Summary
מאמר זה מדגים את הטכניקה של הרחבת שטיחון nanofiber המסורתי, נמצא תחת ניהול דו-מימד (2D) electrospun לתוך גרדום (3D) 3-מימד דרך ירידת נוזלים2 CO subcritical. פיגומים אלו רבודה תלת-ממד, רמזים nanotopographic הסלולר מחקים מקרוב, לשמר את הפונקציות של מולקולות וחיסונים אנקפסולציה בתוך nanofibers.
Abstract
Electrospinning כבר הטכנולוגיה המועדפת בהפקת לפיגום סינתטי, פונקציונלי בשל ביומימטיקה מטריצה חוץ-תאית, הפקד נוחות של הרכב, מבנה בקוטר של סיבים. עם זאת, למרות היתרונות הללו, nanofiber electrospun מסורתיים פיגומים באים עם מגבלות כולל מאורגן nanofiber התמצאות, נקבוביות נמוכה, גודל הנקבוביות קטן ו מחצלות בעיקר דו מימדי. בתור שכזה, יש צורך גדול לפיתוח תהליך חדש עבור בדיית פיגומים nanofiber electrospun זה יכול להתגבר על המגבלות הנ. במסמך זה, התווה שיטה פשוטה הרומן. מזרן nanofiber דו-ממדית מסורתית הופכת לפיגום 3D עם עובי הרצוי, המרחק, נקבוביות nanotopographic רמזים כדי לאפשר תא זריעה והתפשטות דרך ירידת נוזלים2 CO subcritical. בנוסף עשו איתו התחדשות רקמות להתרחש, שיטה זו מספקת גם את ההזדמנות כדי לתמצת מולקולות ביו כגון פפטידים מיקרוביאלית למשלוח סמים מקומי. CO2 מורחבת nanofiber פיגומים החזק פוטנציאל התחדשות רקמות, ריפוי פצעים, מידול תלת-ממד רקמות ו תרופות אקטואלי.
Introduction
הרעיון של פיתוח לפיגום סינתטי, זה יכול להיות מושתל לתוך חולים כדי לסייע רקמות תיקון והתחדשות הוא זה יש חילחלו השדה רפואה רגנרטיבית במשך עשרות שנים. לגרדום סינטטי אידיאלי מגישה לזירוז נדידת תאים שבסביבה רקמה בריאה, מספקת ארכיטקטורה התא זריעה אדהזיה, איתות, התפשטות, בידול, תומך vascularization, מאפשר חמצון נאותה, תזונה משלוח, ומקדם את הפעילות החיסונית המארח כדי להבטיח הצלחה לאחר ההשתלה1. בנוסף, זה יכול לשמש כנשא להטבעת מולקולות מיקרוביאלית לסייע1,3,6,7,8,9ריפוי הפצע. היכולת לשלוט על שחרורו הזמני של מולקולות אלה ביולוגי מן לגרדום סינתטי הוא תכונה רצויה אחרת הנחשב מתי הנדסה פיגומים1.
Electrospinning כבר טכניקה היטב שימוש להפקת nanofiber פיגומים1,2,3,4,5,6. ניסיונות קודמים כדי ליצור לפיגום nanofiber כמו האחד והנכון עשו בדרגות שונות של הצלחה. עם זאת, nanofiber מסורתיים פיגומים מוגבלת יכולות כדי להשיג מטרות אלה. פיגומים nanofiber המסורתיים היו בעיקר מחצלות מימדי1,3. פיגומים אלו nonexpanded, בצפיפות מלאים גדלים הנקבובית קטן; זה מגביל תא הסתננות, הגירה, בידול כמו זה אינו מקדם סביבה די דומות לאלה שנמצאו ויוו8,7,1,9. מסיבה זו, הוקמו טכניקות חדשות של 3D electrospun nanofiber לגרדום הכנה לתקן את הפגמים הכרוכים שמגיעים עם מחצלות 2D nanofiber. טכניקות אלה לגרום פיגומים תלת-ממד; עם זאת, הם מוגבלת ישימות בשל שיטת ייצור הדורשים פתרונות מימית, ליופיליזציה הליכים. זה עיבוד תוצאות התפלגות אקראית nanofibers בלי הארגון מוגבלת, עובי נכונה, ו/או נקבוביות הרצוי כדי לספק הותאם nanotopographic נאותה הנחוצים נדידת תאים והתפשטות. גורמים אלה התוצאה הקודמת 3D electrospun פיגומים nanofiber חסרי נאותה חיקוי של חיים רקמות1,7,8,9.
ניסיונות מאוחרים יותר בפיתוח של לגרדום המורחב, 3D עם ביומימטיקה טוב יותר של מטריצה חוץ-תאית (ECM) בוצעו באמצעות טיפול פתרון המימית סודיום borohydride (NaBH4) בתבניות מוגדרות מראש כדי לסייע שליטה טובה יותר של צורת וכתוצאה מכך לגרדום7,8. עם זאת, שיטה זו אינה האידיאלי כפי שהוא דורש את השימוש של פתרונות מימית, תגובות כימיות ליופיליזציה שעלולות לפגוע פולימרים כל מולקולות שעברו אנקפסולציה שאינם מסיסים במים. ותוספים עלול לגרום גם לתופעות לוואי במהלך8,התחדשות רקמות9. השיטה הרחבה2 CO שתואר במאמר זה מאוד מפחית את זמן העיבוד, מבטלת את הצורך פתרונות מימית, ושומר את הכמות ואת הפונקציונליות של מולקולות פעילים ביולוגית במידה רבה יותר מאשר בעבר הקים שיטות9.
מחקרים קודמים, אנטיביוטיקה, כסף, 1α, 25 dihydroxyvitamin D3ו פפטיד מיקרוביאלית LL-37 היו נטען לתוך פיגומים nanofiber בנפרד, בשילוב לחקור את הפוטנציאל של פיגומים אלו לשחרר סוכנים סיוע נוספת ב9,10,12,13ריפוי הפצע. לצורך הדגמת שיטת nanofiber לגרדום הרחבה, Coumarine 6, הפלורסנט, ייטען לתוך לגרדום הטמון הטבעה לגרדום עם תרכובות שונות הרצוי. שיטה זו של ייצור לגרדום nanofiber המורחב בשיתוף עם מולקולות ביו במארז בעל פוטנציאל התחדשות רקמות, ריפוי פצעים, היצירה של רקמת תלת-ממד מודלים ו מסירת תרופות אקטואלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ויוו ההליכים המתוארים להלן אושרו על ידי ועדת IACUC במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.
1. מכינים את הפתרונות עבור Electrospinning רגיל
- שפופרת זכוכית 20 מ"ל, לפזר 2 גר' poly(ε-caprolactone) (PCL, Mw = 80 kDa) בתערובת ממס של דיכלורומתאן (DCM) ו- N, N-dimethylformamide (DMF) עם קצבה 4:1 (v/v)-ריכוז של 10% (w/v).
התראה: ידית DCM ו DMF בשכונה מאוורר היטב כדי למנוע חשיפה האדים. אין לחשוף DCM חומרים פלסטיים. - להכניס את מבחנה בתוך מסובב המעבדה עד הפתרון נעשה ברור. הפתרון יכול לערבב בין לילה.
- אם מתוך כוונה להטביע ביו חומרים כמו פפטידים או סמים לתוך לגרדום, ליצור פתרון נפרד, לאחסן בטמפרטורה 4 ° C עד מוכן לשימוש.
- הכינו את הפתרון הפלורסנט (50 מ"ג/מ"ל) באמצעות 20 מ של פתרון PCL.
2. להרכיב את המערכת Electrospinning (איור 1A)
- להוסיף את הפתרון PCL מזרק 20 מ עם מחט בוטה מד 21 המצורפת. ודא כי שם אין אוויר במזרק, אבובים המשויך.
- במקום תוף מסתובב פלדה עם האספן הקרקע 12 ס מ בקצה המחט.
- שימוש בקליפים התנין, להתחבר אספקת חשמל מתח גבוה זרם ישר (DC) המחט ולהבטיח כי האספן. היא מקורקעת.
התראה: תמיד לבטל את אספקת החשמל לפני טיפול כל חומר המחובר.
3. Electrospinning
- עבור mL 20 בפתרון PCL, להגדיר את הפרמטרים של המשאבה מזרק כדלקמן: קוטר = 20.27 מ מ, קצב הזרימה = 0.5 mL/ה הסימון אם טיפות יוצרים בקצה המחט.
- אם שילוב של מולקולות ביו רצוי, להרכיב את המערכת כדי לאפשר electrospinning co-צירית (איור 1B). צור זרבובית קואקסיאליים מותאם אישית באמצעות מזרקים.
הערה: חרירי כזה הינם גם זמינים מסחרית. שימו לב כי פתרון של צבע מוכן כדי לדמות את הוספת מולקולות כאלה.- להכין פתרון 1% של הפלורסנט קומרין 6 במים. להוסיף 3 מ"ל של 1% לצבוע מזרק קטן. לחבר את המזרק הזרבובית קואקסיאליים אותו כפתרון PCL. שוב, ודא כי ישנם אין בועות אוויר.
- על הפתרון הזה 3 מ"ל, להגדיר את הפרמטרים של המשאבה מזרק כדלקמן: קוטר = 9.49 מ מ, קצב הזרימה = 0.02 נקודות mL/ה הסימון אם טיפות יוצרים בקצה המחט.
- החלת פוטנציאל חשמלי של 20 kV בין אספן הקרקע את spinneret (מחט בקוטר 22) ממוקם 20 ס מ בלבד spinneret. לאסוף מחצלות nanofiber מיושר תוף מסתובב ב-2000 סל ד. לאסוף מחצלות nanofiber PCL ברגע שיגיעו עובי של ~ 1 מ מ.
4. דור של PCL Nanofiber מחצלות עם חורים ערוכים.
- לפברק PCL nanofiber מחצלות.
- להמיס PCL חרוזים ב תערובת הממס המורכב DCM ו DMF עם יחס של 4:1(v/v)-ריכוז של 10% (PCL) (w/v). משאבה הפתרון PCL בספיקה של 0.7 מ ל/h באמצעות מזרק משאבה בזמן פוטנציאל של 20 kV מוחל בין spinneret (מחט 22-gage) וממוקם אספן מוארק 12 ס מ spinneret.
- לאסוף את הקרום nanofiber באמצעות תוף מסתובב עם מהירות סיבוב גדול מ 500 סל ד.
- לטבול מחצלות nanofiber PCL נוזלי N2 במשך 5 דקות (כלומר., להיות נוקשה). לשמור על מחצלות nanofiber PCL נוזלי N2 , אגרוף PCL nanofiber מחצלות עם אגרוף 0.5 מ מ קוטר.
5. הרחבת 2D Nanofiber מחצלות עם או בלי החורים ערוכים ויה Subcritical CO2 נוזל (איור 2).
- מניחים מחצלות nanofiber PCL חנקן נוזלי עבור 5 דקות וחותכים לריבועים 1 ס"מ על 1 ס"מ באמצעות מספריים כירורגיים חדה בזמן שקועים חנקן נוזלי כדי למנוע דפורמציה של הקצוות.
- מקום על המזרן לחתוך שפופרת צנטרפוגה 30 מ עם ~ 1 גר' קרח יבש. בחוזקה כובע המכסה ולאפשר קרח יבש להחלפה CO נוזלי2.
- לאחר שהנוזל הקימה בצינור, במהירות לשחרר את הלחץ על-ידי פתיחת הכיפה.
התראה: להשתמש ציוד מגן תרמי מתאים בעת עבודה עם חנקן נוזלי וקרח יבש. אל תפתח את הצינור מווסת כלפי הפנים. הצינור צנטריפוגה לא אמור לשמש שוב ושוב. - הסר ובדוק אם צוינו לגרדום פצפוצי מהצינור. הכנס לגרדום שפופרת צנטרפוגה חדש עם קרח יבש וחזור עד לעובי הרצוי מושגת. לחטא פיגומים nanofiber המורחב של-אתילן אוקסיד לפני הדגירה עם תאים.
6. אפיון Nanofiber המורחב פיגומים
- לאפיין את המורפולוגיה ואת המבנה של פיגומים nanofiber המורחב באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM).
- למקם את הדגימות עם דו-צדדית קלטת מוליך מתכתי הרבעה, מעיל עם פלטינה עבור 40 s באמצעות עם coater לרעוד. להוציא בגיל 40 מא.
- לבחון את הסיבים באמצעות SEM לפי מחקרים קודמים9. לאסוף את התמונות במתח מאיץ של 15 kV.
- לאפיין במבחנה שחרור ופרופילי אתריים של פפטידים שפורסמו.
- משקל 10 מ ג של ממברנות nanofiber לפני ואחרי ההרחבה CO2.
- לטבול את הדגימות במאגר PBS ולאסוף μL 10 של תגובת שיקוע בנקודות זמן שונות (0-28 ימים).
- השתמש Enzyme-Linked חיסונית Sorbent Assay (אליסה) קיט לכמת את הריכוז פפטיד LL-37 ב תגובת שיקוע שנאספו.
- בחן את תגובת ויוו , המארח הסתננות תאית.
- הכניסו את החולדות ספראג-Dawley (SD) 9 - בן שבועיים תא הרדמה, להתחבר איזופלוריין אדי, עזים ומתנגד העכברושים. העברת החולדות שולחן הניתוחים לאחר העכברושים להפוך הרדמה מלאה ללא רגשות. ללא הרף עזים ומתנגד החולדות באמצעות קונוס איזופלוריין-האף עם מכשיר אידוי במהלך הניתוח. לגלח את השיער של הגב של חולדה על ידי מכונת הגילוח של חיה ולחטא אותו עם יוד ואלכוהול קרצוף העור. צור תת עורית כיסים דרך חתכים 1.5 ס מ supraspinal אתרים-dorsum באמצעות אזמל.
- הכנס nanofiber מורחב אחד לגרדום (1.5 מ מעבה) לתוך הכיס תת עורית באמצעות פינצטה עבור כל החתך. סגור את החתך בעזרת מהדק.
- ב- 1, 2 ו- 4 שבועות, המתת חסד החולדות עם 95% CO2. בעדינות לנתח את explant ואת הרקמה שמסביב באמצעות מספריים כירורגיים. לפני ניתוח היסטולוגית, לטבול את הרקמה בפורמלין לפחות 3 ימים ולאחר מכן הטבע עם פרפין. אזור הרקמה עם מיקרוטום ולאחר מכן לבצע hematoxylin אאוזין (H & E), צביעת trichrome מאסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היעילות של הרחבת electrospun דו-ממדית מסורתית nanofiber מחצלות לתוך פיגומים תלת-ממד באמצעות לחצים של נוזל2 CO subcritical הודגם בתפקידים שונים: העובי של פיגומים עלה מ 1 מ"מ כאשר מטופל-2.5 מ מ, 19.2 מ"מ עם אחד ושני CO2 טיפולים, בהתאמה (איור 3 א-ג). המאפיין נקבוביות-a של הארכיטקטורה קריטי עבור תא זריעה-גם הגדילה באופן התואם עובי מוגברת (איור 3C). נקבוביות פיגומים עלה מ 79.5% עבור לא מטופל מחצלות 92.1 ו 99.0% לאחר הטיפולים הראשונה והשניה, בהתאמה (דמות תלת-ממד). זה משמעותי כי מידת תא לחדירה לפיגום ובכך יעילותה לזירוז התחדשות תלויה במידה רבה נקבוביות1.
תמונות SEM חשף כי המבנה בצפיפות, fibrillar של לא מטופל מחצלות 2D הפכו מבנים מסודרות, שכבתית עם nanofibers מיושר לאחר הרחבה עם CO2 (3E איור-H). מחקרים קודמים הגיעו למסקנה כי מבנים באופן דומה בשכבות בסיבי מאורגן יכול להיות קריטי לשימור nanotopographic כשמתרחשים ולחידוש רקמות כגון גיד, שרירים, עצבים7,8. עם זאת, מחקרים אלה בחן פיגומים מורחבת עם NaBH-4-7,-8. שיטה זו דורשת תוספת עיבוד ממיסים זה ייתכן ליץ מולקולות ביו מ-7,לגרדום8וזמן. NaBH4, סוכן צמצום חזק, יכול להגיב עם מולקולות ביו שעברו אנקפסולציה. לעומת זאת, השימוש subcritical נוזל CO2 להרחבת הוצגה כדי לשמר את bioactivity של מולקולות נוספות נזרע מראש לתוך לגרדום בהשוואה פיגומים מורחב באמצעות שיטת4 NaBH (איור 4). זה הודגם באמצעות צבע קומרין 6; הצבע הירוק של לצבוע היה כדאי נשמרים בפיגומים מורחבת ב- CO2 (איור 4), המציין כי השימוש subcritical CO2 נוזל עבור הרחבת תוצאות תוך שמירה טובה יותר היושרה של מולקולות כמוס ב PCL פיגומים.
קינטיקה שחרור של מיקרוביאלית פפטיד LL-37 מתוך פיגומים לפני ואחרי הרחבה היו נמדד ב- vitrovia אליסה לפי הוראות היצרן (איור 5A). היעילות מיקרוביאלית של פיגומים nanofiber טעון-פפטיד LL-37 לפני ואחרי הרחבה עם CO2 היה מוערך באמצעות הדגירה עם Pseudomonas aeruginosa (aeruginosa פ). מספר מושבות מגורים הדגירה פוסט עם פיגומים הייתה לכמת. התוצאות הראו כי את פעילות מיקרוביאלית של CO2-פיגומים המורחב, LL-37-טעון היה דומה כי של פיגומים LL-37-טעון לא מורחב, המציין כי תהליך הרחבת יכול לשמר את bioactivity של אנקפסולציה LL-37 פפטידים (איור 5B).
מחקרים נוספים ויוו בוצעו על ידי השתלה תת עורית של CO2-התרחב פיגומים nanofiber עם חורים מסודר במערך מרובע חולדות. דבר זה מאפשר העברה הסלולר, התפשטות בתוך החורים חדירה נוספת בתוך הרבדים nanofiber שנוצרו במהלך הרחבת (איור 6). לגרדום המורחב הראו עלייה משמעותית במספר כלי הדם נוצר (איור 6C, E) ותאים multinucleated ענק (איור 6D, F) משבוע 1-4 פוסט השרשה. נוסף immunohistological מכתים תוצאות המצוין, ירידה של המספר של C-C כימוקין קולטן הקלד 7 (CCR7) - חיובי הסתננו מקרופאגים ועלייה של מספר האשכולות של בידול 206 (CD206) - חיובי הסתננו מקרופאגים משבוע 1 לשבוע 4 לאחר ההשתלה.
איור 1: הגדרת טיפוסי electrospinning. מנגנון electrospinning קואקסיאלי טיפוסי מוצג. Electrospinning דורש שלושה מרכיבים עיקריים: ספק כח בעל מתח גבוה spinneret, אספן מוליכות חשמלית. ספינינג קואקסיאליים משתמש שני נוזלים כדי לסובב לפיגום nanofiber; דבר זה מאפשר ומגעים מולקולות אחרות. ניתן בתוספת יישור Nanofiber וההרכבות דרך האספן על ידי שינוי מהירות הסיבוב הכניסה של התוף סיבוב. ב פרוטוקול זה, נוצרה זרבובית מותאם אישית באמצעות שני מזרקים. חרירי דומים זמינים מסחרית. איור זה כבר ממאמרו של שיה, ואח14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שלבים של התרחבות לגרדום באמצעות נוזל subcritical של2 CO. (א) השתמש מיכל sealable, יכול לעמוד בלחץ, כמו שפופרת צנטרפוגה פלסטיק 30 מ. (B) להוסיף חתיכת 1 ס"מ על 1 ס"מ 2D מחצלת nanofiber PCL. (ג) להוסיף ~ 1 גר' קרח יבש. (ד) חותם את המכולה. (ה) מאפשרים לחץ בצינור. זה יהפוך את מלא CO2 CO נוזלי2. כאשר הנוזל אסף, במהירות שחרר את החותם של הצינור. זה יגרום את נוזלי CO2 במהירות להפוך גז CO2, וכתוצאה מכך CO2 המגובש על המזרן 2D nanofiber. (נ) להתבונן לגרדום תלת-ממד. שלבים אלה ניתן לחזור עד לעובי הרצוי מושגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ויזואליזציה של 2D מחצלות לפני ואחרי הרחבה עם נוזל subcritical של2 CO. (א) תמונה מראה PCL מחצלות nanofiber לפני הטיפול של נוזל2 CO subcritical (ימין) ואחרי הטיפול הראשון (משמאל). (B) תמונה מראה PCL מחצלת nanofiber לפני הטיפול הראשון עם CO2 subcritical נוזל (מימין), לאחר הטיפול השני (משמאל). (ג) הגרף מראה את עוביים של PCL סיבים מחצלות לפני ואחרי טיפולים אחד ושני עם נוזל subcritical של2 CO. (ד) הגרף מראה את נקבוביות היחסי של PCL סיבים מחצלות לפני ואחרי טיפולים אחד ושני עם נוזל subcritical של2 CO. (E-H) התמונה מציגה את מראה חתך של מחצלות PCL שנלכדו באמצעות תמונה ב- SEM (E-F) SEM של PCL מחצלות סיבים לפני הטיפול. (G-H) תמונת SEM של PCL מחצלות סיבים לאחר שני טיפולים עם נוזל subcritical של2 CO. איור זה כבר ממאמרו של ג'יאנג, ואח9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: קומרין 6 שנטענו לצבוע PCL nanofiber מחצלות לפני ואחרי הרחבה עם נוזל subcritical של2 CO ותמיסה מימית של4 NaBH. (א) תמונות להראות בגסות את כמות צבע Coumarine 6 נותרה ב PCL פיגומים בעקבות הרחבה עם CO2 (מימין) ו- NaBH4 (משמאל). (B) תמונות להראות דוחה העליון נוף PCL פיגומים פלורסצנטיות המקביל שלהם לפי הסדר הבא: לגרדום Raw (הימנית התחתונה), מחצלת 2D נטען עם Coumarine 6 צבע (למעלה מימין), PCL לגרדום טעון עם צבע Coumarine 6 מורחבת עם CO2 ( למעלה משמאל), NaBH4 (משמאל למטה). (ג) הגרף מראה עוצמת קרינה פלואורסצנטית קומרין 6 לצבוע אחרי מחצלות PCL ללא טיפול, מורחבת דרך נוזל subcritical של2 CO מורחבת דרך NaBH4 טיפולים. קרינה פלואורסצנטית הייתה לכמת J תמונה בתוכנות. איור זה כבר ממאמרו של ג'יאנג, ואח9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מולקולות ביו במארז PCL פיגומים. (א) גרף מתאר השחרור היחסי של פפטיד מיקרוביאלית LL-37 ב- 2D ממברנות, subcritical CO2 נוזל מורחב 3D פיגומים (B) גרפים מתארים את היעילות מיקרוביאלית של מזרנים nanofiber PCL שונים כאשר הם נחשפים P . aeruginosa. איור זה כבר ממאמרו של ג'יאנג, ואח9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: In vivo התגובות של PCL פיגומים nanofiber עם או בלי הרחבה באמצעות subcritical CO2 באתרים dorsum תת עורית של חולדות. (א) צביעת המטוקסילין -אאוזין. נקודות ירוקות לייעד את גבולות התא הסתננות. (B) trichrome הכתם של מאסון. החצים הירוקים לייעד את התצהיר קולגן. (ג) מוגדל מאוד התמונה של צביעת המטוקסילין -אאוזין. החצים הירוקים לייעד את כלי הדם. (ד) מאוד בתמונות מוגדלות של צביעת המטוקסילין -אאוזין. החצים הירוקים לייעד תאי ענק. (E) גרף מתאר את צמיחת כלי דם לכל מ מ2. (נ) גרף מכמת את מספר תאי ענק לחדור לתוך מסורתי מחצלות PCL 2D לעומת מחצלות PCL מורחבת עם subcritical CO2. איור זה כבר ממאמרו של ג'יאנג, ואח9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
להפוך electrospun דו-ממדית מסורתית nanofiber מחצלות המורחב פיגומים תלת-ממד באמצעות CO2 לחצים נחקר. Nanofiber דו-ממדית מסורתית מחצלות בהצלחה המורחב באמצעות subcritical נוזל2 CO. השלבים הקריטיים הם לפברק 2D nanofiber מחצלות תחת תנאי ממוטבת ואחתוך מחצלות ללא עיוות בקצוות (למשל., באמצעות מספריים כירורגיים). זה CO2-nanofiber המורחב פיגומים יש יתרונות רבים על מחצלות 2D המסורתי כולל מבני שכבות (איור 3 א-B), פחות אריזה צפיפות (איור 3D-H), נקבוביות גבוהה יותר (איור תלת-ממד). שיטה זו הרחבה הוא גם יתרון ביחס לשיטות הקיימות הרחבה כי זה מהיר יותר לעבד ומפחית אובדן הכולל של מולקולות ביולוגיים פעילים שעברו אנקפסולציה עקב אי-הכללה של טכניקה זו של פתרונות מימית, ליופיליזציה הליכים8,9. עם זאת, המגבלה של טכניקה זו היא כי המורפולוגיה של פולימרים nanofibers לא להיות מעוותים/מומס בנוזל2 CO subcritical. לדוגמה, מחצלות nanofiber PLGA (50: 50) לא ניתן להרחיב בעזרת טכניקה זו. מחצלות nanofiber כזה יכול להיות מורחבת שימוש בנוזלים גז אחרים.
שלנו מחקרים קודמים הדגימו כי תאים נזרע בצורה יותר אחידה בתוך nanofiber המורחב פיגומים בהשוואה ל- 2D מחצלות8. בעבודה זאת, קצב מוגבר באופן משמעותי היווצרות כלי דם אירעה (איור 6C, E), המארח תא החיסון תסנין נצפו בתוך CO2-מורחבת פיגומים nanofiber עם חורים מסודר במערך מרובע בעקבות השתלה תת עורית בחולדות (איור 6D, F). אנגיוגנזה וחדירה תא החיסון מציינים כי לגרדום מרתקים עם רקמת המארח, ייתכן ביות התאים הדרושים ולשם רגנרציה של רקמות פגועות; זה מרמז על שיעור גבוה יותר של הצלחה שלאחר ההשתלה לתוך מארח9.
ה-CO2-פיגומים מורחב גם יש פוטנציאל משולבים עם מגוון של פפטידים, מולקולות אחרות אשר יכול לסייע בהשגת התגובה הרצויה. כאן, האפקט הרצוי הוא להיות עשו איתו התחדשות רקמות בבד עם מתן פעילות מיקרוביאלית דרך פפטיד LL-37 incorporated. פיגומים מורחבת עם נוזל2 CO subcritical הראה גם שמירה טובה יותר של מולקולות incorporated בהשוואה פיגומים מורחבת עם NaBH4. מולקולות צבען אנקפסולציה בתוך פיגומים PCL היו יותר טובים נשמר (איור 4). בנוסף, שיעור מעט גדול יותר של פפטיד מיקרוביאלית LL-37 אנקפסולציה שוחרר מן ה-CO 3D2 מורחבת פיגומים בהשוואה מחצלות 2D (איור 5A). Bioactivity של LL-37 היה שייעשה בו שימוש בתור CO2 מורחבת פיגומים הראה יעילות מיקרוביאלית דומה בהשוואה פיגומים 2D (איור 5B).
שיטה חדשה של התרחבות תלת-ממד זה מרמז על ההפקה בפיגומים סינתטי אינו מוגבל לשימוש של מחצלות 2D nanofiber. הנתונים המוצגים מציע שיטה הרחבה זו כדאי לשמור את הכמות ואת bioactivity של חומרים ביו שעברו אנקפסולציה בתוך nanofiber המורחב פיגומים. במקביל, פיגומים nanofiber המורחב לחקות את סביבות nanotopographic של אלה שנמצאו ויוו9, תכונה מאוד מסייע גרימת התחדשות רקמות1. בעתיד, אלה CO2-פיגומים המורחב שייתכן יישומים פוטנציאליים הסיוע של הפצע ריפוי ורקמות התחדשות באותה מידה כמו רקמות 3D דגם ויצירת תרופות מבוקרת באופן מקומי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
מחברים מכריז שאין אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של לאומי המכון כללי רפואי למדע (NIGMS) ב- NIH (20 P 2 GM103480-06 ו- 1R01GM123081 כדי J.X.), את הכספים אוטיס גלאבה קרן למחקר רפואי, NE LB606 ו אתחול הרפואי אוניברסיטת נברסקה מרכז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-199-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Rotating Steel Drum | customized | This serves as a collector during electrospinning. | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Coaxial spinning requires two single syringe pumps. |
| Revolver | Lab Net International | H5600 | Adjustable lab rotator for mixing solutions |
| Hypodermic Needle (27G x 1 1/2") | EXCELINT International Co | 26426 | This is part of the example customized coaxial nozzel shown. |
| Hypodermic Needle (21G x 1 1/2") | EXCELINT International Co | 26416 | This is part of the example customized coaxial nozzel shown. |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | |
| LL 37 ELISA Kit | Hycult Biotech | HK321-02 |
References
- Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
- Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626 (2015).
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
- Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
- Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
- Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
- Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
- Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
- Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
- Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
- Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
- Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).
