Summary
Wij beschrijven een protocol gebaseerd op het concept van de natte spinnen, voor de bouw van gelatine gebaseerde biomaterialen gebruikt voor de toepassing van weefselkweek en ontwikkeld.
Abstract
Dit artikel presenteert een goedkope manier om te fabriceren van gelatine, als een natuurlijke polymeer, in monofilamenten vezels of andere passende vormen. Door middel van de natte methode spinnen, worden gelatine vezels geproduceerd door soepele extrusie in een medium geschikt coagulatie. Het vergroten van het functionele oppervlak van deze gelatine vezels en hun vermogen om na te bootsen de kenmerken van de weefsels, kan de gelatine worden gegoten in de vorm van een buis door te verwijzen naar dit concept. Onderzocht door in vitro en in vivo tests, aantonen de gelatine buizen een groot potentieel voor toepassing in weefselengineering. Fungeert als een geschikte vulling kloof materiaal, gelatine buizen kunnen worden gebruikt ter vervanging van het weefsel in het beschadigde gebied (bijvoorbeeld in het nerveus of cardiovasculaire systeem), alsmede ter bevordering van de regeneratie door middel van een directe vervanging van stamcellen en neurale circuits. Dit protocol biedt een gedetailleerde procedure voor het maken van een biomaterial op basis van een natuurlijke polymeer, en de uitvoering ervan wordt verwacht sterk profiteren van de ontwikkeling van oereenstemming natuurlijke polymeren, die bijdragen tot het realiseren van weefsel regeneratie strategieën.
Introduction
De nieuwste ontwikkeling in weefselregeneratie impliceert de toepassing van weefselkweek, dat een uitdaging voor de verbetering van nieuwe therapeutische strategieën in medische behandelingen vormt. Bijvoorbeeld, vormt de beperkte mogelijkheden van zenuwstelsel regeneratie, volgende letsel of ziekte, een belangrijk gezondheidsprobleem wereldwijd. Als gevolg van de complexiteit van de pathofysiologische processen gekoppeld aan het zenuwstelsel, het gebruik van traditionele autograft of de uitvoering van de stabilisatie chirurgie is aangetoond dat het bieden van voordelen in functionele uitkomsten, maar er is geen sterk bewijs voor de effecten van spinale fixatie chirurgie1,2. Het weefsel op het beschadigde gedeelte is verloren en vervangen door hypertrophically geïnduceerde astrocyten3, uiteindelijk de vorming van een dichte gliale litteken4,5. Deze matrix fungeert als een beveiligingsbarrière dat blokken het herstel van de zenuw functie van6,7 en is dus sterk belemmert regeneratie. Daarom een geschikte vulling kloof materiaal naar verwachting het verlies van weefsel te voorkomen en verminderen van de vorming van bindweefsel litteken-geassocieerde door behoud van de integriteit van het beschadigde gedeelte, alsmede door het verstrekken van de directe vervanging van neurale cellen en circuits ter bevordering van de regeneratie van de axon.
Polymere biomaterialen geweest aangewezen als steigers voor weefsels regeneratie therapie, gebaseerd op de regulering van de cel of het axon gedrag en weefsel progressie via natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) ondersteuning. De indeling van de vezel wordt algemeen beschouwd als een bouwsteen voor verschillende materialen, als gevolg van de eendimensionale structuur8. De vezels kunnen in het algemeen worden verkregen door extrusie smelt of NAT draaiende methode; echter, de grote omvang en de kosten van de uitrusting en de moeilijkheid om het uitvoeren van deze methoden zijn uitdagend. Bovendien heeft de meerderheid van de werkzaamheden in verband met polymeer vezels gericht geweest op synthetische of samengestelde materialen. Natuurlijke polymeren als een bron van biomaterial bieden betere biocompatibiliteit eigenschappen voor het menselijk lichaam. Is echter relatief moeilijker dan synthetisch polymeer bronnen9om te verkrijgen van de uitlijning van de vezels van het natuurlijke polymeren. Vandaar, de omzetting van een natuurlijke polymeer als een rijke bron van eiwit in biomaterial vezels is een belangrijke strategie — niet alleen kunnen de biomaterial vezels worden rechtstreeks geïsoleerd uit de grondstof, dus het vermijden van een niet onnodig transformatie naar monomeren, maar de eiwit vezels hebben ook een goede uiterlijk en gunstige kenmerken10.
We beschrijven in dit verband een goedkope verwerkingsmethode voor de productie van natuurlijke polymeer vezels via het basisconcept van natte spinnen, die kan worden geïmplementeerd op de laboratoriumschaal van het voor weefselengineering. Natte spinnen wordt uitgevoerd door de extrusie en de stolling van de polymeeroplossing van een in een geschikte polymeer nonsolvent. Een passende, viskeuze oplossing doped in coagulatie medium veroorzaakt de polymeermoleculen te ontbinden. Via de faseovergang, de gloeidraden dan verliezen hun oplosbaarheid en zijn neergeslagen in de vorm van een solide polymeer fase11. Verwijzen naar dit concept, breidden we vervolgens de ontwikkeling van gelatine in de vorm van de buis door een molding proces, dat wordt beschouwd als goed voor weefsels regeneratie toepassing. Bovendien, intrinsiek, kunnen we ook ontwikkelen een vorm van materiaal uit gelatine vezels (bijvoorbeeld gelatine conduit opgerolde van verschillende gelatine vezels), voor andere gewenste toepassingen.
Gelatine, een natuurlijke biologisch afbreekbaar polymeer, wordt gevormd door gedenatureerde en gehydrolyseerd collageen, met inbegrip van een semicrystalline, amorf of triple spiraalvormige staat van collageen12. Het is bekend dat collageen is het essentiële structurele eiwit in alle bindweefsels van gewervelde dieren en ongewervelden13,14, die vergelijkbaar is met de structuur van de eiwitten van de belangrijkste ECM dat zenuw groei induceert en, gelijktijdig vervangt een grote hoeveelheid glycosaminoglycaan uitgescheiden tijdens ruggenmerg letsels. Daarom is het gebruik van gelatine als een bron zou een geweldige keuze voor een medische voertuig. Naast een goedkope bron, gelatine is ook biologisch afbreekbaar en cytocompatible en klinisch bewezen als een tijdelijk defect vuller15. Ontwikkeld in de vorm van een buis, in vitro en in vivo tests beschreven hier het tonen aan dat gelatine heeft een uitstekende biocompatibiliteit en geschiktheid voor toekomstige weefsel technische toepassingen. Gekweekte met menselijke obesitas stamcellen, gelatine buizen verbeteren celdifferentiatie in neurale voorlopercellen door positieve nestin kleuring als merkstof neurale cel. Bovendien gelatine als vulling kloof materiaal, geproduceerd door de methode gevestigd in deze studie naar verwachting beheersbaar en veilig zijn en sterk profiteren weefsel ingenieurs die momenteel oereenstemming natuurlijke polymeren voor de verhoging van weefsel ontwikkelen regeneratie strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het vetweefsel zijn verkregen van orthopedische ingrepen zoals gecertificeerd door de institutionele Review Board van Tri-Service General Hospital, Taipei, Taiwan R.O.C. Procedures waarbij dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier op nationaal Defensie Medical Center, Taiwan (R.O.C).
1. nat draaiende proces
-
Bereiding van de oplossing
- Los 5 g gelatine poeder in tweemaal gedestilleerd water tot 5% (m/v) oplossing concentratie aan 100 mL.
- Roer het mengsel langzaam bij 60-70 ° C's nachts tot het bereiken van een volledig homogene dispersie zonder alle bubbels.
-
NAT spinnen
- Productieproces
Opmerking: Een schematische voorstelling van de methode is afgebeeld in Figuur 1A. De spinnen-installatie is uitgerust met een machine voor peristaltische pomp (Zie Tabel van materialen) die zorgt voor hoge-precisie snelheid en regelt de vlotte levering van de stroom.- Aansluiten op een 26 G x 1/2 inch (0,45 mm x 12 mm) spuit als de oplossing injector duidelijk vinyl buis.
- 100 mL van 99,5% aceton-oplossing in een bekerglas van glas moet worden gebruikt als de coagulatie bad voor te bereiden.
- De slangenpomp machine draaien op 21 rpm (3.25 mL/min) en laat de oplossing van de gelatine staan gedurende enkele seconden in aceton oplossing vóór het oprollen.
- Neem uit de vezels van de gelatine van de aceton oplossing en dompel ze in 2,5% (m/v) voor polycaprolactone/dichloormethaan (PCL/DCM) oplossing met 1:20 (w/w).
- Laat de gelatine vezels in de PCL-/ DCM oplossing droog 's nachts, onder de motorkap bij kamertemperatuur.
- Vorming van de buis
Opmerking: Een schematische voorstelling van de methode is afgebeeld in Figuur 1B.- Gebruik een perifere veneuze katheter van 24 G x 3/4 inch (0.7 mm x 19 mm) als buis schimmel.
- De katheter in de gelatine oplossing laden en houd hem er gedurende 3 s.
- De katheter in de aceton oplossing laden en houd voor 1 min.
- De katheter in de gelatine-oplossing opnieuw laden en houd hem er gedurende 3 s.
- Herhaal deze alternatieve procedure 20 x.
- Neem uit de katheter uit de aceton-oplossing en laat de gegoten buis drogen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Neem voorzichtig uit de buis van de gelatine van de katheter met behulp van een hemostat en breng zorgvuldig de gelatine buis in een glazen pipet van Pasteur met de onderdompeling van 2,5% (m/v) van de PCL-/ DCM-oplossing.
- Laat de Pasteur Pipetteer bevat die de gelatine buis en PCL/DCM oplossing droog 's nachts, onder de motorkap bij kamertemperatuur.
- Productieproces
2. de morfologie van de gelatine buis
- Het stuk van gedroogde gelatine buis monteren op een koolstof-stub.
- Het monster in de ion sputter coater machine gebracht (Zie Tabel van materialen) en jas van het monster met goud voor 60 s; dan, het observeren van de morfologie door scanning elektronen microscopie (Zie Tabel van materialen).
3. cultuur van menselijke obesitas stamcellen
- Plaats het vetweefsel (verkregen uit mondelinge adipeus weefsel door klinische chirurgie) in een petrischaal met 10 mL overdracht oplossing bestaande uit 0,1 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 1% penicilline/streptomycine en 0,1% glucose.
- De weefsels in kleine stukjes (minder dan 1 mm2) met een scalpel mes gesneden.
- Breng de weefsels in een plastic tube van 15 mL en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en Incubeer het sediment in een plastic buis waarin 10 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM, bestaande uit 4 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat en 15 mg/L fenol rood) met 0,1% collagenase bij 37 ° C, in een bevochtigde sfeer die bevat 95% lucht en 5% CO2, voor 1 dag.
- Centrifugeer het plastic buis bij 500 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant zorgvuldig (niet aanraken het sediment), en vervolgens, schorten het sediment zachtjes door het toevoegen van 10 mL DMEM met 10% foetale runderserum (FBS) en laat het staan voor 1 dag bij 37 ° C , in een bevochtigde sfeer met 95% lucht en 5% CO2.
- Centrifugeer het plastic buis bij 500 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant zorgvuldig; Voeg vervolgens 1 mL van stamcel medium (bestaande uit Keratinocyt serumvrij medium (K-SFM), 5% van de FBS, N-acetyl-L-cysteïne, ascorbinezuur-2-fosfaat, streptomycine en Amfotericine) aan het sediment op te schorten, breng dit in een maatkolf van T25 cultuur met 4 mL gevolg zijn cel medium, en laat het staan voor 3 dagen bij 37 ° C, in een bevochtigde sfeer met 95% lucht en 5% CO2.
- Verwijder het supernatant, voeg 1 mL 0,25% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), en het incuberen bij 37 ° C, in een bevochtigde sfeer met 95% lucht en 5% CO2 voor 3,5 min, als u wilt loskoppelen van de cellen vanaf de onderkant van de cultuur-kolf.
- Voeg 1 mL FBS, schorten het mengsel en het overbrengen van een microcentrifuge buis.
- Centrifugeer de schorsing bij 500 x g gedurende 3,5 min, schorten het sediment met 1 mL van stamcel medium en het overbrengen van de cultuur-kolf met 5 mL van stamcel medium; vervolgens houd het bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 95% lucht en 5% CO2.
- De subcultuur handhaven door het veranderen van het medium van de cel van de stam om de 3 dagen.
4. teelt van cellen op de gelatine buis
- Steriliseren van de buis van de gelatine met UV-licht voor 2 h; vervolgens het onderdompelen in ethanol 75% (v/v) en wassen het 2 x met stamcel medium te verwijderen van de resterende ethanol.
-
Verzamel de menselijke obesitas stamcellen (hASCs) uit de cultuur-kolf.
- Verwijder het medium van de cultuur-kolf.
- Voeg vervolgens 1 mL van 0,25% trypsine-EDTA en Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 95% lucht en 5% CO2 voor 3,5 min, loskoppelen van de hASCs vanaf de onderkant van de cultuur-kolf.
- Voeg 1 mL FBS, schorten het mengsel en het overbrengen van een microcentrifuge buis.
- Centrifugeer de microcentrifuge buis bij 500 x g gedurende 3,5 min; vervolgens Verwijder het supernatant zorgvuldig en schorten het sediment met 1 mL van stamcel medium.
- Plaats de buis van de gelatine in een 6-well plaat met 3 mL van stamcel medium en zaad 4 x 10,4 van hASCs aan de buis; Incubeer hen gedurende 2 weken bij 37 ° C, in een bevochtigde sfeer met 95% lucht en 5% CO2.
- Het medium van de cel van de stam om de 3 dagen om genoeg voeding voor celgroei wijzigen.
5. immunocytochemie
- Verwijder het medium van de cel van de stam en wassen van de put met PBS.
- Het herstellen van de buis met cellen met 0,1% azijnzuur glaciale gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Het goed 2 x wassen met PBS.
- Toevoegen van een oppervlakteactieve stof (NP-40, 0.05%) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- De goed 3 x wassen met PBS.
- Voeg 2% normale geit serum en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Decanteren in de oplossing toevoegen primair antilichaam nestin (neurale progenitor cel marker) en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
- De goed 3 x wassen met PBS.
- Voeg secundair antilichaam ezel anti-mouse-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en houden van het monster in het donker gedurende 2 uur.
- De goed 3 x wassen met PBS.
- Voeg vervolgens 1 mL van Hoechst 33342 vlek de kernen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen van de put voorzichtig en observeren onder een fluorescentie Microscoop.
6. in Vivo biocompatibiliteit Test
Opmerking: Ratten met een gewicht tussen de 201-225 g hebben met succes getest met behulp van dit protocol.
-
Anesthesie
- Induceren en onderhouden van anesthesie; bij voorkeur een rat (8-week-oude Sprague-Dawley rat, vrouwelijk) via een intramusculaire injectie van tiletamine en zolazepam anesthetize (25 mg / kg + 25 mg / kg, respectievelijk) en xylazine (5 mg/kg). Een pijn stimulatie test uitvoeren door te drukken op de rat vingers te bevestigen de afstomping.
-
Sterilisatie van de chirurgische site
- Scheren en de huid van rat trapezius gebied (over de achterkant van de nek) reinigen en veeg het met Povidon-jodium lotion te bereiden de aseptische conditie van huid (100 mg/mL).
- Dekking van de rat met steriele afdeklakens bacteriële overdracht en besmetting van de chirurgische site achteraf terug te dringen.
-
Implantatie van de gelatine buis
- Snij voorzichtig de huid van rat trapezius gebied met een chirurgische schaar.
- Maak een wond van 2 cm en plaats van de gelatine buis rechtstreeks op de laag tussen de fascia en de spier.
-
Postimplantation chirurgie
- Sluit de wond met nylon hechtdraad en veeg het met Povidon-jodium oplossing (100 mg/mL).
- Het opwekken van de rat via een intramusculaire injectie van ketoprofen (2,5 mg/kg) en cefazolin (15 mg/kg).
- Houd de rat onder aseptische condities voor 7 dagen.
-
Euthanasie
- Rat is euthanized via CO2 verstikking overeenkomstig AVMA richtsnoeren voor euthanasie. Bevestig de dood van rat door teen en staart snuifje, gevolgd door het aanraken van de borst om de hartslag.
- De rat zachtjes met een scalpel mes gesneden, verwijder de geïmplanteerde weefsels en fotograferen voor observatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie ontwikkeld we met succes de gelatine in vezels(Figuur 2)en buizen (Figuur 2B, C) via het gebruiksvriendelijke natte spinnen concept. Deze gelatine gebaseerde materialen kunnen worden gebruikt als een medisch hulpmiddel, afhankelijk van hun vormen. Gezien het feit dat de functionele oppervlak en het frame van een zodanig materiaal meer geschikt voor weefselregeneratie zijn, onderzochten we de biocompatibiliteit van gelatine buis door in vitro en in vivo tests uit te voeren.
Voor het verkrijgen van een overzicht van de gelatine buis, ten eerste, olv we morfologische waarnemingen met behulp van scanning elektronen microscopie (Figuur 3). De resultaten toonden dat het oppervlak van de gelatine buis niet erg glad was (Figuur 3A), de binnendiameter was meer dan 200 µm (Figuur 3B), en de dikte ongeveer 20 µm (Figuur 3C).
Vervolgens werd immunocytochemie uitgevoerd onderzoek naar de biocompatibiliteit van de gelatine buis in vitro (Figuur 4). In eerste instantie de gelatine buis was geïncubeerd met menselijke obesitas stamcellen voor 2 weken en was bevlekt met nestin als een neurale cel marker (Figuur 4A). Onder de fluorescentie Microscoop toonde de kleuring de positieve nestin kleuring marker (groene kleur) samen met een bos van gedetecteerde kernen (blauwe kleur), die suggereerde dat de cellen kunnen doordringen en zich goed aan de gelatine buis en onderscheiden in neurale voorlopercellen (Figuur 4B). Verder bleek de in vivo biocompatibiliteit test van de gelatine buis analoog resultaten. De gelatine buis werd ingevoegd in de laag van de fascia van een rat trapezius gebied voor 7 dagen. Het resultaat toont aan dat de inplanting van de gelatine buis in de fascia laag aangegeven de veiligheid en de grote biocompatibiliteit, toonde geen indicatie van roodheid, zwelling, of andere symptomen van ontsteking van het lokale weefsel, en werd omringd door goed ontwikkelde bindweefsels (Figuur 5A, B).
Figuur 1 : Schema van de natte spinnen setup. (A) gelatine vezels. (B) gelatine tube. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Heldere Bekijk foto's van gelatine gebaseerde materiaal verkregen door middel van de natte methode spinnen. (A) gelatine vezels. (B) gelatine tube. (C) gelatine tube in PBS oplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Morfologie van de gelatine buis, waargenomen door scanning elektronen microscopie. (A) A oppervlakkige mening van het oppervlak van de buis gelatine (schaal bar = 50 µm). (B) hellend vlak weergave (schaal bar = 200 µm). (C) verticale weergave (schaal bar = 25 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Waarneming van menselijke obesitas stamcellen (hASC) groei op de buis gelatine. (A) heldere weergave afbeelding van gelatine buis-hASCs. (B) in het kader van de fluorescentie Microscoop, de kleuring toonde de positieve nestin kleuring marker samen met een heleboel kernen gekleurd met Hoechst 33342.The gelatine buis verstrekt een optimale omgeving voor hASCs te houden en te groeien in de buis (schaal bar = 200 µm; blauwe kleur = kernen; groene kleur = nestin). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: In vivo biocompatibiliteit test van de gelatine buis. (A) de inplanting van de gelatine buis in de laag van de fascia. (B) observatie van het milieu van de lokale weefsel ingeplant met de gelatine buis (rode rechthoek gebied) na 7 dagen. Geen roodheid, zwelling of andere ontsteking symptomen werden waargenomen, en de buis is omgeven door bindweefsel goed ontwikkelde 7 dagen na implantatie. Dit is een indicatie van een uitstekende biocompatibiliteit van de gelatine buis met het lokale weefsel milieu. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van een eenvoudige natte spinnen techniek die kan worden toegepast in de studie van natuurlijke polymeren voor weefselregeneratie presenteerden we de ontwikkeling van gelatine gebaseerde biomaterialen. Dit werk aangetoond de mogelijkheid van gelatine fabricage als een grote eiwitbron zonder de toevoeging van andere bronnen, met als doel het optimaliseren van de eigenschappen van gelatine zelf. De ontwikkeling van gelatine gebaseerde biomaterialen werd volledig uitgevoerd bij kamertemperatuur (22-26 ° C). De voorbereiding van een zachte oplossing is een cruciale stap binnen het protocol, zoals handhaaft een exacte oplossing-concentratie en de oplossing zeer regelmatig roeren om te voorkomen dat alle bubbels. Het uiterlijk van de bubbels in de oplossing, zal vooral wanneer in de spuit, geladen de vorm van gelatine in het medium van de stolling beïnvloeden.
Gelatine gebaseerde biomaterialen werden verkregen door de faseovergang van de oplossing van de gelatine in een geschikte coagulatie medium dat zorgt ervoor dat de desolvation van de polymeermoleculen en precipitaten de gelatine-oplossing in een solide polymeer fase11. Door gebruik te maken van dit basisconcept van de natte methode spinnen, gebruikt we de vorm van de gelatine in tube vorm te verhogen van de functionaliteit van het oppervlak en om na te bootsen de kenmerken van menselijke weefsels via de molding proces. In dit geval de voldoende tijd om te laden, houd, en herhaal de stappen zijn nodig voor de opbouw van een exacte buis-formulier. In dit protocol, de homogeniteit van de vorm van de buis tijdens het proces kan niet worden gecontroleerd, gelet op de asynchroon van de overgangsfase van de bodem naar het omhoog gedeelte van de buis. Bovendien zijn de methoden van het bewaarde en sterilisatie voor dit materiaal beperkt vanwege het eiwitgehalte.
De huidige resultaten onderzocht door in vitro en in vivo tests, en aangetoond dat de buizen van de gelatine gemaakt met dit protocol een uitstekende biocompatibiliteit vertonen en grote mogelijke toepasbaarheid in weefselengineering hebben. De inwendige diameter van de buizen van de gelatine verkregen in deze studie was meer dan 200 µm (Figuur 3B), waardoor de cellen te passeren en gemakkelijk zich te houden aan de buizen innerlijke oppervlakte16. Bovendien, biedt de dikte en mild asperous oppervlak van de buis een goede sjabloon voor bevestiging van de cel (Figuur 3A, C). Consequent, de immunocytochemie resultaten toonden aan dat de cellen doorgedrongen en aan de gelatine buis-met name de neurale vastgehouden stamcellen, zoals waargenomen door de positieve kleuring van de neurale cellen met de markering nestin (Figuur 4B ). De nestin marker was op het gebied van de groei-kegels gevonden tijdens de fasen van axon extensie, is de positieve kleuring van het nestin kenmerkend voor de kegel groei17. Uiteindelijk, de combinatie van deze positieve gelatine-hASCs kan worden geïmplementeerd in de behandeling van zenuwstelsel regeneratie. Het ruggenmerg bestaat uit groepen van neuron axonen en bundels van zenuwvezels langs de wervelkolom wervels. Dus, de gelatine buis kan bieden niet alleen passende vullen gat materiaal maar zal ook gids zenuw fiber groei en regeneratie door de buis. Bovendien, de grote biocompatibiliteit waargenomen door de inplanting van een buis gelatine in de fascia laag heeft niet ieder schadelijke tonen en ontsteking effect op de lokale weefsels, en de buis werd omringd door goed ontwikkelde bindweefsels (Figuur 5 A, B).
Kortom, ontwikkeld we met succes een eenvoudige en nuttige protocol voor de bouw van gelatine gebaseerde biomaterialen met uitstekende biocompatibiliteit en cel omgeving die kan worden gebruikt in vooruitzicht weefsel technische toepassingen, zoals in nerveus systeem regeneratie, bloedvat vervanging, urinewegen wederopbouw, en bij de wederopbouw van orgel delen. Dit protocol kan worden geïmplementeerd door weefsel ingenieurs die momenteel oereenstemming natuurlijke polymeren zonder enige toevoeging van synthetische polymeren ontwikkelen. Het protocol eenvoudig kan worden uitgebreid en kan worden gebruikt voor het aanpassen van het ontwerp van specifieke biomaterialen. In de toekomst kan dit protocol worden aangepast aan het produceren op basis van eiwitten biomaterialen op grote schaal, hetgeen zal bijdragen aan het realiseren van weefselregeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het ministerie van nationale defensie (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; MAB-107-065), het ministerie van wetenschap en technologie (meeste 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, de nationale defensie medisch centrum, Taiwan (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041), en Cheng-Hsin General Hospital en samenwerking van de National Defense Medical Center (CH-NDMC-107-8).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | - |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | - |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | - |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | - |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | - |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | - |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | - |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
References
- Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury. Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725 (2008).
- Fehlings, M. G., Perrin, R. G. The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence. Injury. 36, Suppl 2 13-26 (2005).
- Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. J. Excitotoxic model of post-traumatic syringomyelia in the rat. Spine. 26, 1842-1849 (2001).
- Rolls, A., et al. Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation. PLoS Medicine. 5, 1262-1277 (2008).
- Properzi, F., Asher, R. A., Fawcett, J. W. Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury. Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Research Bulletin. 49, 377-391 (1999).
- Yang, Z., Mo, L., Duan, H., Li, X. Effects of chitosan/collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells. Science China Life Sciences. 53, 215-222 (2010).
- Chawla, K. K. Fibrous Materials. , Cambridge University Press. London, UK. (1998).
- Pickering, K. L., Aruan Efendy, M. G. A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance. Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).
- Lundgren, H. P. Synthetic fibers made from proteins. Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).
- Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. Coagulation mechanism in wet spinning of fibres. Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).
- Yannas, I. V.
- Baer, E., Cassidy, J. J., Hiltner, A. Hierarchical structure of collagen composite Systems: lessons from biology. Pure and Applied Chemistry. 6, 961-973 (2009).
- Harrington, W. F., Von Hippel, P. H. The structure of collagen and gelatin. Advances in Protein Chemistry. 16, 1-138 (1961).
- Veis, A. The Macromolecular Chemistry of Gelatin. , Academic Press. New York, NY. (1994).
- Freyman, T. M., Yannas, I. V., Gibson, L. J. Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering. Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).
- Michalczyk, K., Ziman, M. Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization. Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).
