Summary
Bu makalede, bir üç-boyut (3D) iskele üzerinden depressurization süperkritiğe CO2 sıvı içine bir geleneksel, iki-boyut (2D) electrospun nanofiber mat genişletme tekniği gösterilir. Bu artar iskele 3D, yakından kopyalama hücresel nanotopographic yardımlar, vardır ve biyolojik moleküllerin nanofibers içinde kapsüllenmiş işlevlerini korumak.
Abstract
Electrospinning üreten bir sentetik, fonksiyonel iskele hücre dışı matriks ve bileşimi, yapısı ve elyaf çapı kolaylığı kontrolünü Biyomimikri nedeniyle tercih edilen teknoloji olmuştur. Ancak, bu avantajlara rağmen geleneksel electrospun nanofiber iskele sınırlamalar da dahil olmak üzere gel nanofiber yönünü, düşük gözeneklilik, küçük gözenek boyutu ve esas olarak iki boyutlu paspaslar dağınık. Bu nedenle, yukarıdaki sınırlamalar üstesinden gelebilir electrospun nanofiber iskele imalatı için yeni bir süreç geliştirmek için büyük bir ihtiyaç vardır. Burada, roman ve basit bir yöntem gösterilmiştir. Bir geleneksel 2D nanofiber mat 3D bir iskele istediğiniz kalınlıkta, gap mesafe, porozite ve hücre tohum ve depressurization süperkritiğe CO2 sıvı yoluyla yayılması için izin vermek için nanotopographic yardımlar ile dönüştürülür. Gerçekleşmesi doku rejenerasyonu için bir iskele sağlamaya ek olarak, bu yöntem aynı zamanda yerel ilaç dağıtım için antimikrobiyal peptidler moleküllerin biyoaktif kapsüllemek için fırsat sağlar. CO2 genişletilmiş nanofiber iskele doku yenilenmesi, yara iyileşmesi, 3D doku modelleme ve topikal ilaç dağıtım büyük potansiyele sahip.
Introduction
Hastaların doku onarımı ve rejenerasyon yardım içine implante bir sentetik iskele geliştirme kavramı rejeneratif tıp alanında yıllardır nüfuz biridir. İdeal sentetik iskele sağlıklı dokuyu çevreleyen gelen hücre göç ikna etmek için hizmet vermektedir, hücre tohum, adezyon, sinyal, yayılması ve farklılaşma, destekler vaskülarizasyon için bir mimari sağlar, için yeterli oksijenlenme sağlar ve beslenme teslim ve başarı implantasyon1sonra emin olmak için ana bilgisayar bağışıklık etkinliğini teşvik etmektedir. Ayrıca, bu bir taşıyıcı olarak antimikrobiyal molekülleri gömmek için1,3,6,7,8,9şifa yarada yardımcı olmak için kullanılabilir. Sentetik iskele zamansal yayınlamasını biyolojik moleküllerin kontrol yeteneği ne zaman mühendislik1iskele olarak kabul edilir başka bir arzu özniteliğidir.
Electrospinning nanofiber iskele1,2,3,4,5,6üretimi için iyi kullanılan bir teknik olmuştur. Burada tartışılan biri gibi nanofiber iskele oluşturmak için önceki girişimleri başarı değişik derecelerde için yapılmıştır. Ancak, geleneksel nanofiber iskele bu hedeflere ulaşmak için yetenekleri sınırlı olabilir. Geleneksel nanofiber iskele çoğunlukla iki boyutlu paspaslar1,3olmuştur. Bu nonexpanded iskele yoğun küçük gözenek boyutları ile paketlenir; vivo1,7,8,9bulunanlar için benzer bir ortam teşvik değil gibi bu hücre infiltrasyonu, geçiş ve farklılaşma sınırlar. Bu nedenle, 3D electrospun nanofiber iskele hazırlık yeni teknikleri ile 2D nanofiber paspaslar gelip doğasında kusurlarını değiştirilmesi için kurulmuştur. Bu teknikler 3D iskele neden; Ancak, uygulanabilirlik sulu çözümler gerektiren ve yordamlar dağılması üretim yöntemleri nedeniyle sınırlı olabilir. Bu işleme nanofibers sınırlı organizasyon, uygun kalınlık ve/veya hücre göç ve yayılması için gerekli olan yeterli nanotopographic yardım sağlamak için istenen porozite olmadan rasgele dağıtıma sonuçlanır. Bu faktörlerin yaşam yeterli asla bilemeycek eksikliği önceki 3D electrospun nanofiber iskele neden doku1,7,8,9.
Hücre dışı matriks (ECM) daha iyi Biyomimikri ile bir genişletilmiş, 3D iskele geliştirme daha yeni girişimler performans daha iyi kontrol altında yardım etmek için bir sulu sodyum borhidrür (NaBH4) çözüm tedavi ve önceden tasarlanmış kalıpları kullanarak İskele yapısı-7,8elde edilen şekli. Ancak, bu yöntem polimerler ve suda çözünen kapsüllenmiş herhangi bir biomolecules ile girişime neden olabilir sulu çözümler, kimyasal reaksiyonlar ve dağılması kullanımını gerektirir gibi ideal değildir. Kullanılan katkı maddeleri de doku rejenerasyonu8,9sırasında yan etkilere neden olabilir. Büyük ölçüde bu makalede özetlenen CO2 genişletme yöntemi işlem zamanı azaltır, sulu çözümler ortadan kaldırır ve tutar ve biyolojik olarak aktif molekülleri daha büyük ölçüde işlevselliğini korur daha önce kurulan yöntemleri9.
Önceki çalışmalar, antibiyotik, gümüş, 1α, 25 dihydroxyvitamin D3ve antimikrobiyal peptid LL-37 yüklü nanofiber iskele ayrı ayrı ve birlikte acentelere serbest bırakmak için bu iskele potansiyelini araştırmak için daha fazla9,10,12,13şifa yarada yardım. Bu yöntem nanofiber iskele genişleme gösteren amacıyla, Coumarine 6, floresan bir boya, iskele iskele ile çeşitli istenen bileşikler katıştırma potansiyel göstermek içine yüklenir. Genişletilmiş nanofiber iskele imalatı kapsüllenmiş biyoaktif molekülleri ile birlikte bu yöntem doku yenilenmesi, yara iyileşmesi, 3D doku modellerinin oluşturulması ve ilaçların topikal teslim büyük potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda verilen tüm vivo içinde yordamlar Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'nde IACUC Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Standart Electrospinning için çözümleri hazırlayın
- 20 mL Cam tüp poly(ε-caprolactone) 2 g dağıtılması (PCL, Mw = 80 kDa) diklorometan (DCM) bir solvent karışımı ve N, N-dimethylformamide (DMF) ile bir konsantrasyon % 10 (w/v), 4:1 tayın (v/v).
Dikkat: Tanıtıcı DCM ve iyi havalandırılmış bir başlıklı DMF duman maruz önlemek için. DCM plastik malzemeler için maruz bırakmayın. - Çözüm açık hale gelinceye kadar cam tüp bir laboratuvar rotator yerleştirin. Çözüm gecede karışımı.
- Peptidler veya uyuşturucu gibi biyoaktif maddeler iskele katıştırmak isterseniz ayrı bir çözüm oluşturmak ve kullanmak için hazır kadar 4 ° C'de depolayın.
- 20 mL PCL çözeltisi kullanarak floresan boya solüsyonu (50 mg/mL) hazırlayın.
2. Electrospinning aparatı (şekil 1A) ayarla
- PCL çözüm bağlı 21 ölçer künt iğne ile 20 mL şırınga ekleyin. Havasız şırınga ve ilişkili boru içinde olduğundan emin olun.
- Zemin toplayıcı 12 cm iğne ucu ile dönen bir çelik tambur yerleştirin.
- Timsah klipleri kullanıyor, iğne için doğru akım (DC) yüksek gerilim güç kaynağını bağlayın ve toplayıcı topraklı olduğuna dikkat edin.
Dikkat: Her zaman bağlı herhangi bir malzeme işleme önce güç kaynağı devre dışı.
3. Electrospinning
- PCL çözüm 20 mL şırınga pompa parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: çapı = 20.27 mm, akış hızı = 0.5 mL/h. onay ise damlacıkları iğne ucunda oluşturuyoruz.
- Biyoaktif moleküllerin birleşme isterseniz aparatı koaksiyel electrospinning (Şekil 1B)izin vermek için ayarlayın. Özelleştirilmiş bir koaksiyel meme Hipodermik iğneler kullanarak oluşturun.
Not: Bu tür püskürtme uçlarını da ticari olarak kullanılabilir. Not boya çözeltisi böyle molekülleri ekleme benzetimini yapmak için hazırlanmıştır.- Floresan boyalar suda Coumarin 6 %1 çözeltisi hazırlamak. 3 mL % 1 boya küçük bir şırınga ekleyin. Şırınga aynı koaksiyel meme PCL çözüm olarak bağlayın. Bir kez daha, hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.
- Bu 3 mL solüsyon için şırınga pompa parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: çapı = 9,49 mm, debi 0,02 mL/h. onay = Eğer damlacıklar iğne ucunda oluşturuyoruz.
- Geçerli bir elektrik potansiyeli 20 kV (22'lik iğne) spinneret ve bir yere toplayıcı arasında yer alan 20 cm uzakta spinneret. 2.000 rpm'de döner davul hizalanmış nanofiber paspaslar toplamak. Bir kez onlar uzanmak ~ 1 mm kalınlığında PCL nanofiber paspaslar toplamak.
4. nesil PCL Nanofiber ile dizilmiş delik paspaslar.
- PCL nanofiber paspas imal.
- PCL boncuk 4:1(v/v) adlı bir konsantrasyon (PCL) (w/v) % 10 oranında DCM ve DMF oluşan bir solvent karışımı geçiyoruz. PCL çözüm 0.7 mL/h bir şırınga pompa süre 20 potansiyelini kullanarak akış hızında pompa kV spinneret (22-gage iğne) arasında uygulanan ve topraklı bir koleksiyoncu 12 cm spinneret dışında bulunan.
- Dönen bir hızla 500 rpm büyük döner davul kullanarak nanofiber membran toplamak.
- PCL nanofiber paspaslar sıvı N2 5 min için bırakın (i.e., sert). PCL nanofiber paspaslar sıvı N2 ' deki tutmak ve PCL nanofiber paspaslar ile 0,5 mm çap yumruk yumruk.
5. 2D Nanofiber genişlemesi dizilmiş delik üzerinden süperkritiğe CO2 sıvı olan/olmayan (Şekil 2) paspaslar.
- 5 min için sıvı azot PCL nanofiber paspaslar yerleştirin ve deformasyon kenarlarının önlemek için sıvı azot sular altında iken keskin cerrahi makas kullanarak 1 cm x 1 cm kareler kesin.
- Kesme mat ~ 1 g kuru buz bir 30 mL santrifüj tüpü yerleştirin. Sıkı kapağını kap ve kuru buz sıvı CO2değiştirmek izin vermek.
- Bir kere sıvı tüp oluşturmuştur, hızlı bir şekilde baskı kapağı açarak serbest bırakın.
Uyarı: uygun Termal koruyucu giysiler sıvı azot ve kuru buz ile çalışırken kullanın. Yüz doğru Basınçlı Tüp açmayın. Santrifüj tüpü tekrar tekrar kullanılmamalıdır. - Kaldırmak ve tüp kahvaltılık iskele gözlemlemek. İskele Kuru buz ile yeni bir santrifüj tüpü yerleştirin ve istenilen kalınlık elde kadar tekrarlayın. Etilen oksit kuluçka hücrelerle önce genişletilmiş nanofiber iskele sterilize.
6. genişletilmiş Nanofiber iskele karakterizasyonu
- Morfoloji ve Tarama elektron mikroskobu (SEM) kullanarak genişletilmiş nanofiber iskele yapısını karakterize eder.
- Bantlı Çift taraflı iletken metalik stud ve 40 için platin paltoyla örnekleri yer s 40, bir sputter coater kullanarak anne.
- SEM önceki çalışmalar9göre kullanarak lifleri inceleyin. İmge vasıl 15 hızlanan bir gerilim toplamak kV.
- Vitro yayın profilleri ve yayımlanan peptidler bioactivity karakterize eder.
- Ağırlığı 10 mg nanofiber membranlar öncesi ve sonrası genişleme CO2.
- PBS arabellek örneklerinde bırakın ve süpernatant farklı zaman noktaları (0-28 gün), 10 μL toplamak.
- Enzyme-Linked immün jelleştirici Assay (ELISA) kiti toplanan süpernatant LL-37 peptid konsantrasyon ölçmek için kullanın.
- Hücresel infiltrasyon vivo içinde ve ana bilgisayar yanıt inceleyin.
- 9 - eski hafta Sprague-Dawley (SD) fareler bir anestezi odasında koymak isoflurane buharı bağlanmak ve fareler anestezi. Fareler duygular olmadan tam anestezi olduktan sonra fareler bir işletim masa aktarın. Sürekli bir isoflurane-burun konisi buharlaştırıcı ile ameliyat sırasında kullanarak fareler anestezi. Bir hayvanın tıraş makinesi tarafından fare sırt saç tıraş ve iyot ve alkol deri bodur ile sterilize. 1,5 cm kesi yoluyla subkutan cepler supraspinal sitelerde bir neşter kullanarak patolojisi üzerinde oluşturun.
- Her kesi için cımbız kullanarak subkutan cep bir genişletilmiş nanofiber İskele yapısı-İskele (1.5 mm kalınlığında) takın. Bir zımba kullanarak kesi kapatın.
- 1, 2 ve 4 hafta, % 95 CO2farelerle ötenazi. Hafifçe explant ve cerrahi makas kullanarak çevreleyen doku incelemek. Histolojik Analizi önce formalin dokusunda en az 3 gün için bırakın ve parafin ile embed. Doku microtome ile bölüm sonra hematoksilen ve eozin (H & E), gerçekleştirmek Masson'ın trichrome boyama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geleneksel 2D electrospun nanofiber paspas 3D iskele yolu ile depressurization süperkritiğe CO2 sıvı içine genişletme etkinliği farklı kapasitelerde gösterilmiştir: iskele kalınlığı artmış 1 2,5 mm ile tedavi edilmediği zaman mm ve 19.2 mm CO2 tedaviler, bir ya da iki ile sırasıyla (Şekil 3A-C). Gözeneklilik-a özelliği hücre tohum için kritik mimarisinin-aynı zamanda artmış kalınlığı (Şekil 3 c) karşılık gelen bir şekilde arttı. Tedavi edilmemiş paspaslar için %79.5 92,1 %99,0 için birinci ve ikinci tedaviler sonra sırasıyla artan ve iskele (şekil 3D) gözeneklilik. Hücre penetrasyon içine bir iskele ve böylece rejenerasyon ikna etmek için onun etkinlik derecesini porozite1üzerinde büyük ölçüde bağlıdır çünkü bu önemlidir.
SEM görüntüleri tedavi edilmezse 2D paspaslar yoğun paketlenmiş, fibriler yapısını dönüştürülmüş olduğunu sipariş edilen, katmanlı yapılar hizalanmış nanofibers ile CO2 (Şekil 3E-H) ile genişleme sonra ortaya çıkar. Önceki çalışmalarda organize lifleri ile benzer şekilde katmanlı yapılar nanotopographic yardımlar yenilenme tendon, kas ve sinir7,8gibi dokuların korunması kritik olabilir sonucuna varmışlardır. Ancak, bu çalışmalar NaBH47,8ile genişletilmiş iskele inceledi. Bildiriyi ekstra zaman ve iskele7,8biyoaktif molekülleri leach çözücüler işleme. NaBH4, güçlü bir indirgeyici, kapsüllenmiş biyoaktif molekülleri ile tepki verebilir. Tersine, süperkritiğe CO2 sıvı kullanıma genişleme ek moleküllerin NaBH4 Yöntem (Şekil 4) kullanarak genişletilmiş iskele ile karşılaştırıldığında iskele içine önceden tohumlari bioactivity korumak için gösterildi. Bu Coumarin 6 boya kullanarak gösterilmiştir; boya yeşil rengini daha iyi süperkritiğe CO2 sıvı kullanıma daha iyi tutma içinde genişleme sonuçlarını molekülleri bütünlüğünü kapsüllenmiş gösteren CO2 ile (Şekil 4), genişletilmiş iskele içinde muhafaza edildi PCL iskele.
Antimikrobiyal peptid LL-37 önce iskele ve genişleme sonra ölçülen vitrovia içinde bir ELISA kiti üreticisinin yönergeleri (Şekil 5A) doğrultusunda yayın kinetik. Antimikrobiyal etkinliğini LL-37 peptid yüklü nanofiber iskele önce ve sonra CO2 genişleme üzerinden kuluçka Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ile değerlendirildi. Yaşam kolonileri yazı kuluçka iskele ile sayısal sayısı. Sonuçları gösterdi ki CO2Antimikrobiyal aktivite-genişletilmiş, LL 37 yüklü iskele LL 37 yüklü genişletilmemiş iskele genişleyen işlemi, bioactivity koruyabilir gösteren LL-37 kapsüllenmiş ki benzer peptidler (Şekil 5B).
Daha fazla in vivo çalışmalar CO2subkutan implantasyonu tarafından yürütülen-genişletilmiş nanofiber İskele Meydanı dizilmiş delikleri ile fareler için. Bu hücresel göç ve nükleer silahların yayılmasına karşı delikleri içinde yanı sıra daha fazla infiltrasyon genişleme (Şekil 6) sırasında oluşturulan nanofiber katmanlar içinde sağlar. Genişletilmiş iskele kan damarları (Şekil 6C, E) kurdu ve multinucleated dev (Şekil 6D, F) hücrelerden hafta 1-4 posta implantasyon sayısında önemli bir artış gösterdi. Daha fazla immunohistological boyama sonuçları belirtilen bir azalma C-C kemokin reseptör yazdığınız sayı 7 (CCR7) - pozitif sızmış makrofajlar ve farklılaşma 206 küme (CD206) sayısı artış - pozitif sızmış makrofajlar Haftaya 1 hafta 4 implantasyonu sonrası için.
Şekil 1: tipik electrospinning Kur. Bir tipik koaksiyel electrospinning aparatı gösterilir. Electrospinning üç önemli bileşenleri gerektirir: yüksek voltajlı güç kaynağı, bir spinneret ve elektriksel olarak iletken bir toplayıcı. Koaksiyel iplik iki sıvı bir nanofiber iskele döndürmek için kullanır; Bu diğer molekülleri Kapsülleme için sağlar. Nanofiber hizalama ve derlemeler toplayıcı döner davul dönme hızları değişen tarafından artar olabilir. Bu protokol için özelleştirilmiş bir meme iki Hipodermik iğneler kullanılarak oluşturulmuş. Benzer püskürtme uçlarını ticari olarak kullanılabilir. Bu rakam Xie, adapte edilmiş ve ark14. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Adımları süperkritiğe CO2 sıvı kullanarak iskele genişleme. (A) yapışmalı ve basınç, bir 30 mL plastik santrifüj tüpü gibi dayanabilir bir kapsayıcı kullanın. (B) 2D PCL nanofiber mat 1 cm x 1 cm parçası ekleyin. (C) ~ 1 g kuru buz ekleyin. (D) konteyner mühür. (E) basınç tüp oluşturmak olanak sağlar. Bu katı CO2 sıvı CO2' ye dönecek. Hızlı bir şekilde sıvı topladı tüp ve mühür serbest. Bu hızla 2D nanofiber mat permeating CO2 ' kaynaklanan gaz CO2, olmak sıvı CO2 neden olur. (F) 3D iskele gözlemlemek. İstenilen kalınlık elde kadar aşağıdaki adımları tekrar edilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Öncesi ve sonrası genişleme CO2 süperkritiğe sıvı ile görselleştirme 2B paspaslar. (A) fotoğraf PCL nanofiber paspaslar süperkritiğe CO2 sıvı (sağda) ve (sol) ilk tedaviden sonra tedavi öncesi gösterir. (B) fotoğraf PCL nanofiber mat ilk tedavi ile CO2 süperkritiğe sıvı (sağda) ve sonra (sol) ikinci tedavi öncesi gösterir. (C) önce ve sonra bir ya da iki tedaviler süperkritiğe CO2 sıvı olan PCL elyaf şilteleri kalınlıkları grafiğini gösterir. (D) önce ve sonra süperkritiğe CO2 sıvı olan bir ya da iki tedaviler PCL elyaf şilteleri göreli porozite grafiğini gösterir. (E-H) Görüntü PCL elyaf şilteleri tedavi öncesi SEM (E-F) SEM görüntüsü ile yakalanan PCL paspaslar kesit görünümünü gösterir. (G-H) PCL elyaf şilteleri ile süperkritiğe CO2 sıvı iki tedaviler sonra SEM görüntüsü. Bu rakam Jiang, adapte edilmiş ve ark9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Coumarin 6 boya yüklü PCL nanofiber paspaslar önce ve sonra süperkritiğe CO2 sıvı ve NaBH4 sulu çözüm ile genişleme. (A) görüntüleri fena halde CO2 (sağ) ve NaBH4 (solda) ile genişleme takip PCL iskele kalan Coumarine 6 boya miktarını gösterir. (B) resimleri PCL iskele ve onların karşılık gelen floresans brüt üst sayısı aşağıdaki sıraya göre göster: ham İskele yapısı-İskele (sağ alt), 2B mat yüklü Coumarine 6 boya (sağ üst), PCL iskele yüklü genişletilmiş CO2 () ile Coumarine 6 boya «Ana sayfa» sol), NaBH4 (sol altta). (C) PCL paspaslar tedavi edilmezse, sonra Coumarin 6 boya floresan yoğunluğu süperkritiğe CO2 sıvı ile genişletilmiş ve NaBH4 tedaviler ile genişletilmiş grafik gösterir. Floresan görüntü J yazılım tarafından sayısal. Bu rakam Jiang, adapte edilmiş ve ark9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: PCL iskele içinde kapsüllü biyoaktif molekülleri. (A) grafik 2D membranlarda antimikrobiyal peptid LL-37 göreli sürümü gösteriyor ve süperkritiğe CO2 sıvı Genişletilmiş 3D iskele (B) grafikler tasvir P maruz kaldığında farklı PCL nanofiber paspaslar antimikrobiyal etkinliğini . aeruginosa. Bu rakam Jiang, adapte edilmiş ve ark9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Vivo yanıtları PCL nanofiber iskele ve genişleme yoluyla süperkritiğe CO2 sıçan subkutan patolojisi sitelerdeki olmadan. (A) H & E leke. Yeşil noktalar hücre infiltrasyonu sınırlarını belirleyin. (B) Masson'ın trichrome leke. Yeşil okları kollajen birikimi belirleyin. (C) son derece H & E leke görüntü büyütülmüş. Yeşil okları kan damarları belirleyin. (D) son derece H & E leke görüntülerini büyütülmüş. Yeşil okları dev hücreler belirleyin. (E) kan damarlarının mm2başına büyüme grafik gösterilmektedir. (F) grafik süperkritiğe CO2ile genişletilmiş PCL paspaslar ile karşılaştırıldığında geleneksel 2D PCL paspaslar içine sızmak dev hücre sayısı quantifies. Bu rakam Jiang, adapte edilmiş ve ark9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geleneksel 2D electrospun nanofiber paspaslar Genişletilmiş 3D iskele üzerinden CO2 depressurization araştırıldı dönüştürme. Geleneksel 2D nanofiber paspaslar başarıyla genişletilmiş üzerinden süperkritiğe CO2 sıvı vardır. 2D nanofiber paspaslar en iyi duruma getirilmiş bir koşul altında imal ve paspaslar kenarları bozulmayı olmadan kesmek için kritik adım vardır (Örn., kullanma cerrahi makas keskin). Bu CO2-genişletilmiş nanofiber iskele birçok faydası var katmanlı yapılar (Şekil 3A-B), dahil olmak üzere geleneksel 2D paspaslar üzerinde daha az ambalaj yoğunluğu (şekil 3D-S) ve daha yüksek porozite (3D rakam). Bu genişleme Yöntem işlemek daha hızlı bu da genişleme mevcut yöntemler göre avantajlı olduğunu ve genel kaybı nedeniyle sulu çözümler dışlanması bu teknik kapsüllenmiş aktif biyolojik moleküllerin azaltır ve yordamlar8,9dağılması. Ancak, bu teknik polimer nanofibers morfolojisi/süperkritiğe CO2 sıvı içinde çözünmüş deforme olmamalı kısıtlamasıdır. Örneğin, PLGA (50: 50) nanofiber paspaslar bu tekniği kullanarak genişletilemez. Böyle nanofiber paspaslar diğer gaz sıvılar kullanarak genişletilmiş.
Hücreleri daha düzgün bir şekilde numaralı seribaşı bizim önceki çalışmalar gösterdi genişletilmiş nanofiber iskele içinde ne zaman karşılaştırmak ile 2D8paspaslar. Bu çalışmada, önemli ölçüde artış oranı damar oluşumu (Şekil 6C, E) oluştu ve ana bilgisayar bağışıklık hücre infiltratlar CO2içinde gözlendi-genişletilmiş nanofiber İskele Meydanı dizilmiş delikleri ile takip subkutan implantasyon içinde rats (Şekil 6D, F). Angiogenez ve bağışıklık hücre infiltrasyonu iskele ana bilgisayar doku ile ilgi çekici ve muhtemelen homing hücreler hasarlı doku rejenerasyonu için gerekli olduğunu gösterir; Bu başarı sonrası implantasyon konak9içine daha yüksek oranda anlamına gelir.
CO2-genişletilmiş iskele de peptidler ve istediğiniz yanıtı elde yardımcı olabilir diğer moleküllerin çeşitli dahil olmak için potansiyel var. Burada, istenen etkiyi bir iskele Antimikrobiyal aktivite anonim LL-37 peptid aracılığıyla aynı anda sağlarken doku rejenerasyonu için olmaktır. Süperkritiğe CO2 sıvı ile genişletilmiş iskele de dahil moleküllerin NaBH4ile genişletilmiş iskele ile karşılaştırıldığında daha iyi saklama gösterdi. PCL iskele içinde kapsüllü boya molekülleri daha iyi muhafaza (Şekil 4). Ayrıca, antimikrobiyal peptid LL-37 kapsüllenmiş 3D CO2 was serbest bırakmak biraz daha büyük bir bölümünü 2D paspaslar (Şekil 5A) karşılaştırıldığında iskele genişletti. LL-37 bioactivity 2D iskele (Şekil 5B) karşılaştırıldığında benzer bir antimikrobiyal etkinliğini gösterdi CO2 genişletilmiş iskele olarak muhafaza edildi.
Bu yeni yöntem sentetik iskele üretim ettiğinizi 3D genişleme artık 2D nanofiber Paspas kullanımı sınırlıdır. Sunulan veriler bu genişletme yöntemi daha iyi tutar ve bioactivity genişletilmiş nanofiber iskele içinde kapsüllenmiş biyoaktif malzemelerin muhafaza göstermektedir. Aynı anda, genişletilmiş nanofiber iskele nanotopographic ortamlar in vivo9, büyük doku rejenerasyonu1inducing yardımcı olur bir öznitelik bulunanlardan taklit. Gelecekte, bu CO2-genişletilmiş iskele yara iyileşme ve doku rejenerasyonu de olduğu gibi 3D doku model oluşturma ve yerel olarak denetlenen ilaç dağıtım Yardım'daki potansiyel uygulamalar olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olduğunu ilan eder.
Acknowledgments
Bu eser desteklenmiştir tarafından Ulusal Enstitüsü, genel tıp bilimi (NIGMS) (2 P 20 GM103480-06 ve 1R01GM123081 J.X. için), NIH Nebraska Üniversitesi Tıp Otis Glebe Tıbbi Araştırma Vakfı, Doğu LB606 ve başlangıç fonlarından hibe Merkezi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-199-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Rotating Steel Drum | customized | This serves as a collector during electrospinning. | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Coaxial spinning requires two single syringe pumps. |
| Revolver | Lab Net International | H5600 | Adjustable lab rotator for mixing solutions |
| Hypodermic Needle (27G x 1 1/2") | EXCELINT International Co | 26426 | This is part of the example customized coaxial nozzel shown. |
| Hypodermic Needle (21G x 1 1/2") | EXCELINT International Co | 26416 | This is part of the example customized coaxial nozzel shown. |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | |
| LL 37 ELISA Kit | Hycult Biotech | HK321-02 |
References
- Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
- Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626 (2015).
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
- Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
- Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
- Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
- Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
- Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
- Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
- Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
- Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
- Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).
