप में अनुरेखकों के मामले में के रूप में अतिरिक्त रेडियोलेबल की आवश्यकता है। LY के उच्च पुनर्प्राप्ति %s आत्मविश्वास से Pएप्लिकेशन मानों की गणना करने के लिए विश्वसनीय डेटा प्रदान करता है.

हमारे निष्कर्षों के आधार पर, हम निष्कर्ष है कि LY Pएप्लिकेशन विधि hCMEC/D3 सेल monolayers भर में paracellular permeability मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल और मजबूत परख है। LY Pएप्लिकेशन विधि का उपयोग करके, हम बरकरार बाधा के गठन के लिए संस्कृति समय अनुकूलित, और हम डीएनए एनपी-ट्रांसफेटेड सेल monolayers में टीजे अखंडता का निर्धारण करके विकसित परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता का प्रदर्शन किया।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ फार्मेसी से 2017 के नए अन्वेषक पुरस्कार से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं, डुकस्ने विश्वविद्यालय से एक Hunkele dreaded रोग पुरस्कार और Manickam प्रयोगशाला के लिए फार्मेसी शुरू हुआ धन के स्कूल. हम पश्चिमी blotting सहायता के लिए रिसाव प्रयोगशाला (डुकस्ने विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं और उनके ओडिसी 16-बिट imager के उपयोग की अनुमति. हम पश्चिमी सोख्ता के साथ मदद के लिए कांदरद दवे (मानिकम प्रयोगशाला) के लिए प्रशंसा का एक विशेष नोट भी शामिल करना चाहेंगे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hCMEC/D3 cell line Cedarlane Laboratories 102114.3C-P25 human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLuc Aldevron  5000-5001 Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt  Invitrogen 155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes Falcon 353095
Tissue culture flask  Olympus Plastics 25-207
24-well Flat Bottom  Olympus Plastics 25-107
Black 96-Well Immuno Plates  Thermo Scientific 437111
S-MEM 1X Gibco 1951695 Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2 Clonetics CC-3156 Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1X HyClone SH3025601
Collagen Type I  Discovery Labware, Inc. 354236
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent  Promega E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt  Promega E1601
SpectraMax i3  Molecular Devices Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody  ThermoFisher 61-7300
anti-GAPDH antibody abcam ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) Jackson ImmunoResearch Inc 128817
12-well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-106
RIPA buffer (5X) Alfa Aesar J62524
Aprotinin Fisher BioReagents BP2503-10
Odyssey CLx imager LI-COR Biosciences for scanning western blot membranes

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 150 ल्यूसिफर पीला पैरासेल्यूलर पारगम्यता रक्त मस्तिष्क बाधा एचसीएमईसी/
Lucifer पीला - मानव रक्त मस्तिष्क बैरियर के एक सेल मॉडल में एक मजबूत Paracellular स्थायित्व मार्कर
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Zhao, W., Han, L., Bae, Y.,… More

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).

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