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Bioengineering

Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

doi: 10.3791/58900 Published: August 19, 2019

Summary

Nós apresentamos um ensaio da fluorescência para demonstrar que o amarelo de Lucifer (ly) é um marcador robusto para determinar a permeabilidade transcelulares paracelulares aparente de monolayers da pilha de hcmec/D3, um in vitro modelo da barreira Human do sangue-cérebro. Utilizou-se este ensaio para determinar a cinética de formação de monocamada confluente em células hCMEC/D3 cultivadas.

Abstract

A barreira sangue-cérebro BBB consiste em células endoteliais que formam uma barreira entre a circulação sistêmica e o cérebro para evitar a troca de íons não essenciais e substâncias tóxicas. Junções apertadas (TJ) efetivamente selar o espaço paracelular nas monocamadas resultando em uma barreira intacta. Este estudo descreve um ensaio de fluorescência com base em ly que pode ser usado para determinar o seu coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) e, por sua vez, pode ser usado para determinar a cinética da formação de monocamadas confluentes e a junção apertada resultante integridade de barreira em monocamada de hCMEC/D3. Nós demonstramos mais uma utilidade adicional deste ensaio para determinar a integridade funcional de TJ em pilhas transfected. Nossos dados do ensaio doaplicativo ly P mostram que as células hCMEC/D3 semeadas em uma configuração de transpoços efetivamente limitam o transporte de ly paracelular 7 dias-pós cultura. Como uma utilidade adicional do ensaio apresentado, nós igualmente demonstramos que o transfection da nanopartícula do ADN não altera o transporte de ly transcelulares paracelulares em monolayers de hcmec/D3.

Introduction

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A barreira hematoencefálica (BBB) é a barreira protetora que limita o afluxo de componentes plasmáticos no tecido cerebral e consiste em células endoteliais cerebrais, juntamente com células de apoio, como pericytes. O papel principal do BBB é servir como uma barreira que sela o espaço entre o sangue periférico e o sistema nervoso central (CNS) para manter a hemostasia do microambiente neural1,2. As pilhas endothelial capilares do cérebro selam eficazmente a via transcelulares paracelulares através da formação de junções apertadas intercelular (TJs)1. Esta barreira protetora permite glicose e nutrientes selecionados para entrar no cérebro, enquanto impede a maioria dos íons, substâncias tóxicas e drogas de passar por esta barreira apertada. Aparte de seu papel protetor, a função natural da barreira do BBB levanta um desafio severo no desenvolvimento de sistemas da entrega da droga que visam o CNS.

In vitro modelos de cultura celular do BBB são ferramentas úteis para estudar a sua biologia e para compreender os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a integridade da barreira TJ. Nós usamos a linha de pilha endothelial microvascular cerebral humana (hcmec/D3) como um in vitro modelo desde que é um modelo aceitado do endotélio do cérebro humano3 e recapitula muitas funções do BBB humano. hcmec/D3is uma das linhas celulares mais comumente utilizadas para modelar o BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Apesar de seus valores comparativamente baixos de resistência elétrica transendotelial (TEER), uma medida de aperto de barreira, esta linha celular retém a maioria das propriedades morfológicas e funcionais das células endoteliais cerebrais, mesmo como uma monocultura na ausência de células gliais cocultivadas6,7. A linha celular hcmec/D3 expressa vários marcadores BBB,incluindo transportadores e receptores ativos até aproximadamente a passagem 35 sem sofrer desdiferenciação com fenótipos instáveis6,7,9 ,10,11. A característica mais marcante da linha celular hcmec/D3 como modelo in vitro BBB é sua capacidade de formar TJs5,9,11,12. Deve-se notar que, embora os modelos de BBB derivado de células-tronco mostraram maior permeabilidade em muitos estudos em comparação com a linha celular hCMEC/D3 e expressam alguns marcadores BBB, eles ainda estão a evoluir como o modelo de célula BBB mais comum13. É importante ressaltar que os modelos BBB derivados de células-tronco permanecem caracterizados em relação aos números máximos de passagem que permitem que as células mantenham fenótipos BBB estáveis14.

Três métodos primários são comumente usados para determinar a integridade da barreira TJ, incluindo a medida de TEER, medição do coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) de pequenas moléculas de traçador hidrófilo como sacarose, inulina, Lúcifer Yellow, etc. e imunocoloração de marcadores moleculares conhecidos de TJs tais como Claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER é um método relativamente simples e quantitativo que mede a resistência elétrica através das monocamadas celulares cultivadas em substrato de membrana porosa5. No entanto, os valores de TEER podem ser influenciados por variáveis experimentais como a composição do meio de cultura e o tipo de instrumento de medida. Uma provável combinação desses fatores leva a uma ampla distribuição de valores de TEER variando de 2 a 1150 Ω cm2 na linha celular hCMEC/D3 cultivada por 2-21 dias13. A imunocoloração é um método Visual para determinar a presença de proteínas TJ através da rotulagem da proteína alvo usando anticorpos. No entanto, a imunocoloração envolve uma série de etapas experimentais, incluindo a necessidade de fixar/permeabilizar as células que podem resultar em artefatos experimentais e os sinais fluorescentes podem desaparecer ao longo do tempo. Os fatores acima podem levar a erros subjetivos que afetam a qualidade dos dados.

O foco preliminar deste trabalho é apresentar um ensaio aparente da permeabilidade de ly-based determina a cinética de uma formação confluente do monocamada em pilhas hcmec/D3 cultivadas. Embora outros sistemas avançados de BBB in vitro, tais como sistemas de cocultura, sistemas microfluílicos, sejam imita fisiologicamente mais relevantes com função de barreira significativamente melhorada15,16,17, o hcmec/D3 a instalação do transwell é um modelo simples e de confiança para estimar a cinética da formação de TJ e para ràpida a tela o efeito de formulações diferentes da droga na função da barreira. Em geral, os valores de Papp são consistentes para vários solutos hidrófilos em monolayers hCMEC/D3. Por exemplo, os valores doaplicativo P relatados para vários solutos de massa molecular baixa (como sacarose, manitol, ly, etc.) em diferentes modelos de BBB in vitro estão na ordem de 10-4 cm/min5,18,19 , 20. em nossa instalação experimental, as pilhas endothelial do cérebro são semeadas em uma membrana microporosa colagénio-revestida para o acessório da pilha e a formação do monocamada para imitar a barreira in vivo. O ly adicionado no lado apical é esperado atravessar as junções apertadas intercelular e acumular-se no lado basolateral. As concentrações maiores de LY no lado basolateral indicam uma barreira imatura, não-inteiramente funcional quando umas mais baixas concentrações refletirem o transporte restrito devido à presença de TJs funcionais tendo por resultado uma barreira madura.

LY é um corante hidrófilo com picos de excitação/emissão distintos e evita a necessidade de moléculas de traçador radiomarcar como sacarose, manitol ou inulina. Assim, os valores de fluorescência de LY podem ser usados para calcular diretamente sua permeabilidade paracelular através das monocamada BBB. Também, comparado a muitos corantes comercialmente disponíveis usados em campos biomédicos que sofrem de pequenas mudanças Stokes, como fluoresceina21, a mudança Stokes de ly é de cerca de 108 nm com separação espectral suficiente, permitindo assim que os dados de fluorescência ly como um leitura robusta para determinar a permeabilidade paracelular. Nós usamos a mancha ocidental como uma técnica ortogonal para demonstrar mudanças na expressão da proteína apertada do marcador da junção, ZO-1, sobre o tempo da cultura. A expressão ZO-1 detectada via Western blotting é usada para complementar os dados doaplicativo ly p e, em combinação, esses dados sugerem que as alterações observadas nos valores doaplicativo ly p são refletivas da formação de uma monocamada com aumento gradual na expressão do marcador de junção apertado, ZO-1.

Como apontado mais cedo, o foco central deste trabalho é demonstrar um ensaio de ly como uma técnica simples para monitorar a formação de um monocamada confluente com junções apertadas funcionais. No entanto, para demonstrar uma utilidade adicional do ensaio desenvolvido, medimos oaplicativo ly P em monolayers de NANOPARTÍCULAS de DNA-transfected hCMEC/D3. Os ácidos nucleicos podem ser condensados em nanopartículas de polieletrólitos com um diâmetro de 100-200 nm através da interacção ELECTROSTÁTICA entre os grupos de polímeros carregados positivamente e os grupos fosfato negativamente carregados de ácidos nucleicos22, 23. nós nos referimos a esses complexos como nanopartículas de DNA (DNA NPS) em nosso trabalho. Enquanto nossa intenção é transfecção células e expressar a proteína desejada, devemos garantir que as propriedades de barreira das monocamada hcmec/D3 não estão comprometidas. Nossos dados sugerem que um regime padrão do transfection do gene da luciferase de 4 h não mude mensurável a permeabilidade de ly que demonstra a utilidade do ensaio doapp de ly P para determinar mudanças na integridade da barreira de TJ.

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Protocol

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cultura da pilha de 1. General hCMEC/D3

  1. Ressuscitação de células congeladas
    Nota: todos os experimentos e manutenção da cultura celular foram realizados dentro de uma capa de biossegurança estéril. Meios de cultura, suplementos e reagentes foram comprados como produtos estéreis ou esterilizados através de filtração usando um filtro de membrana de 0,22 μm para evitar a contaminação microbiana.
    1. Adicionar 8,5 mL de solução de colágeno (0,15 mg/mL) em um balão de cultura tecidual (75 cm2 área de crescimento; referida doravante como T75) e colocá-lo em uma incubadora (37 ° c, 5% co2) para 1 h.
    2. Retire a solução de colágeno e lave suavemente o balão com soro fisiológico tamponado por fosfato esterilizado (PBS). Adicione 15 mL de meio de crescimento completo ao balão e deixe na incubadora de CO2 por 15 min.
      Nota: o meio completo (concentração final) continha o crescimento basal da célula endotelial médio-2 (500 mL) suplementado com soro bovino fetal (5%), penicilina-estreptomicina (1%), hidrocortisona (1,4 μM), ascórbico ácido (5 μg/mL), lipídios quimicamente definidos concentrado (1/100), HEPES (10 mM) e fator de crescimento básico de fibroblastos (1 ng/mL).
    3. Mova um CryoVial de pilhas congeladas de hCMEC/D3 do tanque do nitrogênio líquido e descongele ràpida o tubo de ensaio em um banho de água de 37 ° c (< 1 minuto).
    4. Uma vez que apenas um pequeno floco de gelo é visível, rapidamente aspirar e transferir as células para o frasco contendo meio pré-aquecido. Agitar suavemente o balão para permitir a mistura das células com o meio de crescimento.
    5. Coloque o balão na incubadora (37 ° c, 5% CO2) e observe as células um microscópio de luz após 2 h para se certificar de que as células estão ligadas.
    6. Uma vez que as células se fixam na parte inferior do balão, retire o meio de crescimento antigo e adicione 10 mL de meio de crescimento pré-aquecido fresco para substituir o dimetilsulfóxido no meio de crescimento antigo24.
    7. Após 24 h, verifique um microscópio de luz para observar as células em forma de eixo e substitua o meio de crescimento antigo com meio de crescimento fresco pré-aquecido.
  2. Manutenção da cultura celular
    1. Reabasteça o meio de crescimento a cada outro dia até 100% de confluência. Verific as pilhas o microscópio antes de remover o meio velho do crescimento e igualmente após ter adicionado o meio fresco do crescimento. Tire o balão da incubadora e examine as células hCMEC/D3 em microscópio de contraste de fase para garantir que elas pareçam saudáveis.
      Nota: a maioria das células deve ser anexado à parte inferior do balão, tem uma morfologia em forma de eixo e muitas vezes, refracting luz em torno de suas membranas também é visto. O meio de crescimento deve ser transparente (não nublado) e cor de laranja rosado.
    2. Retire o meio de crescimento antigo do balão e transfira 10 mL de meio fresco pré-aquecido para o balão.
      Observação: o meio deve ser adicionado ao lado superior do balão e não diretamente na superfície das células para evitar afetar o acessório da célula.
    3. Gire o balão de volta na posição horizontal e balanç-o delicadamente diversas vezes e verific pilhas de hCMEC/D3 o microscópio antes de retornar o balão à incubadora (37 ° c, 5% CO2).
    4. Observe as células um microscópio de luz invertido cada vez antes e depois de manusear as células, tanto durante o trabalho de cultura regular e durante os experimentos. Registre quaisquer alterações visíveis no número da célula ou morfologia no caderno de laboratório.
  3. De da pilha
    1. Incubar um novo balão T75 com 8,5 mL de solução de colágeno por 1 h na incubadora (37 ° c, 5% CO2).
    2. Retire a solução de colágeno e lave suavemente o balão com PBS esterilizado. Adicionar 10 mL de meio pré-aquecido de hCMEC/D3 ao novo balão e colocar o balão na incubadora (37 ° c, 5% CO2).
    3. Tire o balão da incubadora e examine as células hCMEC/D3 um microscópio de contraste de fase para verificar se as células são 100% confluentes.
    4. Remova o meio de células hCMEC/D3 do frasco contendo células e lave as células hCMEC/D3 com 10 mL de PBS.
      Nota: os FBS adicionados ao meio de crescimento contêm inibidores da protease, como α1-antitripsina e α2-macroglobulina. Estes inibem o processo de tripsinização. Assim, é essencial para lavar as células com PBS para remover vestígios de FBS para evitar a inibição do processo de tripsinização.
    5. Adicione 1 mL de 0,25% de solução de tripsina contendo 0, 2% de EDTA e Trypsinize por 2-5 min na incubadora (37 ° c, 5% CO2) (bata o balão suavemente nas laterais para ajudar a desprendimento).
      Nota: nunca deixe as células em Trypsin/EDTA por mais de 6 min.
    6. Adicione 10 ml de meio pré-aquecido hcmec/D3 para interromper o processo de tripsinização e ressuscitar a célula hcmec/D3 pipetando para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, retire a suspensão da célula inteira do balão para um tubo de 15 mL.
    7. Transfira 1 mL da suspensão celular do tubo de 15 mL para o novo balão com meio fresco pré-aquecido (células de separação 1:10) e devolva o novo balão para a incubadora.
      Nota: antes de transferir para o novo balão, pipeta a suspensão da célula para cima e para baixo várias vezes para minimizar gradientes de concentração celular.

2. chapeamento de pilha

  1. Coloc inserções da cultura do tecido com as membranas microporosa (tamanho do pore: 0,4 μm, material: tereftalato do polietileno (animal de estimação)) em uma placa da cultura de 24 poços.
  2. Adicionar 400 μL de colágeno tipo I (0,15 mg/mL) em cada inserção de cultura tecidual e incubar por 1 h na incubadora de CO2 (37 ° c, 5% co2). Balanç a placa 24-well delicadamente para permitir mesmo espalhar da solução do colagénio sobre a membrana microporosa nas inserções da cultura do tecido.
  3. Retire a solução de colágeno e lave suavemente a membrana microporosa com 0,4 mL de tampão PBS 1x.
  4. Células hCMEC/D3 da placa com a densidade de 50.000 células/cm2 nas pastilhas celulares (15.000 células em 500 μL de meio).
    Nota: a fim de minimizar as diferenças no número de células em cada inserção da cultura do tecido, a suspensão da célula foi ressuspendida com uma pipeta de 10 mL antes de adicionar as células às pastilhas.
  5. Coloc a placa 24-well com configuração da cultura do tecido em uma incubadora (° c 37, 5% CO2) para permitir o acessório e a proliferação da pilha.
  6. Incubar a placa durante 7 dias para permitir que as células alcancem 100% de confluência. Remova o meio de crescimento todos os dias e transfira 0,5 mL de mídia fresca pré-aquecida para inserções de cultura de tecidos.
  7. Repita o procedimento do chapeamento (etapas 2.2-2.6) em uma placa de 12 poços, em uma placa 48-well e em uma placa 96-well. Use a placa de 12 poços para western blotting para determinar as alterações na expressão de ZO-1. Use a placa 48-well para o transfection do ADN NP. Use a placa 96-well para o ensaio do ATP para determinar a viabilidade da pilha em pilhas transfected.

3. cinética do crescimento celular.

  1. Semeie as células em uma densidade de 50.000 células/cm2 em uma placa de cultura de tecido de 24 poços revestida com colágeno.
  2. Em cada dia do experimento, retire o meio de crescimento e lave suavemente as células duas vezes com 500 μL de 1X PBS. Em seguida, adicione 30 μL de 0,25% de solução de tripsina contendo 0, 2% de EDTA e deixe a placa por cerca de 2-5 min em uma incubadora (37 ° c, 5% CO2).
    Nota: a formação gradual de monocamada confluente pode afetar a extensão do descolamento celular e é necessário aumentar os volumes de tripsina/EDTA, conforme indicado aqui: 30 μL para 1-5 dias após a semeadura, 60 μL para 6-7 dias após a semeadura e 100 μL para 8-10 dias após a semeadura .
  3. Adicionar 470 μL, 440 μL ou 400 μL de meio de crescimento com base no volume de solução de Trypsin/EDTA adicionado na etapa 3,2 para preparar 500 μL de suspensão celular em cada poço.
  4. Suspenda as células pipetando para cima e para baixo em cada poço várias vezes e observar as células um microscópio para certificar-se de todas as células são suspensas no meio de crescimento. Se algumas células ainda estão ligadas ao fundo da placa após a pipetagem várias vezes, gentilmente raspar as células usando um raspador de células plásticas para facilitar o descolamento celular.
  5. Remova 0,1 mL de suspensão celular de 500 μL de suspensão celular na etapa 3,3 e adicione a um tubo de 1,5 mL. Em seguida, adicionar 0,1 mL de 0,4% trypan solução azul para a suspensão celular e misture bem.
  6. Limpe um hemacytómetro com álcool isopropílico a 70%. Adicionar 20 μL de mistura da etapa 3,5 de cada lado no sulco V e localizar os 16 quadrados o microscópio. Os 16 quadrados são considerados como uma grade. Localize duas grades aleatórias em cada lado do hemacytómetro e contar todas as células vivas, não-azuis.
    Nota: as células que apareceram em cor azul de excluído da contagem, < 1% das células manchadas azul em todos os pontos de tempo.
  7. Calcule a densidade da célula (células/cm2) com base nas seguintes fórmulas.
    Média n º de células/Grid Equation 1 = (EQ. 1)
    Fator de diluição Equation 2 = (EQ. 2)
    Densidade celular (células viáveis/cm2) =
    Equation 3
    (EQ. 3)
    Equações 1-3. Células viáveis são o número de células contados em cada grade, número de grades correspondem ao número de grades localizadas o microscópio, volume de mistura de suspensão celular e 0,4% azul de trypan é o volume preparado na etapa 3,5, volume de suspensão celular removida é o volume removido da suspensão da pilha de 500 μL na etapa 3,5, o volume de suspensão da pilha em cada poço é a suspensão da pilha de 500 μL da etapa 3,3, área do crescimento da placa da cultura do tecido é a área do crescimento do único poço na placa de 24 poços.

4. ensaio de permeabilidade aparente amarela Lúcifer (LY P app )

  1. Para determinar oaplicativo ly P em cada dia após a semeadura, siga as etapas a partir de 4,3. Para a determinação doaplicativo P em células de hCMEC/D3 transfectadas, adicionar 8,3 μl da formulação de transfecção (Figura 1) misturado com 50 μL de meio de crescimento completo e incubar por 4 h. as formulações de transfecção estão descritas na seção 5.
  2. Após o transfection de 4 h, lave delicadamente o lado apical duas vezes usando o amortecedor estéril de 1X PBS para remover toda a mistura residual do transfection. Volumes variados de tampão PBS deixados para trás após a remoção podem afetar a concentração de LY no lado apical. Tome cuidado para garantir que o tampão de PBS residual em inserções de cultura de tecido é completamente removido. Aspirar com cuidado os reagentes residuais e o meio para minimizar o destacamento da pilha.
    Nota: esta etapa é ignorada ao medir a permeabilidade aparente de cada dia (Papp) das células hCMEC/D3.
  3. Retire o meio de crescimento e adicione 1,5 mL de tampão de transporte pré-aquecido (37 ° c) (25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mm MgCl2, 1 mm NaH2po4, 5 mm glucose, pH 7,4) para o lado basolateral.
    Nota: o volume de tampão de transporte em todos os compartimentos basolateral deve ser igual para garantir a precisão do cálculo do coeficiente de permeabilidade.
  4. Adicionar 58,3 μL de solução de 20 μM de LY ao lado apical de cada pastilha de transpoços. Salvar 50 μL da solução de 20 μM LY para medições de fluorescência. Após ter removido o amortecedor residual de PBS do lado apical completamente, adicione a solução de LY tão rapidamente como possível para evitar secar pilhas de hCMEC/D3. Assegure volumes exatos de solução de LY no lado apical.
    Nota: para minimizar a deterioração da intensidade da fluorescência LY, a exposição à luz deve ser limitada. Uma vez que o pó LY é reconstituído, a solução deve ser armazenada a 4 ° c, protegida da luz.
  5. Incubar em um agitador giratório da placa (37 ° c, 100 RPM) para 60 minutos. Em seguida, remova 30 μL da amostra de LY de cada compartimento apical. Em seguida, transfira a solução de 20 μM LY e as amostras laterais apicais para tubos pré-rotulados e diluir a amostra 10 vezes usando o tampão de transporte.
    Nota: é necessário diluir a solução de 20 μM LY e as amostras laterais apicais porque a alta intensidade de fluorescência destas amostras pode potencialmente sobrecarregar e danificar o detector de fluorescência do leitor de microplacas de fluorescência.
  6. Retire 500 μL de cada compartimento basolateral e transfira a amostra para tubos pré-rotulados.
    Nota: as amostras são removidas do transwell separado em pontos de tempo indicados. Os pontos de tempo são cada dia após a semeadura a partir do dia 1 até o dia 10.
  7. Prepare uma série de padrões LY para a curva padrão (39, 0 nM, 78,13 nM, 156,25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM).
  8. Adicionar 100 μL de cada amostra padrão (em duplicado), apical e basolateral a cada poço em uma placa preta de 96 poços (Figura 1).
    Nota: as placas pretas absorvem a luz e reduzem o cruzamento do fundo e da fluorescência entre poços.
  9. Utilize um leitor de microplacas de fluorescência (pontos de ajuste: excitação 428 nm, emissão 536 nm) para medir a intensidade da fluorescência LY para calcular o Papp. Um leitor da placa da fluorescência é usado para este estudo.
  10. Calcule os valores de Papp e% ly Recovery conforme descrito no texto do manuscrito.
    Equação 4. Formulae para calcular os valores de Papp .
    Calcule o coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) e a recuperação% ly usando as seguintes equações. Deve-se notar que os valores de Papp podem ser calculados com base na massa25 ou concentração de ly.
    Equation 4 OuEquation 5
    Va -volume no compartimento apical
    VB -volume no compartimento basolateral
    A-a área de superfície da membrana da pastilha do transwell (0,3 cm2)
    Ma0 -a massa inicial no compartimento apical
    ΔMB/Δt-a alteração da massa ao longo do tempo no compartimento basolateral
    CA0-a concentração inicial no compartimento apical
    ΔCB/Δt-a alteração da concentração ao longo do tempo no compartimento basolateral.
    A equação 5. Fórmulas para calcular a recuperação de% ly.
    Recuperação (%) = Equation 6
    MAF é a massa no compartimento apical no ponto de tempo final, mBF é a massa no compartimento basolateral no ponto de tempo final, ma0 é a massa inicial no compartimento apical. 26 Nota: a massa inicial é calculada com base no volume da solução de 20 μm ly na etapa 4,5. Este experimento sempre foi feito usando células o número de passagem 35 e foi conduzido quatro vezes independentes.

5. depleção de cálcio

  1. Retire o meio de crescimento das pastilhas de transpoços e da placa de 12 poços e lave suavemente o lado apical e a placa de 12 poços usando meio livre de cálcio pré-aquecido (médio mínimo essencial de Eagle Spinner (S-MEM)) para remover os íons de cálcio das pastilhas de transpoços e placa de 12 poços.
  2. Adicionar 500 μL ou 2 mL de S-MEM 1xmedium pré-aquecido às pastilhas ou placa de 12 poços e incubar durante 24 h na incubadora (37 ° c, 5% CO2). Após a incubação, retire o meio S-MEM 1x e lave as células uma vez usando o tampão PBS pré-aquecido 1x.
  3. Siga os passos 4.4-4.10 descritos na secção 4 para tratamento com LY e passos subsequentes. Siga os passos 8.1.2-8.2.4 descritos na secção 8 para western blotting e passos subsequentes.

6. transfecção

  1. Preparação de nanopartículas de DNA (DNA NPs).
    1. Diluir a solução de estoque de plasmídeo gWIZ-Luc em 10 mM de acetato de sódio (NaAc) tampão (pH 5,0) e permitir que a solução de DNA para ficar 10 min à temperatura ambiente (RT).
      Nota: o DNA NP contendo moléculas de DNA predominantemente únicas pode ser preparado em concentrações de DNA 20-40 μg/mL23. Assim, a solução de estoque de plasmídeo gWIZ-Luc precisa ser diluída. O estoque congelado do plasmídeo de gwiz-Luc precisa de ser descongelado completamente no gelo para minimizar o esforço da temperatura. Vortex suavemente a solução de estoque de DNA diluído para 30 s em um vortexer de bancada padrão definido na posição do botão 3-5.
    2. Calcule as relações N/P desejadas, usadas aqui como um parâmetro numérico para refletir a composição de NP.
      Equation 7
      Equação 6. Cálculo da relação N/P: a proporção de moles dos grupos amina de polímeros catiônicos aos dos grupos fosfato de DNA. Massa de polímeros catiônicos significa quantidade total pesada de polímero catiônico; (Massa/carga) os Polímeros Catiônicos referem-se ao peso molecular do polímero catiônico (poli (Ethyleneglycol) 5K-Block-polyaspartamide com 48 cadeias laterais de dietilenetriamine (PEG-Det)) normalizadas para o número de aminas primárias carregadas (48) por polímero catiônico ( mol/mol), este valor para o nosso polímero é 306 da; Massa de DNA significa quantidade total de DNA utilizada na formulação obtida multiplicando o volume e a concentração em mg/mL; (Massa/carga) O DNA refere-se ao peso molecular do DNA normalizado ao número de grupo fosfato por DNA de dupla fita (325 da por nucleobase).
      Nota: a tabela de preparação do DNA NP (tabela 1) contém a receita de formulação para as diferentes amostras testadas em nossos experimentos. O DNA NP foi preparado com uma técnica de titulação rápida. A solução de polímero PEG-DET foi adicionada ao longo das paredes do tubo enquanto segurava o tubo em uma posição horizontal. Em seguida, o tubo foi comutado para uma posição vertical, seguido por rapidamente vortexing na velocidade máxima de 10s. O DNA NP foi autorizado a permanecer por 30 min em RT antes do uso. A regra de polegar para dosagem de DNA NP é 0,5 μg de DNA para ca. 1 cm2 área de crescimento. Assim, para cada inserção do transwell/cada poço em uma placa 48-well/cada poço em uma placa 96-well, prepare o ADN NP em N/P 10 que contem 0.157/0.5/0.195 μg/poço do ADN de gWIZ-Luc.
    3. Para amostras contendo concentração indicada de POLOXAMER P84 (P84), adicionar P84 ao DNA NP e Vortex por 5 s. A concentração final de P84 em cada amostra é de 0, 1% ou 0, 3% de peso.
  2. Transfection do ADN NP em uma instalação da placa 48-well
    1. Semeie as células com a densidade de 50.000 células/cm2 em uma placa de poço 48 e cresça até confluência na incubadora (37 ° c, 5% co2).
    2. Para cada grupo de tratamento, misturar 25 μL da amostra indicada (formulação de transfecção) e 150 μL de meio de crescimento completo e 175 μL desta mistura para cada poço.
    3. Observe as células hCMEC/D3 um microscópio para garantir que as células pareçam saudáveis e sejam 100% confluentes no momento do experimento.
    4. Retire o meio de crescimento de poços e 175 μL de mistura de transfecção para cada poço. Em seguida, incubar a placa por 4 h na incubadora (37 ° c, 5% CO2).
    5. Após 4 h, retire a mistura de transfecção e lave as células hCMEC/D3 com tampão PBS estéril pré-aquecido 1x.
      Nota: para minimizar o descolamento acidental de células hCMEC/D3 da superfície da placa/pastilha durante as etapas de lavagem, cuidadosamente Pipetar PBS estéril suficiente ao longo das paredes dos poços e remover quaisquer nanopartículas nos meios de cultura residuais.
    6. Agitar suavemente a placa algumas vezes e aspirar cuidadosamente e descartar a lavagem PBS e adicionar 500 μL de hCMEC/D3 meio de cultura pré-aquecido.
    7. Examine microscopically as pilhas e anote observações na morfologia da pilha e em todos os efeitos possíveis do transfection.
    8. Incubar por 24 h na incubadora da cultura de pilha de 37 ° c para permitir a produção do luciferase. Após 24 h, retire completamente o meio de crescimento e lave as células uma vez com 1X PBS pré-aquecido.
    9. Lyse as pilhas transfected adicionando 100 μL do reagente do lysis 1x da cultura de pilha do luciferase do gelo-frio por bem.
    10. Para a medição do teor de proteína luciferase, adicionar 20 μL de lisado celular e 100 μL de tampão de ensaio luciferase (20 mM de glicina (pH 8), 1 mM MgCl2, 0,1 mm EDTA, 3,5 mm dtt, 0,5 mm ATP, 0,27 mm coenzima A) em um tubo de 1,5 ml.
    11. Leia a luminescência da amostra descrita na etapa 6.2.10 em um luminómetro com um único auto-injector.
      Nota: a luminescência deve ser integrada ao longo de 10 s antes da leitura.
    12. Meça a quantidade total de proteína celular no lisado usando um jogo do ensaio do ácido ácido (ensaio de BCA) seguindo o protocolo do fabricante.
    13. Calcule e expresse a expressão do gene do luciferase como unidades claras relativas (RLU) por a proteína celular total.

7. ensaio luminescente ATP

  1. Semeie as células com a densidade de 50.000 células/cm2 em uma placa de poço 96 e cresça até confluência na incubadora (37 ° c, 5% co2).
  2. Transfect as pilhas com 9,7 μL da formulação do transfection (os detalhes da preparação estão na seção 6) e 58,4 μL do meio completo do crescimento para 4 h.
  3. Remova a mistura do transfection e lave delicadamente as pilhas com o amortecedor pre-aquecido de PBS 1x duas vezes para remover completamente os reagentes do tratamento.
    Nota: os diferentes volumes de tampão residual podem diluir os reagentes do ensaio ATP para uma extensão diferente e podem potencialmente afectar os dados.
  4. Misturar 75 μL de meio pré-aquecido fresco e reagente de ensaio ATP numa diluição de 1:1 utilizando uma pipeta multicanal. Certifique-se de que o nível de líquido em todas as pontas de pipeta multicanal é o mesmo.
  5. Coloc a placa em um abanador de nutating por 15 minutos na temperatura ambiente. Após 15 min de adição dos reagentes, transfira 60 μL de cada amostra para uma placa branca de 96 poços.
    Nota: as placas brancas são melhores para refletir a luz da saída do que placas claras ou pretas.
  6. Pop qualquer bolhas de ar usando uma agulha antes de ler a placa. Leia a placa num luminómetro com um tempo de integração de 1 s. Leia a placa dentro de 20 minutos após a adição de reagentes do ensaio ATP. O sincronismo é crítico para a comparação através das placas diferentes, porque o sinal da luminescência é transiente com uma taxa de deterioração rápida.
  7. Calcule o percentual (%) viabilidade celular utilizando esta fórmula: (luminescência de células transfectadas/luminescência de controle, células não tratadas) x 100.

8. western blotting para medição de junção apertada proteína ZO-1

  1. Lise celular e extração de proteínas
    Nota: todos os passos para a extracção de proteínas das células devem ser efectuados a 2-8 ° c.
    1. Semente as pilhas em uma densidade de 50.000 de pilha/cm2 em uma placa colagénio-revestida da cultura do tecido de 12 poços.
    2. No dia 3, dia 5, dia 7, dia 10 pós-semeadura e no dia 7 (células pré-incubadas com meio livre de cálcio), retire o meio de crescimento e lave suavemente as células duas vezes com 2 mL de gelo-frio 1X PBS. Em seguida, adicione 300 μL de mistura de tampão de lise de 1x RIPA gelada contendo 3 μg/mL de aprotinina em cada poço.
      Nota: a mistura deve ser feita na hora e mantida no gelo. A aprotinina é usada para inibir proteases presentes em lisados de degradar a proteína de interesse.
    3. Após dois ciclos Freeze-Thaw (-80 ° c), raspe as pilhas usando um raspador plástico frio da pilha. Colete os lisados de células em tubos de microcentrífuga. Em seguida, centrifugue os tubos a 200 x g durante 30 min a 4 ° c.
    4. Colete o sobrenadante em tubos limpos e coloque-os no gelo. Meça a quantidade total de proteína celular nos lisados usando o kit de ensaio BCA seguindo o protocolo do fabricante.
  2. Western blotting para detecção de junção apertada proteína ZO-1
    1. Alíquotas de denature de homogeneatos totais contendo 40 μg de proteína total com tampão de Laemmli 1x a 95 ° c, 5 min e sujeitos a eletroforese em um gel de poliacrilamida de sulfato de sódio de 6-7,5% de redução (SDS-PAGE) (90 V, 10 min através de gel de empilhamento, 120 V através solução de géis).
      Nota: ao carregar as amostras ou padrões, lembre-se de carregar lentamente e cuidadosamente em cada pista, tendo cuidado para não quebrar o poço no processo.
    2. Transfira as proteínas separadas para uma membrana de nitrocelulose com tampão de transferência pH 8,5 que contém 192 mM de glicina, 25 mM TRIS base, 10% metanol e 0,1% SDS (75 V, 110 min à temperatura ambiente).
      Nota: não toque na membrana. Use 70% de fórceps plástico lavado isopropanol para manusear a membrana. A fim transferir com sucesso a proteína ZO-1 (MW 200 kDa) à membrana, o pH deve ser ao redor 8.3-8.5. Se o buffer de transferência é mais ácido do que isso, a transferência não aconteceria. Se as bandas de escada são visíveis ainda sobre o gel, seria útil para aumentar o tempo de transferência e concentração de SDS.
    3. Depois de lavar a membrana usando salina tampão Tris contendo 0,1% Tween 20 (T-TBS), use solução de bloqueio (1:1 LiCOR-Odyssey Block: 1x Tris tampão salina) para bloquear as membranas por 60 min.
    4. Corte cuidadosamente a membrana em duas tiras. Incubar com dois anticorpos primários (anticorpo monoclonal ZO-1, diluição, 1:900, e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) Anticorpo, diluição, 1:10.000) durante a noite a 4 ° c. Em seguida, incubar as membranas ZO-1 e GAPDH com anti-rato de burro IgG (diluição, 1:50000). Após ter lavando as membranas usando T-TBS, imagem as membranas no canal 700 em um Imager de 16 bits.

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Representative Results

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Primeiramente, determinamos o efeito do tempo de cultivo na permeabilidade da LY para determinar a cinética aparente da formação de TJ. Os valores médios doaplicativo ly P do dia 1 a 10-post de semeadura são mostrados na Figura 2a. No dia 1, a média de Papp foi 4,25 x 10-4 cm/min e ligeiramente caiu para 3,32 x 10-4 cm/min no dia 2. O valor médio de Papp aumentou ligeiramente para 3,93 x 10-4 cm/min no dia 3 e flutuou sem mudanças significativas até o dia 6. Os valores de Papp diminuíram significativamente para 2,36 x 10-4 cm/min no dia 7 em comparação com o dia 1 (p < 0, 5) provavelmente sugerindo que a barreira se tornou mais apertada. Os valores de Papp estabilizaram na escala entre 2,14 x 10-4 e 2,36 x 10-4 cm/min do dia 7 ao dia 10, que implicou a formação da barreira era completa e funcional tendo por resultado o transporte de ly transcelulares paracelulares diminuído. Calculamos a percentagem (%) Recuperado em cada dia para ser CA. 80%, um valor que é considerado ideal para calcular de forma confiável o valor de Papp 27 (FiGure 2B). A recuperação% é um índice importante no ensaio LY. Por exemplo, se as células metabolizam mais LY, LY é imobilizada em células ou varas para a membrana celular ou LY degrada durante a incubação, seria impreciso interpretar que observou baixo sinal LY no compartimento basolateral indica uma barreira apertada. Assim, a recuperação% dá mais confiança de que não perdemos uma quantidade significativa de LY devido a uma ou mais das possibilidades acima e permite estimar confiantemente os valores doaplicativo ly P. Como observado anteriormente na seção de introdução, maiores concentrações de LY no lado basolateral indicam uma barreira incompleta, enquanto as concentrações mais baixas refletem o transporte restrito, sugerindo uma barreira madura e completa devido à presença de Tjs. Nós igualmente apresentamos a evidência adicional usando uma técnica ortogonal, deteção de mancha ocidental da proteína de ZO-1 (Figura 4), para confirmar que as mudanças observadas noapp de ly P correlacionam com a formação de junções apertadas.

Uma vez que a configuração da pastilha transwell não permite rastrear diretamente as alterações na densidade celular, determinamos alterações na densidade celular usando um ensaio de exclusão azul trypan padrão. Nós determinamos conseqüentemente as mudanças na densidade da pilha em uma placa transparente da cultura do tecido que nos permitisse prontamente monitorar a cinética do crescimento da pilha. O aumento da densidade celular de 5,5 ± 1,0 x 104 células/cm2 a 1,9 ± 0,2 x 105 células/cm2 a partir do dia 1 a 10-semeadura pós (Figura 3) foi linear com coeficiente de regressão de 0,94. Esses dados também sugerem que as alterações observadas noaplicativo ly P (Figura 2a) são resultado da formação de uma monocamada confluente durante o período de 10 dias. Nós observamos as pilhas um microscópio de luz invertido em cada dia e documentamos visualmente um aumento gradual no número de pilha e na formação do monocamada.

Utilizou-se western blotting para detectar alterações na expressão da proteína de junção apertada ZO-1 ao longo do tempo (Figura 4). As alterações na expressão ZO-1 são usadas para complementar ortogonalmente os dados doaplicativo ly p e para garantir que as alterações observadas noaplicativo ly p indicam a formação de uma barreira apertada. As intensidades de banda ZO-1 foram analisadas por densitometria e normalizadas em relação à expressão de um gene de limpeza, GAPDH. As duas bandas da Figura 3a representam as duas isoformas zo-1 (zo-1α+ e zo-1α-)28. A análise da densitometria revelou que o valor de pixel de ZO-1 aumentou do dia 3-7 após a semeadura, sugerindo que a proteína TJ-1, formada continuamente a partir do dia 3-7. Após o tratamento da depleção de cálcio no dia 7 pós-semeadura, a faixa de ZO-1 foi quase indetectável, o que indica que o ZO-1 não foi capaz de se formar na ausência de íons cálcio. Além disso, o valor de pixel de ZO-1 diminuiu acentuadamente no dia 10 pós-semeadura. As intensidades do sinal de GAPDH do dia 3-10 apareceram eram comparáveis, exceto no dia 7 em que as pilhas foram tratadas com o meio cálcio-livre. Uma possível razão para a menor expressão de GAPDH em células tratadas com cálcio pode ser decorrente da menor proteína total (28,9 μg de proteína total), mais uma vez, provavelmente devido à depleção de cálcio. Globalmente, a análise de densitometria de banda revelou um aumento gradual na expressão de ZO-1 (em relação ao GAPDH) até o 7º dia e uma diminuição na expressão no dia 10 quando as células cultivadas em meio de crescimento completo. A análise também revelou uma menor expressão de ZO-1 (em relação ao GAPDH) no 7º dia em células tratadas com meio livre de cálcio.

Enquanto o foco deste trabalho é apresentar o ensaio LY Papp como um método para determinar a cinética de uma formação de monocamada, para demonstrar uma utilidade adicional do ensaio desenvolvido, determinamos se a transfecção de DNA NP influenciou a barreira de TJ integridade através da medição doaplicativo ly P através das células hCMEC/D3 4 h pós-transfecção (Figura 5). Nosso DNA NPs contendo POLOXAMER P84 mediar altos níveis de expressão gênica na linha celular hCMEC/D3 de difícil transfect (Figura 6a). Especificamente, queríamos determinar se os domínios hidrofóbicos de POLOXAMER P84 em nosso DNA NPs podem perturbar a integridade do TJ em células transfectadas. O% LY recuperado em cada grupo de tratamento foi de CA. 92%, sugerindo que os valores calculados de Papp são confiáveis (Figura 5b). Nós observamos que o procedimento do transfection que usa várias formulações não afetou oappde ly P, relativo às pilhas não-transfected expor a ly sozinho. O cálcio extracellular é um componente crítico para a manutenção de junções da pilha-pilha em vários tipos da pilha29,30,31, incluindo as pilhas endothelial do microvascular do cérebro. Assim, manter as células em meio livre de cálcio (CFM) leva ao rompimento de TJs32,33. Portanto, utilizamos células tratadas com CFM por 24 h como controle positivo.

Nossos dados mostram que oaplicativo ly P para células INCUBADAS com cfm foi 2 vezes maior em comparação com as células de controle incubadas com o meio de crescimento regular. Este aumento de 100% no Papp sugere que as células perderam seus TJs devido à perda de íons de cálcio necessários para sua formação. Notavelmente, o valor real (5,14 x 10-4 cm/min) foi ligeiramente maior do que o valor médio de Papp do dia 1-6 pós-semeadura (Figura 2) quando os TJs ainda não estavam totalmente formados. Embora não significante, as células transfectadas com DNA NP contendo 0,01-0,03% de POLOXAMER P84 mostraram um pequeno aumento nos valores doaplicativo ly P em comparação com as células não tratadas mantidas em meio de cultura regular. Esta observação sugeriu que o transfection do ADN NP + P84 não teve nenhum efeito significativo na integridade da barreira de TJ. Em geral, os valores doaplicativo ly p nas células transfectadas aproximadamente foram calculados para 2,5 x10-4 cm/min e esse valor correspondeu ao valor médio observado durante o dia 7-10 pós-semeadura (Figura 2) quando oaplicativo ly p foi o mínimo, sugerindo a presença de TJs funcionais que restringiram efetivamente o transporte de LY paracelular.

Apresentamos dados adicionais de transfecção para mostrar que a falta de alterações noaplicativo ly P (Figura 5) não é uma observação inconsequente. Apesar dos altos níveis de transfecção observados no grupo DNA NPs + P84, não observamos alterações noaplicativo ly P sugerindo que nossas formulações não perturbariam a barreira TJ. A eficiência relativamente baixa do transfection nas pilhas ADN-tratadas nuas é típica porque a natureza aniônicos do ADN do plasmídeo (devido aos grupos do fosfato em sua espinha dorsal) e sua natureza hidrófila limitam a tomada celular. O DNA condensado no DNA NP mediu um aumento de 50 vezes no transfection comparado ao pDNA despido (Figura 6). A adição de 0, 1% P84 ao DNA NP resultou em um aumento de 18 vezes em relação ao DNA NP-Alone (P < 0, 1). O aumento da concentração de P84 para 0, 3 WT.% resultou em um aumento de 30 vezes comparado ao DNA NP-Alone (P < 0, 1). Estes resultados são notáveis dado que as pilhas endothelial do cérebro são um tipo hard-to-transfect da pilha.

Nós medimos a viabilidade da pilha das pilhas transfected circunstâncias diferentes para confirmar que o procedimento do transfection não causa o esforço da pilha. Trifosfato de adenosina (ATP) é a moeda de energia da vida e reflete a função metabólica celular. Utilizou-se um ensaio ATP baseado em luciferase, onde os valores de luminescência são diretamente proporcionais aos níveis de ATP. Possimo et al. relataram que o ensaio de luminescência ATP foi uma medida robusta de viabilidade celular metabólica34. A viabilidade celular das células hCMEC/D3 transfectadas pelas diversas formulações foi comparável às células não tratadas (Figura 5b), sugerindo que os níveis de ATP também eram semelhantes. Portanto, os NPs de DNA contendo POLOXAMER P84 (0, 1% a 0, 3% p/p) são formulações seguras de entrega genética.

Figure 1
Figura 1 . Configuração experimental para ly P app estudo. configuração de placa de 24 poços contendo inserções de transpoços (adaptadas para mostrar a transfecção de nanopartículas de DNA como exemplo, dados na Figura 5). Cada coluna foi tratada com a amostra indicada para 4 h. o controle indica as pilhas de hCMEC/D3 tratadas com o meio de crescimento completo quando a depleção do cálcio 24 h indicar que as pilhas estiveram incubadas com o meio livre de cálcio antes da exposição de LY. O molde direito descreve a medida da intensidade da fluorescência de LY em uma placa 96-well preta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Cinética aparente da formação de barreira de TJ determinada pelo uso do ly P app de ensaio. (a) ( Paim ) o app através dos monocamadas de hcmec/D3 cultivados em inserções do transwell foi medido diariamente borne-semeando pilhas. (b)% ly recuperado em cada grupo de tratamento. Os dados representam média ± DP de dois experimentos independentes (n = 3/experimento). Comparações estatísticas foram feitas usando teste t não pareado (*P< 0, 5, N.S. não significante). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 3
Figura 3 . Cinética do crescimento celular determinada usando um ensaio de exclusão azul de trypan. as pilhas de hCMEC/D3 foram semeadas em uma placa de 24 poços em uma densidade da pilha de 50.000 pilhas/cm2. Em cada dia do experimento, as células foram dissociadas e misturadas com um volume igual de 0,4% de azul de trypan antes de contar células viáveis em um hemacytometer. Os dados representam média ± DP de três medidas independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Cinética aparente da expressão zo-1 detectada usando western blotting. (a) ascélulas hCMEC/D3 foram semeadas em uma placa de 12 poços em uma densidade celular de 50.000 células/cm2. Em cada dia do experimento (dia 3, dia 5, dia 7 e dia 10-pós-semeadura), as células foram lisadas por 400 μL de tampão RIPA 1x contendo 3 μg/mL de aprotinina. Os lysates da pilha que contêm 40 μg da proteína total foram carregados em um gel de SDS-polyacrylamide de 4-7.5%. (b) a análise da densitometria da faixa permitiu a expressão normalização da proteína zo-1 ao GAPDH. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 5
Figura 5 . Efeitos do transfection do ADN NP na tensão da barreira de TJ medida usando o ly P app de ensaio. (a) as células hcmec/D3 foram cultivadas em pastilhas de transpoços por 7 dias, transfectadas com Peg-Det contendo DNA plasmídeo gWIZLuc com/sem Pluronic P84 por 4 h e, em seguida, substituídas por tampão de transporte pré-aquecido contendo 50 ΜM de ly para 1 h. o controle representa as células hCMEC/D3 incubadas com meio de crescimento por 4 h, seguidas de exposição LY (n = 4, *P< 0,05, N.S. não significante). (b)% ly recuperado em cada grupo de tratamento, os valores apresentados são médios ± DP (n = 4). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 6
Figura 6 . Os NPS de DNA mediam altos níveis de expressão de transgenes em monocamadas hcmec/D3. (a) células hcmec/D3 foram cultivadas 7 dias e transfectadas com Peg-Det contendo DNA plasmídeo gWIZLuc com/sem Pluronic P84 (N/P 10, dose de DNA por poço: 0,5 μg) por 4 h, a mistura de transfecção foi removida e as células foram cultivadas por 24 h em crescimento completo médio antes de medir a expressão gênica. Os níveis da expressão do gene do luciferase foram expressos como unidades claras relativas (RLU) nornalized ao índice celular total da proteína. Os dados apresentam média ± DP de três experimentos independentes. As comparações estatísticas foram feitas usando o teste t não pareado (* * p< 0, 1, * * * p< 0, 1). (b) DNA NPS são formulações de transfecção seguras em monolayers hCMEC/D3. Os efeitos do transfection do ADN DNA NP na viabilidade da pilha foram avaliados usando um ensaio luminescentes do ATP. as pilhas de hCMEC/D3 foram transfected com as amostras indicadas para 4 h que seguem que o ensaio do ATP foi conduzido seguindo o protocolo do fabricante. Percentagem (%) a viabilidade celular foi calculada da seguinte forma: (luminescência de células transfectadas/luminescência de controle, células não tratadas) X100. Os dados representam média ± DP de dois experimentos independentes (n = 3/experimento). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Configuração experimental Nome da amostra Volume de 1mg/mL de DNA plasmídeo (μL) Volume de tampão NaAc de 10 mM, pH 5 (μL) Volume de polímero de 5 mg/mL (μL) Volume de 10% w/w. P84 (μL) Volume de meio de crescimento (μL)
A cultura do tecido insereum Controle, células não tratadas 0 0 0 0 58,3
DNA nu 0,157 8,143 50
DNA NP 7,843 0,3
DNA NP + 0,01% P84 7,6681 0,1749
DNA NP + 0,03% P84 7,26 0, 583
placa 48-well Controle, células não tratadas 0 0 0 0 175
DNA nu 0,5 24,5 150
DNA NP 23,56 0,94
DNA NP + 0,01% P84 23,385 0,175
DNA NP + 0,03% P84 23, 35 0,525
placa 96-well Controle, células não tratadas 0 0 0 0 68,1
DNA nu 0,195 58,4
DNA NP 9,35 0,37
DNA NP + 0,01% P84 8,9307 0, 681
DNA NP + 0,03% P84 9, 669 0,2043

Tabela 1. As formulações NP utilizadas para obtenção dos dados relatados.

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Discussion

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Um papel fundamental do BBB é impedir a troca de íons não essenciais e substâncias tóxicas entre a circulação sistêmica e o cérebro para manter a hemostasia do microambiente neural. Uma das características do BBB é a capacidade das células endoteliais capilares para formar junções apertadas (TJs) que efetivamente selar a rota paracelular de transporte. Nós demonstramos um teste de LY Papp como um método quantitativo para determinar a cinética aparente da formação da barreira de TJ em monolayers cultivados de hCMEC/D3. Expressão de ZO-1 detectada via Western blotting validado ortogonalmente os dados dos estudos deaplicação ly P como discutido detalhadamente no parágrafo seguinte. Como uma utilidade adicional do ensaio desenvolvido, Nós demonstramos ainda que o transfection do ADN NP não modificou mensurável aaplicação de ly P que indica a adequação deste ensaio para determinar mudanças em características da barreira de TJ em uma instalação experimental.

Os dados ocidentais do borrão revelaram um aumento desobstruído na expressão de ZO-1 na semeadura dos dias 3, 5, 7-post e uma redução ligeira na semeadura do dia 10-borne (figura 4a). A partir da Figura 1, pode-se ver que oaplicativo ly P diminuiu do dia 1-7 pós-semeadura sugerindo a formação de TJs. Após o tratamento da depleção de cálcio, oaplicativo ly P apresentou aumento acentuado (Figura 2a), enquanto a expressão zo-1 mostrou redução acentuada (figura 4a). O cálcio extracellular é um componente crítico para a manutenção de junções da pilha-pilha em vários tipos da pilha29,30,31, incluindo as pilhas endothelial do microvascular do cérebro. A falta de cálcio no meio de crescimento perturbou e dissociou o TJs33. Como esperado, o valor de Papp de células empobreçadas de cálcio foi significativamente maior do que as células não tratadas e perto do valor de papp das inserções em branco que não contêm células (Figura 2a). O LY revelou um planalto constante em valores de Papp do dia 7-10 pós-semeadura (Figura 2a), sugerindo que a barreira tinha sido totalmente formada pelo dia 7 que resultou no transporte restrito de ly para o lado basolateral. Os dados ocidentais do borrão mostraram uma diminuição ligeira na expressão de ZO-1 no dia 10 comparado ao dia 7-post semeadura. Esta diferença na observação é provável devido à contribuição de outras proteínas extracelular, aparte do zo-1, em manter a tensão da barreira. Em resumo, nós usamos com sucesso dados de duas técnicas ortogonais para determinar a cinética da formação apertada da barreira da junção em um modelo humano da pilha do BBB. Quando o teste doapp de ly P mediu a funcionalidade da barreira de TJ, os dados ocidentais do borrão traçaram a formação dos TJs usando o zo-1 como uma proteína do marcador.

Como uma utilidade adicional do ensaio desenvolvido, nós confirmamos que o transfection do ADN NP em monocamadas de hcmec/D3 não afeta a integridade de TJs (Figura 5). As células não tratadas incubadas com meio de crescimento foram utilizadas como controle negativo e as células pré-incubadas com meio livre de cálcio por 24 h foram utilizadas como controle positivo. As células em que os TJs foram interrompidos como resultado da depleção de cálcio mostraram um aumento de 210% noaplicativo ly P em comparação com as células não tratadas. Nossos dados sugerem que o transfection do ADN NP ou na presença ou na ausência de P84 não afete a integridade de TJ. Deve-se notar que a falta de LY Papp alterações em células transfected não é uma observação inconsequente. Na verdade, nosso DNA NPS mediar níveis significativos de expressão gênica no hard-to-transfect hcmec/D3 monocamadas9,35,36,37. O DNA NPs contendo 0, 1 ou 0, 3 WT.% P84 aumentou a expressão do gene da luciferase por cerca de 18 e 30 vezes, respectivamente, em comparação com o DNA NPs isoladamente (Figura 6a). Também demonstramos que nossos tratamentos NP não afetam negativamente os níveis de ATP celular, usados aqui como um indicador de viabilidade celular funcional (Figura 6B). Nossos resultados sublinham a utilidade expandida deste ensaio LY Papp para determinar a integridade da barreira de TJ em uma instalação experimental do transfection.

Um passo crítico na execução do ensaio LY é manter a mesma quantidade de LY no lado apical e igual volume de tampão de transporte no lado basolateral através dos vários pontos de tempo em todo o experimento. Se diferentes quantidades de LY ou volumes desiguais de buffer de transporte foram usados em poços, o cálculo do Papp seria confiável, resultando em desvios padrão artificialmente grandes. Um outro aspecto crítico é limitar a exposição clara para minimizar a deterioração da intensidade da fluorescência de LY. Além disso, o líquido precisa ser removido completamente antes de adicionar o mesmo volume exato de solução LY e buffer de transporte em lado apical e lado basolateral, respectivamente. Isto assegura-se de que o leitura da fluorescência possa confiantemente ser usado para o cálculo doapp P. Outro passo crítico neste experimento é medir imediatamente a fluorescência LY das amostras basolateral e evitar a necessidade de congelar as amostras após a coleta. Sujeitando as amostras LY-contendo aos ciclos do congelar-descongelamento conduz a uma variação intragrupo maior do sinal da fluorescência. Uma limitação de usar a instalação do transwell é que as pilhas ao vivo são difíceis de ser visualizadas pela microscopia convencional ou imaged pela microscopia confocal. Além disso, não é fácil traduzir em uma configuração que permite coculturar diferentes tipos de células, a menos que a cultura mista de dizer, glial e células endoteliais é uma possibilidade. No entanto, o ensaio LY tem as seguintes vantagens: LY é um corante com picos de excitação/emissão distintos e uma mudança de Stokes relativamente grande em comparação com corantes como fluoresceina de sódio, o que permite uma medição robusta da sonda cruzando o BBB e evita a necessidade de radiomarcar adicional como no caso de traçadores, tais como sacarose ou manitol. A alta recuperação% s da LY fornece dados confiáveis para calcular com confiança os valores doaplicativo P.

Com base em nossos achados, concluímos que o método LY Papp é um ensaio simples e robusto para quantificar a permeabilidade paracelular em monolayers de células hCMEC/D3. Usando o método LY Papp , otimizamos o tempo de cultura para a formação de barreira intacta, e demonstramos uma utilidade adicional do ensaio desenvolvido determinando a integridade de TJ em monolayers de células de DNA NP-transfected.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores são gratos pelo apoio financeiro do 2017 New Investigator Award da associação americana de farmácia, um Hunkele temido Award doença da Universidade de Duquesne e da escola de farmácia start-up fundos para o laboratório Manickam. Gostaríamos de agradecer ao laboratório de vazamento (Duquesne University) para western blotting assistência e permitindo o uso de sua Odyssey 16-bit Imager. Nós igualmente gostaríamos de incluir uma nota especial da apreciação para kandarp Dave (laboratório de Manickam) para a ajuda com blotting ocidental.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hCMEC/D3 cell line Cedarlane Laboratories 102114.3C-P25 human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLuc Aldevron  5000-5001 Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt  Invitrogen 155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes Falcon 353095
Tissue culture flask  Olympus Plastics 25-207
24-well Flat Bottom  Olympus Plastics 25-107
Black 96-Well Immuno Plates  Thermo Scientific 437111
S-MEM 1X Gibco 1951695 Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2 Clonetics CC-3156 Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1X HyClone SH3025601
Collagen Type I  Discovery Labware, Inc. 354236
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent  Promega E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt  Promega E1601
SpectraMax i3  Molecular Devices Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody  ThermoFisher 61-7300
anti-GAPDH antibody abcam ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) Jackson ImmunoResearch Inc 128817
12-well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-106
RIPA buffer (5X) Alfa Aesar J62524
Aprotinin Fisher BioReagents BP2503-10
Odyssey CLx imager LI-COR Biosciences for scanning western blot membranes

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References

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Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro
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Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).More

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).

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