Summary
البلدان المتقدمة النمو، ووصف بروتوكول يستند إلى مفهوم الغزل الرطب، لبناء أساس الجيلاتين الحيوية المستخدمة لتطبيق هندسة الأنسجة.
Abstract
تقدم هذه المقالة طريقة غير مكلفة لاختلاق الجيلاتين، بوليمر طبيعي، إلى شعيرات الألياف أو غيرها من الأشكال المناسبة. من خلال أسلوب الغزل الرطب، ألياف الجيلاتين تنتجها البثق السلس في متوسط تخثر مناسب. لزيادة سطح الوظيفية لهذه الألياف الجيلاتين وقدرتها على تقليد سمات الأنسجة، يمكن مصبوب الجيلاتين إلى شكل أنبوب بالإشارة إلى هذا المفهوم. درست بالاختبارات في المختبر والمجراه في، تثبت الأنابيب الجيلاتين بإمكانات كبيرة للتطبيق في هندسة الأنسجة. بوصفها مادة فجوة شغل مناسب، الجيلاتين أنابيب يمكن استخدامها لتحل محل الأنسجة في المنطقة المتضررة (على سبيل المثال، في نظام الجهاز العصبي أو القلب والأوعية الدموية)، فضلا عن تعزيز التجدد بتوفير بديل مباشر للخلايا الجذعية والدوائر العصبية. يوفر هذا البروتوكول إجراء مفصل لإنشاء مادة بيولوجية استناداً إلى بوليمر طبيعي، وتنفيذه ومن المتوقع أن تستفيد إلى حد كبير تطوير البوليمرات الطبيعية المترابطة، التي تساعد على تحقيق استراتيجيات تجديد الأنسجة.
Introduction
أحدث تطور في تجديد الأنسجة تنطوي على تطبيق هندسة الأنسجة، مما يمثل تحديا لتحسين استراتيجيات علاجية جديدة في العلاج الطبي. على سبيل المثال، إمكانات محدودة للتجدد العصبي أو التالي الإصابة أو المرض، يشكل مشكلة صحية كبيرة في جميع أنحاء العالم. نظراً لتعقد العمليات الفيزيولوجية المرضية المرتبطة بالجهاز العصبي، استخدام أوتوجرافت التقليدية أو تنفيذ عملية جراحية الاستقرار قد ثبت أن تقدم فوائد في النتائج الفنية، ولكن لا دليل قوي على آثار تثبيت العمود الفقري جراحة1،2. فقدان الأنسجة في المنطقة المتضررة واستبداله ب astrocytes المستحث هايبرتروفيكالي3، في نهاية المطاف تشكيل ندبة الدبقية كثيفة4،5. هذه المصفوفة يعمل كحاجز أن كتل انتعاش العصب تعمل6،7 وهو، يعوق وبالتالي، إلى حد كبير التجدد. ولذلك، من المتوقع مادة مناسبة ملء فجوة الحيلولة دون فقدان الأنسجة وتقليل تشكيل النسيج الضام ندبة المرتبطة بالحفاظ على سلامة المنطقة المتضررة، فضلا عن توفير بديل مباشر للخلايا العصبية و دارات كهربائية لتعزيز التجديد إكسون.
وكانت المواد البوليمرية الحيوية المفضل السقالات لتجديد الأنسجة والعلاج، استناداً إلى اللائحة من الخلية أو إكسون السلوك والأنسجة التقدم من خلال الدعم المصفوفة خارج الخلية الطبيعية (ECM). ويعتبر شكل الألياف عادة كلبنة لمختلف المواد، نظراً لهيكل أحادي الأبعاد8. يمكن عموما الحصول على الألياف التي تذوب النتوء أو الرطب الغزل الأسلوب؛ ومع ذلك، بحجم كبير وتكلفة المعدات وصعوبة القيام بهذه الأساليب تشكل تحديا. وباﻹضافة إلى ذلك، ركزت غالبية الأعمال المتصلة بالألياف البوليمرية على المواد الاصطناعية أو مركب. البوليميرات الطبيعية كمصدر لمادة بيولوجية توفر أفضل خصائص توافق مع الحياة لجسم الإنسان. ومع ذلك، للحصول على محاذاة ألياف البوليمر الطبيعي نسبيا أكثر صعوبة من المصادر الاصطناعية البوليمر9. ومن ثم تحويل البوليمر الطبيعي كمصدر غنى للبروتين إلى ألياف مادة بيولوجية استراتيجية هامة – ليس فقط ألياف مادة بيولوجية يمكن مباشرة المعزولة من المواد الخام، وبالتالي تجنب تحول غير ضرورية إلى مونومرات، ولكن كما تحتوي ألياف البروتين على مظهر جيد وخصائص مواتية10.
وفي هذا الصدد، نحن تصف أسلوب معالجة غير مكلفة لتصنيع ألياف البوليمرات الطبيعية من خلال المفهوم الأساسي للغزل الرطب، التي يمكن أن تنفذ على نطاق المختبر لهندسة الأنسجة. الغزل الرطب يؤديها البثق والتخثر حل البوليمر في نونسولفينت بوليمر مناسبة. حلاً مناسباً، لزج يخدر في المتوسط تخثر الدم يسبب جزيئات البوليمر حل. من خلال مرحلة الانتقال، خيوط ثم تفقد تلك القابلية للذوبان والتي عجلت في شكل البوليمر الصلب المرحلة11. الإشارة إلى هذا المفهوم، نحن ثم توسيع تطوير الجيلاتين في شكل أنبوب بعملية صب، التي تعتبر مناسبة لطلب تجديد الأنسجة. وباﻹضافة إلى ذلك، جوهريا، يمكننا أيضا وضع أي شكل من المواد من ألياف الجيلاتين (مثل قناة الجيلاتين طوى من عدة ألياف الجيلاتين)، المطلوب لأخرى تطبيقات.
الجيلاتين، بوليمر طبيعية القابلة للتحلل، يتكون من الكولاجين التشويه والتحريف وتحلل، بما في ذلك أي دولة سيميكريستاليني أو غير متبلور أو ثلاثية حلزونية من الكولاجين12. ومن المعروف جيدا أن الكولاجين هو البروتين الهيكلية الأساسية في جميع الأنسجة الضامة من الفقاريات واللافقاريات13،14، ومماثل لهيكل بروتين ECM الرئيسي الذي يدفع نمو الأعصاب، في نفس الوقت، يستبدل كمية كبيرة من جليكوسامينوجليكان ويفرز خلال إصابات النخاع الشوكي. ولذلك، سيكون استخدام الجيلاتين كمصدر خيار كبير لأي من المركبات الطبية. إضافة إلى كونه مصدرا غير مكلفة، الجيلاتين أيضا قابلة للتحلل وسيتوكومباتيبلي وثبت سريرياً لتكون مؤقتة عيب حشو15. وضعت في شكل أنبوب، تبين الاختبارات في المختبر والمجراه في وصف هنا أن الجيلاتين يحتوي على توافق مع الحياة ممتازة وملاءمة للمستقبل الأنسجة التطبيقات الهندسية. مثقف مع الخلايا الجذعية البشرية الدهنية، أنابيب الجيلاتين تحسين تمايز الخلية إلى الخلايا العصبية السلف باستخدام التلوين نيستين إيجابية كعلامة خلية العصبية. وعلاوة على ذلك، الجيلاتين كملء الفجوة المادية، كما أنتجت وبالطريقة المحددة في هذه الدراسة، من المتوقع أن تكون معقولة وآمنة، وتستفيد إلى حد كبير مهندسي الأنسجة الذي تعمل حاليا على وضع الارتباطية البوليميرات الطبيعية لتعزيز النسيج استراتيجيات التجديد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول على الأنسجة الدهنية من جراحات العظام كما معتمدة من قبل المؤسسات استعراض المجلس لثلاثي-خدمة "المستشفى العام"، تايبيه، تايوان، R.O.C. الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان" على الصعيد الوطني المركز الطبي للدفاع، تايوان (R.O.C).
1-الرطب الغزل عملية
-
إعداد الحل
- حل 5 غ مسحوق الجيلاتين في 100 مل الماء المقطر مزدوجة للحصول على تركيز الحل 5% (w/v).
- يحرك الخليط ببطء في 60-70 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتحقيق تشتت متجانسة تماما دون أي فقاعات.
-
الغزل الرطب
- تشكيل الألياف
ملاحظة: ويبين الشكل 1ألفتخطيطي للأسلوب. الإعداد الغزل مجهز بجهاز مضخة تمعجية (انظر الجدول للمواد) التي توفر سرعة عالية الدقة وضوابط التسليم السلس للتدفق.- قم بتوصيل حقنه 26 x 1/2 بوصة (0.45 ملم × 12 ملم) كحل محقن أنابيب الفينيل واضحة.
- تحضير 100 مل حل الأسيتون 99.5% في زجاج الكأس لاستخدامه كحمام تخثر الدم.
- تشغيل الجهاز مضخة تمعجية 21 لفة في الدقيقة (3.25 مل/دقيقة) وترك حل الجيلاتين الوقوف لعدة ثوان في حل الأسيتون قبل المتداول عنه.
- إخراج الألياف الجيلاتين من الحل الأسيتون وتزج بها في 2.5% (w/v) polycaprolactone/الميثان (PCL/DCM) الحل مع 01:20 (w/w).
- واسمحوا الجيلاتين الألياف في الحل PCL/DCM الجافة بين عشية وضحاها، تحت غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة.
- تشكيل أنبوب
ملاحظة: ويبين الشكل 1بتخطيطي للأسلوب.- استخدام قسطرة وريدية طرفية 24 x 3/4 بوصة (0.7 مم × 19 مم) كأنبوب العفن.
- تحميل القسطرة إلى الحل الجيلاتين والاحتفاظ بها هناك 3 s.
- تحميل القسطرة إلى الحل الأسيتون وعقد لمدة 1 دقيقة.
- تحميل القسطرة مرة أخرى في الحل الجيلاتين والاحتفاظ بها هناك 3 s.
- كرر هذا الإجراء البديل x 20.
- إخراج القسطرة من الحل الأسيتون واسمحوا مصبوب أنبوب جاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تأخذ بلطف بها الأنبوب الجيلاتين من القسطرة باستخدام هيموستات ونقل الأنبوب الجيلاتين بعناية في زجاج ماصة باستور مع غمر 2.5% (w/v) PCL/DCM الحل.
- واسمحوا ماصة باستور تحتوي على أنبوب الجيلاتين والحل PCL/DCM الجافة بين عشية وضحاها، تحت غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة.
- تشكيل الألياف
2-مورفولوجيا الأنبوب الجيلاتين
- جبل قطعة أنبوب الجيلاتين المجففة على كعب روتين الكربون.
- وضع العينة في آلة المغطى الرش أيون (انظر الجدول للمواد) ومعطف العينة مع الذهب 60 ثانية؛ ثم، نلاحظ في المورفولوجيا عن طريق فحص المجهر الإلكتروني (انظر الجدول للمواد).
3-الثقافة البشرية الخلايا الجذعية الدهنية
- ضع الأنسجة الدهنية (التي تم الحصول عليها من الأنسجة الدهنية الفموية عن طريق الجراحة السريرية) في طبق بتري يحتوي على 10 مل من محلول نقل تتألف من 0.1 م مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، 1% البنسلين/ستربتوميسين، والسكر 0.1%.
- قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة (أقل من 1 مم2) مع شفرة المبضع.
- نقل الأنسجة إلى أنبوب بلاستيكي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية واحتضان الرواسب في أنبوب بلاستيك التي تحتوي على 10 مل من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم، تتألف من 4 مم L-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1 مم، وأحمر الفينول 15 مغ/لتر) مع كولاجيناز 0.1% في 37 درجة مئوية، في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO2، لمدة يوم واحد.
- الطرد المركزي في الأنبوب من البلاستيك في 500 x ز لمدة 5 دقائق، وتجاهل المادة طافية بعناية (لا تلمس الرواسب)، وثم تعليق الرواسب بلطف بإضافة 10 مل دميم التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والسماح لها الوقوف لمدة يوم واحد في 37 درجة مئوية ، في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO2.
- الطرد المركزي في الأنبوب من البلاستيك في 500 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية بعناية؛ ثم أضف 1 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة (تتألف من keratinocyte خالية من المصل المتوسطة (كاﻹدارة المستدامة للغابات)، 5% FBS، ستربتوميسين ن-أسيتيل-L-سيستين، حمض الأسكوربيك-2-الفوسفات، والامفوتريسين) إلى تعليق الرواسب، وأنه نقل إلى قارورة ثقافة T25 التي تحتوي على 4 مل من المتوسطة الخلية الجذعية، والسماح لها الوقوف لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية، في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO2.
- تجاهل المادة طافية وإضافة 1 مل حمض التربسين-الإيثيلين 0.25% (يدتا)، واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية، في جو هوميديفيد التي تحتوي على الهواء 95% و 5% CO2 ل 3.5 دقيقة، لفصل الخلايا من الجزء السفلي لقارورة الثقافة.
- إضافة 1 مل FBS وتعليق المخلوط، وأنه نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- الطرد المركزي من التعليق في 500 x g 3.5 دقيقة وتعليق الرواسب مع 1 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة، ونقله إلى قارورة الثقافة التي تحتوي على 5 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة؛ ثم يبقيه في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO2.
- الحفاظ على ثقافة فرعية بتغيير الخلايا الجذعية المتوسطة كل 3 أيام.
4-زراعة الخلايا في الأنبوب الجيلاتين
- تعقيم أنبوب الجيلاتين مع الأشعة فوق البنفسجية ح 2؛ ثم تزج أنه في 75% (v/v) الإيثانول وغسله x 2 مع الخلايا الجذعية المتوسطة لإزالة الإيثانول المتبقية.
-
جمع الخلايا الجذعية الدهنية البشرية (هاسكس) من قارورة الثقافة.
- إزالة المتوسطة من قارورة الثقافة.
- أضف 1 مل من 0.25% التربسين-يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO2 ل 3.5 دقيقة، لفصل هاسكس من الجزء السفلي لقارورة الثقافة.
- إضافة 1 مل FBS وتعليق المخلوط، وأنه نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- الطرد المركزي أنبوب ميكروسينتريفوجي في 500 x ز ل 3.5 دقيقة؛ ثم تجاهل المادة طافية بعناية، وتعليق الرواسب مع 1 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة.
- ضع الأنبوب الجيلاتين في صفيحة 6-كذلك يتضمن 3 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة والبذور 4 × 104 من هاسكس إلى الأنبوب؛ احتضان لهم لمدة أسبوعين في 37 درجة مئوية، في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO2.
- قم بتغيير كل 3 أيام المتوسطة الخلايا الجذعية لتوفير تغذية كافية لنمو الخلايا.
5-إيمونوسيتوتشيميستري
- إزالة الخلايا الجذعية المتوسطة ويغسل جيدا مع برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الأنبوب مع الخلايا مع 0.1% حمض الخليك الجليدي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل x 2 جيدا مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة خافض للتوتر السطحي (NP-40، 0.05%) واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل x 3 جيد مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة 2% مصل الماعز العادي واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- صب الحل، إضافة جسم الابتدائي نيستين (علامة خلية السلف العصبية)، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- أغسل x 3 جيد مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة الثانوي جسم حمار مكافحة موس-fluorescein isothiocyanate (فيتك) والاحتفاظ العينة في الظلام ح 2.
- أغسل x 3 جيد مع برنامج تلفزيوني.
- أضف 1 مل هويشت 33342 وصمة عار الأنوية واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل جيدا بلطف والاحتفال به تحت مجهر الأسفار.
6-وفي اختبار توافق مع الحياة فيفو
ملاحظة: الفئران بوزن بين ز 201-225 قد تم اختبارها بنجاح باستخدام هذا البروتوكول.
-
التخدير
- الحث والمحافظة على التخدير؛ تخدير ويفضل الجرذان (الفئران "سبراغ داولي" عمرها 8 الأسبوع، أنثى) عن طريق حقن العضلي تيليتاميني وزولازيبام (25 ملغ/كغ + 25 مغ/كغ، على التوالي) وإكسيلازيني (5 ملغ/كغ). إجراء اختبار تحفيز ألم بالضغط على الأصابع للفئران للتأكد من أنيسثيتيزيشن.
-
التعقيم الجراحي الموقع
- الحلاقة وتنظيف جلد منطقة شبه منحرفة للفئران (على الجزء خلفي الرقبة) والقضاء عليه مع محلول بوفيدون لإعداد الشرط العقيم من الجلد (100 مغ/مل).
- تغطية الفئران مع الستائر الجراحية المعقمة للحد من نقل البكتيريا والتلوث اللاحق لموقع الجراحية.
-
غرس أنبوب الجيلاتين
- قطع الجلد من منطقة في الفئران شبه منحرفة مع مقص جراحي بلطف.
- إنشاء جرح 2 سم ثم ضع الأنبوبة الجيلاتين مباشرة على الطبقة بين اللفافة والعضلات.
-
جراحة بوستيمبلانتيشن
- إغلاق الجرح بخياطة النايلون والقضاء عليها بمحلول بوفيدون (100 مغ/مل).
- حمل الفئران عن طريق حقنه عضليا كيتوبروفين (2.5 مغ/كغ) وسيفازولين (15 مغ/كغ).
- الحفاظ على الفئران تحت ظروف معقمة لمدة 7 أيام.
-
القتل الرحيم
- هو euthanized الفئران عن طريق الخنق2 CO وفقا "المبادئ التوجيهية وبرايتون" للقتل الرحيم. تأكيد وفاة الفئران برشة أخمص القدمين والذيل، متبوعاً بلمس الصدر التأكد من نبضات القلب.
- قص الفئران بلطف مع شفرة المبضع وإزالة الأنسجة مزروع، والتقاط الصور للمراقبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة، قمنا بتطوير بنجاح الجيلاتين في الألياف (الشكل 2أ) وأنابيب (الشكل 2ب، ج) عن طريق مفهوم الغزل الرطب سهل الاستعمال. ويمكن استخدام هذه المواد على أساس الجيلاتين كأي أداة طبية، اعتماداً على الأشكال. إذ ترى أن سطح الوظيفية والإطار لهذه المواد أكثر مناسبة لتجديد الأنسجة، قمنا بفحص توافق مع الحياة أنبوب الجيلاتين بإجراء الاختبارات في المختبر والمجراه.
للحصول على نظرة عامة على أنبوب الجيلاتين، أولاً، أجرينا المورفولوجية الملاحظات باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح الضوئي (الشكل 3). أظهرت النتائج أن سطح الأنبوب الجيلاتين ليس سلس جداً (الشكل 3أ)، قطرها الداخلي أكثر من 200 ميكرومتر (الشكل 3ب)، وهو سمك حوالي 20 ميكرومتر (الشكل 3ج).
ثم أجرى إيمونوسيتوتشيميستري لفحص توافق مع الحياة من الجيلاتين أنبوب في المختبر (الشكل 4). وفي البداية كان المحتضنة مع الخلايا الجذعية البشرية الدهنية لمدة أسبوعين الأنبوب الجيلاتين كانت ملطخة نيستين كعلامة خلية العصبية (الشكل 4أ). تحت المجهر الأسفار، وتلطيخ أظهرت نيستين إيجابية تلطيخ العلامة (اللون الأخضر) جنبا إلى جنب مع حفنة من نويات المكتشفة (اللون الأزرق)، مما يوحي بأن الخلايا يمكن أن تخترق وتنضم أيضا إلى أنبوب الجيلاتين وتفرق في الخلايا العصبية السلف (الشكل 4ب). علاوة على ذلك، أظهرت التجارب المجراة في توافق مع الحياة من الأنبوب الجيلاتين نتائج مماثلة. تم إدراج أنبوب الجيلاتين في طبقة اللفافة في المنطقة شبه منحرفة الفئران لمدة 7 أيام. النتيجة تدل على أن غرس أنبوب الجيلاتين في طبقة اللفافة وأوضحت سلامة وتوافق مع الحياة كبيرة، أظهر أي إشارة إلى احمرار، تورم، أو أخرى أعراض التهاب النسيج المحلي، وكان محاطاً متطورة من الأنسجة الضامة (الشكل 5أ، ب).
الشكل 1 : مخطط الرطب الغزل الإعداد. (أ) ألياف الجيلاتين. (ب) الجيلاتين الأنبوبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الحصول على صور عرض مشرق المواد المستندة إلى الجيلاتين من خلال أسلوب الغزل الرطب. (أ) ألياف الجيلاتين. (ب) الجيلاتين الأنبوبة. (ج) الجيلاتين أنبوب في حل برنامج تلفزيوني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : مورفولوجيا الأنبوب الجيلاتين، لاحظ عن طريق فحص المجهر الإلكتروني. (أ) بعرض سطحية من سطح الأنبوب الجيلاتين (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). (ب) عرض الطائرة تميل (شريط المقياس = 200 ميكرومتر). (ج) عرض عمودي (شريط مقياس = 25 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : مراقبة نمو الخلايا الجذعية البشرية الدهنية (hASC) على أنبوب الجيلاتين. (أ) عرض مشرق صورة الجيلاتين أنبوب--هاسكس. (ب) تحت المجهر الأسفار، تلطيخ أظهرت نيستين إيجابية تلطيخ علامة جنبا إلى جنب مع حفنة من نويات ملطخة بأنبوب الجيلاتين 33342.The هويشت توفير بيئة مثلى هاسكس على الالتزام وتنمو داخل الأنبوب (شريط مقياس = 200 ميكرومتر؛ اللون الأزرق = النوى؛ اللون الأخضر = نيستين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: التجارب المجراة في توافق مع الحياة من الأنبوب الجيلاتين. (أ) غرس أنبوب الجيلاتين في طبقة اللفافة. (ب) مراقبة البيئة المحلية أنسجة مزروع مع أنبوب الجيلاتين (منطقة المستطيل الأحمر) بعد 7 أيام. لوحظ وجود لا احمرار أو تورم أو أعراض التهاب أخرى، والانبوب محاط بالانسجة الضامة متطورة 7 أيام بعد زرع. وهذا يدل على توافق مع الحياة ممتازة الأنبوبة الجيلاتين مع البيئة المحلية الأنسجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قدمنا التنمية المستندة إلى الجيلاتين الحيوية باستخدام رطب بسيطة الغزل التقنية التي يمكن تطبيقها في دراسة البوليمرات الطبيعية لتجديد الأنسجة. هذا العمل أظهر إمكانية تصنيع الجيلاتين كمصدر لبروتين كبيرة دون إضافة مصادر أخرى، بهدف تحسين خصائص الجيلاتين نفسه. تطوير الحيوية على أساس الجيلاتين أجرى تماما في درجة حرارة الغرفة (22-26 درجة مئوية). تحضير حل لطيف خطوة حاسمة في إطار البروتوكول، كما يتم الاحتفاظ بتركيز حل دقيق وآثاره الحل بشكل سلس جداً لتجنب أي فقاعات. ظهور فقاعات في الحل، لا سيما عند تحميلها في المحاقن، سيؤثر على شكل الجيلاتين في الأجلين المتوسط والتخثر.
تم الحصول على الحيوية على أساس الجيلاتين من خلال مرحلة الانتقال من الحل الجيلاتين في متوسط تخثر مناسب الذي يؤدي ديسولفيشن جزيئات البوليمر ورواسب الحل الجيلاتين في مرحلة صلبة بوليمر11. عن طريق استخدام هذا المفهوم الأساسي لأسلوب الغزل الرطب، نحن تستخدم شكل الجيلاتين في شكل أنبوب لزيادة الأداء الوظيفي لسطحه وتحاكي ملامح الأنسجة البشرية من خلال عملية صب. وفي هذه الحالة، مرات كافية لتحميل، عقد، وكرر الخطوات ضرورية لبناء نموذج أنبوب دقيق. في هذا البروتوكول، وتجانس الشكل الأنبوب أثناء العملية لا يمكن التحكم، تفكر في بشكل غير متزامن للمرحلة الانتقالية من الجزء السفلي إلى الجزء حتى من الأنبوب. بالإضافة إلى ذلك، تقتصر أساليب الحفاظ عليها والتعقيم لهذه المواد بسبب محتواه من البروتين.
درست بالاختبارات في المختبر والمجراه في، أظهرت النتائج الحالية أن الأنابيب الجيلاتين تم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول يحمل توافق مع الحياة ممتازة وانطباق محتملة كبيرة في هندسة الأنسجة. وكان القطر الداخلي للأنابيب الجيلاتين التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة أكثر من 200 ميكرومتر (الشكل 3ب)، الذي يسمح للخلايا بالمرور عبر والتقيد بسهولة إلى الأنابيب السطح الداخلي16. وبالإضافة إلى ذلك، توفر سمك وأقل ما يقال أسبيروس سطح الأنبوب قالب مناسب لمرفق الخلية (الشكل 3أ، ج). دأبت، أظهرت نتائج إيمونوسيتوتشيميستري أن الخلايا اخترقت والتمسك الجيلاتين الأنبوب--لا سيما العصبية الخلايا الجذعية، كما لوحظ من خلال تلطيخ إيجابية من الخلايا العصبية مع نيستين ماركر (الشكل 4ب ). كما تم العثور على علامة نيستين في مجال الأقماع النمو خلال مراحل امتداد محور عصبي، تلطيخ إيجابية من نيستين إرشادي ل مخروط النمو17. في نهاية المطاف، يمكن تنفيذ هذا المزيج هاسكس الجيلاتين إيجابية في علاج التجدد العصبي. الحبل الشوكي يتكون من مجموعات من محاور عصبية من الخلايا العصبية وحزم من الألياف العصبية على طول فقرات العمود الفقري. وهكذا، أنبوب الجيلاتين قد لا توفير المواد المناسبة ملء الفجوة بل سيتم أيضا دليل نمو الألياف العصبية وتجديدها من خلال الأنبوب. وعلاوة على ذلك، لاحظت توافق كبير مع الحياة بغرس أنبوب الجيلاتين في اللفافة طبقة لم تثبت أي الضارة وأثر التهاب في الأنسجة المحلية، والانبوب كان محاطاً بالانسجة الضامة متطورة (الرقم 5 أ وب).
وفي الختام، قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة ومفيدة لبناء أساس الجيلاتين الحيوية مع بيئة ممتازة توافق مع الحياة والخلية التي يمكن استخدامها في الأنسجة احتمال هندسة التطبيقات، كما هو الحال في الجهاز العصبي بنجاح تجديد النظام، واستبدال الأوعية الدموية، وتعمير المسالك البولية، وفي إعادة بناء أجزاء الجهاز. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول بالانسجة المهندسين الذين يتم حاليا تطوير الارتباطية البوليميرات الطبيعية دون أي إضافة البوليمر الاصطناعية. يمكن بسهولة توسيع بناء على البروتوكول ويمكن استخدامها لتخصيص تصميم الحيوية المحددة. في المستقبل، هذا البروتوكول يمكن تكييفها لإنتاج الحيوية القائمة على البروتين على نطاق واسع، مما يساعد على تحقيق تجديد الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة بوزارة "الدفاع الوطني" (ماب-105-070؛ ماب-106-077؛ ماب-107-032؛ MAB-107-065)، وزارة العلوم والتكنولوجيا (معظم 107-2320-B016-016)، ثلاثي-خدمة المستشفى العام، الوطني الدفاع عن مركز طبي، تايوان (تسغ-C106-046؛ تسغ-C106-115؛ TSGH-C107-041)، والمستشفى العام تشنغ هسين والتعاون المركز الطبي الدفاع الوطني (CH-ندمك-107-8).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | - |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | - |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | - |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | - |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | - |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | - |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | - |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
References
- Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury. Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725 (2008).
- Fehlings, M. G., Perrin, R. G. The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence. Injury. 36, Suppl 2 13-26 (2005).
- Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. J. Excitotoxic model of post-traumatic syringomyelia in the rat. Spine. 26, 1842-1849 (2001).
- Rolls, A., et al. Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation. PLoS Medicine. 5, 1262-1277 (2008).
- Properzi, F., Asher, R. A., Fawcett, J. W. Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury. Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Research Bulletin. 49, 377-391 (1999).
- Yang, Z., Mo, L., Duan, H., Li, X. Effects of chitosan/collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells. Science China Life Sciences. 53, 215-222 (2010).
- Chawla, K. K. Fibrous Materials. , Cambridge University Press. London, UK. (1998).
- Pickering, K. L., Aruan Efendy, M. G. A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance. Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).
- Lundgren, H. P. Synthetic fibers made from proteins. Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).
- Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. Coagulation mechanism in wet spinning of fibres. Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).
- Yannas, I. V.
- Baer, E., Cassidy, J. J., Hiltner, A. Hierarchical structure of collagen composite Systems: lessons from biology. Pure and Applied Chemistry. 6, 961-973 (2009).
- Harrington, W. F., Von Hippel, P. H. The structure of collagen and gelatin. Advances in Protein Chemistry. 16, 1-138 (1961).
- Veis, A. The Macromolecular Chemistry of Gelatin. , Academic Press. New York, NY. (1994).
- Freyman, T. M., Yannas, I. V., Gibson, L. J. Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering. Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).
- Michalczyk, K., Ziman, M. Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization. Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).
