Summary
Vi utvecklade och beskriva ett protokoll baserat på begreppet våta spinning, för byggandet av gelatin-baserade biomaterial som används för tillämpningen av vävnadsteknik.
Abstract
Denna artikel presenterar en billig metod för att fabricera gelatin, som en naturlig polymer, i monofilament fibrer eller annan lämplig form. Genom den våta spinning metod, tillverkas gelatin fibrer av slät extrudering i en lämplig koagulering medium. För att öka den funktionella ytan av dessa gelatin fibrer och deras förmåga att härma funktionerna i vävnader, kan gelatin formas i en tub form genom att hänvisa till detta begrepp. Granskas av in vitro- och in vivo tester, visar gelatin rören stor potential för tillämpning i vävnadsteknik. Egenskap av lämplig lucka fyllnadsmaterial, gelatin rör kan användas för att ersätta vävnaden i det skadade området (t.ex. i nervös eller kardiovaskulära systemet), samt för att främja regenerering genom att tillhandahålla en direkt ersättning av stamceller och neurala kretsar. Detta protokoll innehåller detaljerade anvisningar för att skapa ett biomaterial baserat på en naturlig polymer, och dess genomförande förväntas till stor nytta för utvecklingen av korrelat naturliga polymerer, som bidra till att förverkliga strategier för regenerering av vävnad.
Introduction
Den senaste utvecklingen i vävnadsregenerering innebär att tillämpningen av vävnadsteknik, som utgör en utmaning för förbättring av nya terapeutiska strategier i medicinska behandlingar. Till exempel utgör begränsad potential av nervsystemet regenerering, följande skada eller sjukdom, ett betydande hälsoproblem över hela världen. På grund av komplexiteten i patofysiologiska processer som är associerade med nervsystemet, användning av traditionella autograft eller genomförandet av stabilisering kirurgi har visat sig erbjuda fördelar i funktionella resultat, men det finns inga starka bevis för effekterna av spinal fixering kirurgi1,2. Vävnaden på det skadade området är förlorat och ersättas med hypertrophically inducerad astrocyter3, så småningom bilda en tät gliaceller ärr4,5. Denna matris fungerar som en barriär att block återvinning av nerv funktion6,7 och är således avsevärt hindrar regenerering. Därför lämpligt gap fyllnadsmaterial förväntas förhindra förlust av vävnad och minska bildningen av ärr-associerade bindväv genom att upprätthålla integriteten i det skadade området, samt genom att ge direkt ersättning av neurala celler och kretsar att främja axon regenerering.
Polymera biomaterial har föredragits som ställningar för vävnad förnyelse terapi, baserat på regleringen av cell eller axon beteende och vävnad progression genom naturliga extracellulär matrix (ECM) stöd. Formatet fiber anses vanligen som en byggsten för olika material, på grund av dess endimensionella struktur8. Fibrerna kan i allmänhet erhållas genom smälta extrudering eller våt spinning metod; men är storleken och kostnaden för utrustningen och det är svårighet att utföra dessa metoder utmanande. Dessutom har majoriteten av det arbete som relaterade till polymer fibrer fokuserat på syntetiska eller komposit material. Naturliga polymerer som en källa av biomaterial erbjuda bättre biokompatibilitet egenskaper för den mänskliga kroppen. Är dock relativt svårare än av syntetisk polymer källor9för att få anpassningen av naturlig polymer fibrer. Omvandling av en naturlig polymer som en rik källa av protein till biomaterial fibrer är därför en viktig strategi — inte bara kan biomaterial fibrerna vara direkt isolerad från råvaran, därmed undvika en onödig omvandling till monomerer, men den protein fibrer har också en bra utseende och goda egenskaper10.
I detta sammanhang beskriver vi en billig bearbetningsmetod för tillverkning av naturlig polymer fibrer genom grundläggande begreppet våta spinning, som kan genomföras på laboratorieskala för vävnadsteknik. Våta spinning utförs av extrudering och koagulering av en polymer lösning till en lämplig polymer nonsolvent. En lämplig, viskös lösning dopade till koagulering medium orsakar polymermolekylerna att upplösa. Genom fas övergången, filament sedan förlora deras löslighet och fälls ut i form av en fast polymer fas11. Hänvisning till detta begrepp, utökade vi sedan utvecklingen av gelatin till formuläret tube av en molding process, som anses lämplig för vävnad förnyelse program. Dessutom intimt, kan vi också utveckla någon form av material från gelatin fibrer (t.ex. gelatin conduit rullas upp från flera gelatin fibrer), för andra önskat program.
Gelatin, en biologiskt nedbrytbar naturlig polymer, bildas från denaturerad och hydrolyserat kollagen, inklusive alla semicrystalline, amorft eller trippel spiralformade tillstånd av kollagen12. Det är väl känt att kollagen är det väsentliga strukturella proteinet i alla bindväv ryggradsdjur och ryggradslösa djur13,14, som liknar proteinstruktur huvudsakliga ECM som inducerar nerv tillväxt och, samtidigt, ersätter en stor mängd glykosaminoglykan utsöndras under ryggmärgsskador. Därför, användningen av gelatin som en källa skulle vara ett utmärkt val för alla medicinska fordon. Förutom att vara en billig källa, gelatin är också biologiskt nedbrytbara och cytocompatible och kliniskt visat sig vara en temporär defekt filler15. Utvecklats till en tub form, Visa in vitro- och in vivo tester som beskrivs här att gelatin har en utmärkt biokompatibilitet och lämplighet för framtida vävnad tekniska tillämpningar. Odlade med mänskliga fett stamceller, gelatin rör förbättra celldifferentiering i neurala stamceller med positiva nestin färgning som neurala cell markör. Dessutom förväntas gelatin som gap fyllnadsmaterial, som produceras av den metod som fastställts i denna studie vara lätthanterligt och säkert och till stor nytta för vävnad ingenjörer som utvecklar för närvarande korrelat naturliga polymerer för förstärkningen av vävnad strategier för förnyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fettvävnader erhölls från ortopediska operationer som har intygats av institutionella i styrelsen av Tri-Service allmänt sjukhus, Taipei, Taiwan, R.O.C. förfaranden som berör animaliska ämnen har godkänts av utskottet djur vård på nationell Försvar Medical Center, Taiwan (R.O.C).
1. blöt Spinning Process
-
Lösning förberedelse
- Lös upp 5 g gelatin pulver i 100 mL dubbeldestillerat vatten att få koncentration av 5% (w/v) lösning.
- Rör blandningen långsamt vid 60-70 ° C över natten för att uppnå en helt homogen dispersion utan eventuella bubblor.
-
Våt spinning
- Fiber bildandet
Obs: En schematisk av metoden visas i figur 1A. Den snurrande setup är utrustad med en peristaltisk pump maskin (se Tabell för material) som ger hög precision hastighet samt kontrollerar smidig leverans av flödet.- Koppla in en 26 G x 1/2 tum (0.45 x 12 mm) spruta som lösning injektorn i tydlig vinyl slangar.
- Förbereda 100 mL 99,5% aceton lösning i en bägare-glas för att användas som koagulering badet.
- Köra den peristaltiska pump maskinen vid 21 rpm (3,25 mL/min) och låt gelatin lösningen stå i flera sekunder i aceton lösning innan rullande det.
- Ta ut gelatin fibrerna från aceton lösningen och doppa dem i 2,5% (w/v) av polykaprolaktonuretangummi/diklormetan (PCL/DCM) lösning med 1:20 (w/w).
- Låt gelatinet fibrer i PCL/DCM lösningen torka över natten, under huven i rumstemperatur.
- Tube bildandet
Obs: En schematisk av metoden visas i figur 1B.- Använda en perifer venkateter av 24 G x 3/4 tum (0.7 x 19 mm) som rör mögel.
- Läsa in katetern i gelatin lösningen och håll den där för 3 s.
- Läsa in katetern i aceton lösningen och håll i 1 min.
- Läsa in katetern igen i gelatin lösningen och håll den där för 3 s.
- Upprepa detta alternativa förfarande 20 x.
- Ta ut katetern från aceton lösningen och låt gjuten röret torka i rumstemperatur i 5 min.
- Försiktigt ta ut gelatin röret från katetern genom att använda en hemostat och noggrant överföra gelatin röret i ett glas Pasteur-pipett med nedsänkning av 2,5% (w/v) av PCL/DCM-lösningen.
- Låt den Pasteur-pipett som innehåller gelatin röret och PCL/DCM lösning torrt över natten, under huven i rumstemperatur.
- Fiber bildandet
2. morfologi av Gelatin röret
- Montera bit av torkad gelatin tube på väsentlig kol.
- Sätt provet i ion fräsande bestrykare maskinen (se Tabell av material) och belägga provet med guld för 60 s; sedan, iaktta dess morfologi av svepelektronmikroskopi (se Tabell för material).
3. kultur av mänskliga fett stamceller
- Placera fettvävnader (erhålls från muntliga fettvävnad av klinisk kirurgi) i en petriskål innehållande 10 mL överföring lösning bestående av 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 1% penicillin/streptomycin och 0,1% glukos.
- Skär vävnader i små bitar (mindre än 1 mm2) med en skalpell blad.
- Överföra vävnader i en 15 mL plaströr och centrifugera vid 500 x g under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och inkubera sedimenten i ett plaströr som innehållande 10 mL Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM, bestående av 4 mM L-glutamin, 1 mM natrium Pyruvat och 15 mg/L fenolrött) med 0,1% kollagenas vid 37 ° C, i en fuktig atmosfär som innehåller 95% luft och 5% CO2, 1 dag.
- Centrifugera plast röret vid 500 x g i 5 min, Kassera supernatanten noggrant (rör inte sedimentet), och sedan avbryta sedimenten försiktigt genom att tillsätta 10 mL DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och låt den stå för 1 dag vid 37 ° C , i fuktig atmosfär som innehåller 95% luft och 5% CO2.
- Centrifugera plast röret vid 500 x g i 5 min och kasta bort supernatanten noggrant; Lägg sedan till 1 mL stamceller medium (bestående av keratinocyter serumfritt medium (K-SFM), 5% av FBS, N-acetyl-L-cystein, askorbinsyra-2-fosfat, streptomycin och amfotericin) att upphäva sediment, överföra den till en T25 kultur mätkolv som innehåller 4 mL Stem cell medium, och låt den stå i 3 dagar vid 37 ° C, i en fuktig atmosfär som innehåller 95% luft och 5% CO2.
- Tag bort supernatanten, tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin-etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och inkubera det vid 37 ° C, i en fuktig atmosfär som innehåller 95% luft och 5% CO2 för 3,5 min, för att lossa cellerna från botten av kultur kolven.
- Tillsätt 1 mL av FBS, upphäva blandningen och överföra den till en mikrocentrifug rör.
- Centrifugera suspensionen vid 500 x g i 3,5 min, upphäva sedimenten med 1 mL av stamceller medium och överföra den till kultur kolven innehållande 5 mL stamceller medium; sedan, hålla den vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 95% luft och 5% CO2.
- Upprätthålla subkulturen genom att ändra stamceller medium varje 3 dagar.
4. odling av celler på Gelatin röret
- Sterilisera gelatin röret med UV-ljus för 2 h; sedan doppa det i 75% (v/v) etanol och tvätta det 2 x med stamceller medium att ta bort återstående etanolen.
-
Samla in de mänskliga fett stamcellerna (hASCs) från kultur kolven.
- Ta bort mediet från kultur kolven.
- Tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 95% luft och 5% CO2 för 3,5 min, ta loss hASCs från botten av kultur kolven.
- Tillsätt 1 mL av FBS, upphäva blandningen och överföra den till en mikrocentrifug rör.
- Centrifugera mikrocentrifug röret vid 500 x g i 3,5 min; sedan Kassera supernatanten noggrant, och avbryta sedimenten med 1 mL av stamceller medium.
- Placera röret gelatin i en 6-well platta innehållande 3 mL av stamceller medium och utsäde 4 x 104 i hASCs till röret; Inkubera dem i 2 veckor vid 37 ° C, i en fuktig atmosfär som innehåller 95% luft och 5% CO2.
- Ändra det stamceller mediet varje 3 dagar för att ge tillräckligt med näring för celltillväxt.
5. immuncytokemi
- Ta bort stamceller medium och tvätta brunnen med PBS.
- Fixera röret med celler med 0,1% ättiksyra koncentrerad i 30 min i rumstemperatur.
- Tvätta väl 2 x med PBS.
- Lägga till ett ytaktivt ämne (NP-40, 0,05%) och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta väl 3 x med PBS.
- Lägg till 2% normala get serum och odla i rumstemperatur i 30 min.
- Dekantera lösningen, Lägg till primär antikropp nestin (neurala stamceller cell markör) och inkubera över natten vid 4 ° C.
- Tvätta väl 3 x med PBS.
- Lägg till sekundära antikroppar åsna anti-mouse-fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) och hålla provet i mörkret för 2 h.
- Tvätta väl 3 x med PBS.
- Tillsätt 1 mL av Hoechst 33342 att fläcken atomkärnor och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta väl försiktigt och observera det i fluorescens Mikroskop.
6. Test in Vivo biokompatibilitet
Obs: Råttor med en vikt mellan 201-225 g har testats framgångsrikt använder detta protokoll.
-
Anestesi
- Inducera och bibehålla anestesi; helst, söva en råtta (8 veckor gamla Sprague Dawley råtta, hona) via en intramuskulär injektion av tiletamin och zolazepam (25 mg / kg + 25 mg / kg, respektive) och xylazin (5 mg/kg). Utföra en smärta stimulering test genom att trycka på råttans fingrar att bekräfta anesthetization.
-
Sterilisering av operationsområdet
- Raka och rengör huden på råttans trapezius område (över baksidan av halsen) och torka med povidonjod lotion att förbereda aseptisk villkora av huden (100 mg/mL).
- Täcka råtta med sterila kirurgiska draperier att minska bakteriell överföring och senare kontamination av operationsområdet.
-
Implantation av gelatin röret
- Försiktigt skära huden på råttans trapezius område med en kirurgisk sax.
- Skapa ett sår av 2 cm och placera gelatin röret direkt på lagret mellan fascian och muskeln.
-
Resorptioner kirurgi
- Nära såret med nylon sutur och torka med povidon-jodlösning (100 mg/mL).
- Inducera råtta via en intramuskulär injektion av ketoprofen (2,5 mg/kg) och cefazolin (15 mg/kg).
- Håll råttan under aseptiska förhållanden i 7 dagar.
-
Dödshjälp
- Rat är euthanized via CO2 kvävning enligt AVMA riktlinjer för dödshjälp. Bekräfta död råtta genom tå och svans nypa, följt av bröstet rörande att säkerställa hjärtslag.
- Skär råtta försiktigt med en skalpell blad, ta bort den implanterade vävnaden och ta bilder för observation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie utvecklade vi framgångsrikt gelatin i fibrerna (figur 2A) och rör (figur 2B, C) genom användarvänlig våt spinning konceptet. Dessa gelatin-baserade material kan utnyttjas som någon medicinsk verktyg, beroende på deras former. Med tanke på att funktionell yta och ram av sådana material är mer lämplig för vävnadsregeneration, undersökte vi biokompatibiliteten av gelatin röret genom att utföra in vitro- och in vivo tester.
För att få en översikt av gelatin röret, först genomförde vi morfologiska iakttagelser med hjälp av scanning electron microscopy (figur 3). Resultaten visade att ytan av gelatin röret inte var mycket slät (figur 3A), dess inre diameter var mer än 200 µm (figur 3B), och dess tjocklek var cirka 20 µm (figur 3C).
Sedan utfördes immuncytokemi för att undersöka biokompatibiliteten av gelatin röret in vitro-(figur 4). Inledningsvis gelatin röret var inkuberas med mänskliga fett stamceller i 2 veckor och var målat med nestin som neurala cell markör (figur 4A). Under fluorescens Mikroskop visade färgningen den positiva nestin färgning markör (grön färg) tillsammans med ett gäng upptäckta kärnor (blå färg), som föreslog att cellerna kan tränga in och följer väl till gelatin röret och differentieras till neurala stamceller (figur 4B). Ytterligare, Invivo biokompatibilitet provning av gelatin röret visade liknande resultat. Gelatin röret infogades i fascia skiktet i en råttas trapezius område i 7 dagar. Resultatet visar att implantation av gelatin röret i fascia skiktet anges dess säkerhet och bra biokompatibilitet, visade inga tecken på rodnad, svullnad, eller andra inflammation symtom av lokala vävnad, och var omgiven av välutvecklade bindväv (figur 5A, B).
Figur 1 : Systemet av den våta spinning setup. (A) Gelatin fibrer. (B) Gelatin tube. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Ljusa Visa bilder av gelatin-baserat material som erhållits genom den våta spinning metod. (A) Gelatin fibrer. (B) Gelatin tube. (C) Gelatin röret i PBS lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Morfologi av gelatin röret, observeras av svepelektronmikroskopi. (A) A ytliga syn på ytan av gelatin röret (skalstapeln = 50 µm). (B) lutande plan Visa (skalstapeln = 200 µm). (C) vertikal Visa (skalstapeln = 25 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Observation av mänskliga fett stamceller (hASC) tillväxt på gelatin tuben. (A) ljusa Visa bild av gelatin tube-hASCs. (B) Under fluorescens Mikroskop, färgningen visade den positiva nestin färgning markör tillsammans med ett gäng atomkärnor färgas med Hoechst 33342.The gelatin tube som en optimal miljö för hASCs att följa och växa inuti röret (skalstapeln = 200 µm; blå färg = atomkärnor; grön färg = nestin). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: In vivo biokompatibilitet provning av gelatin röret. (A) implantation av gelatin röret i fascia skiktet. (B) Observation av lokal vävnadsreaktion miljön implanteras med gelatin röret (röd rektangel område) efter 7 dagar. Ingen rodnad, svullnad eller andra inflammation symtom observerats, och röret omges av välutvecklade bindväv 7 dagar efter implantation. Detta är tecken på en utmärkt biokompatibilitet av gelatin röret med lokal vävnadsreaktion miljön. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterade utvecklingen av gelatin-baserade biomaterial med hjälp av en enkel våt spinning teknik som kan tillämpas i studien av naturliga polymerer för vävnadsregeneration. Detta arbete visade möjligheten att gelatin tillverkning som en bra proteinkälla utan tillsats av andra källor, i syfte att optimera egenskaperna för gelatin själv. Utvecklingen av gelatin-baserade biomaterial genomfördes helt i rumstemperatur (22-26 ° C). En skonsam lösning beredning är ett kritiskt steg i protokollet, som är att upprätthålla en exakt lösning koncentration och omrörning lösningen mycket smidigt för att undvika eventuella bubblor. Utseendet på bubblor i lösningen, kommer att särskilt när den är lastad i sprutan, påverka form av gelatin i koagulering medium.
Gelatin-baserade biomaterial erhölls genom fas övergången av gelatin lösningen i en lämplig koagulering medium som orsakar desolvering av polymermolekylerna och påskyndar gelatin lösningen till en solid polymer fas11. Genom att använda denna grundläggande begreppet den våta spinning metod, utnyttjade vi formen av gelatin till tube form att öka funktionaliteten i dess yta och efterliknar funktionerna i mänskliga vävnader genom gjutprocessen. I det här fallet de lämpliga tiderna till lasta, håll, och upprepa stegen är nödvändigt att bygga upp en exakt tube form. I detta protokoll, homogenitet tube formen under processen inte kan kontrolleras, med tanke på den asynkront av övergångsfasen från botten till den upp delen av röret. Dessutom är bevaras och sterilisering metoder för detta material begränsad på grund av dess proteinhalt.
De aktuella resultaten granskas av in vitro- och in vivo tester, och visat att gelatin rören skapas med detta protokoll uppvisar en utmärkt biokompatibilitet och har bra eventuella tillämpligheten i iscensätta för silkespapper. Den inre diametern av gelatin rören erhölls i denna studie var mer än 200 µm (figur 3B), vilket gör att cellerna att passera och enkelt följa rören inre yta16. Dessutom, ger tjocklek och milt grova ytan av röret en lämplig mall för cell fastsättning (figur 3A, C). Konsekvent, immuncytokemi resultaten visade att celler trängt igenom och följs av gelatin tube-särskilt de neurala stamceller, som observerat genom den positiva färgning av neurala celler med den markör nestin (figur 4B ). Som nestin markör hittades i området av tillväxt kottarna i skede av axon förlängning, är den positiva färgning av nestin vägledande av konen tillväxt17. Slutligen, denna positiva gelatin-hASCs kombination kan genomföras vid behandling av nervsystemet regenerering. Ryggmärgen är består av grupper av neuron axoner och buntar av nervtrådar längs spinal kotorna. Således, gelatin röret kan inte bara ge lämpligt fyllnadsmaterial gap men kommer också guide nerv fiber tillväxt och förnyelse genom röret. Dessutom observeras den fantastiska biokompatibiliteten av implantation av ett gelatin rör i fascian lager inte visat någon skadlig och inflammation effekt på lokala vävnader och röret var omgiven av välutvecklade bindväv (figur 5 A, B).
Sammanfattningsvis, utvecklat vi framgångsrikt ett enkelt och användbart protokoll för byggandet av gelatin-baserade biomaterial med utmärkt biokompatibilitet och cell miljö som kan användas i potentiell kund vävnad tekniska tillämpningar, såsom i nervös systemet regenerering, blodkärl replacement, urinvägarna återuppbyggnad, och i återuppbyggnaden av orgel. Detta protokoll kan genomföras genom vävnad ingenjörer som utvecklar för närvarande korrelat naturliga polymerer utan någon syntetisk polymer tillsats. Protokollet kan enkelt expanderas vid och kan användas för att anpassa utformningen av särskilda biomaterial. I framtiden, kan detta protokoll anpassas att producera protein-baserade biomaterial i stor skala, vilket bidrar till att förverkliga vävnadsregeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av nationella försvarsdepartementet (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; MAB-107-065), ministeriet för vetenskap och teknik (de flesta 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, nationella försvar vårdcentral, Taiwan (TSGH-c‑106-046; TSGH-C‑106-115; TSGH-C107-041), och Cheng-Hsin General Hospital och National Defense Medical Center samarbete (CH-NDMC-107-8).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | - |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | - |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | - |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | - |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | - |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | - |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | - |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
References
- Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury. Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725 (2008).
- Fehlings, M. G., Perrin, R. G. The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence. Injury. 36, Suppl 2 13-26 (2005).
- Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. J. Excitotoxic model of post-traumatic syringomyelia in the rat. Spine. 26, 1842-1849 (2001).
- Rolls, A., et al. Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation. PLoS Medicine. 5, 1262-1277 (2008).
- Properzi, F., Asher, R. A., Fawcett, J. W. Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury. Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Research Bulletin. 49, 377-391 (1999).
- Yang, Z., Mo, L., Duan, H., Li, X. Effects of chitosan/collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells. Science China Life Sciences. 53, 215-222 (2010).
- Chawla, K. K. Fibrous Materials. , Cambridge University Press. London, UK. (1998).
- Pickering, K. L., Aruan Efendy, M. G. A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance. Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).
- Lundgren, H. P. Synthetic fibers made from proteins. Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).
- Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. Coagulation mechanism in wet spinning of fibres. Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).
- Yannas, I. V.
- Baer, E., Cassidy, J. J., Hiltner, A. Hierarchical structure of collagen composite Systems: lessons from biology. Pure and Applied Chemistry. 6, 961-973 (2009).
- Harrington, W. F., Von Hippel, P. H. The structure of collagen and gelatin. Advances in Protein Chemistry. 16, 1-138 (1961).
- Veis, A. The Macromolecular Chemistry of Gelatin. , Academic Press. New York, NY. (1994).
- Freyman, T. M., Yannas, I. V., Gibson, L. J. Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering. Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).
- Michalczyk, K., Ziman, M. Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization. Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).
