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Bioengineering

ऊतक उत्थान के लिए जिलेटिन की गीली कताई आधारित मोल्डिंग प्रक्रिया

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/58932
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2,4,5, 2,6, 7, 4, 8
1Department of Materials Science and Engineering, National Taiwan University of Science and Technology, 2Laboratory of Adult Stem Cell and Tissue Regeneration, National Defense Medical Center, 3School of Dentistry, National Yang-Ming University, 4Department and Graduate Institute of Biology and Anatomy, National Defense Medical Center, 5Department of Gerontological Health Care, National Taipei University of Nursing and Health Sciences, 6Division of Rheumatology/Immunology/Allergy, Department of Internal Medicine, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center, 7Department of Physiology and Biophysics, Graduate Institute of Physiology, National Defense Medical Center, 8Division of Urology, Department of Surgery, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center

Summary

हम विकसित और एक गीला कताई अवधारणा पर आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन, जिलेटिन आधारित बायोटेरियल्स के निर्माण के लिए ऊतक इंजीनियरिंग के आवेदन के लिए इस्तेमाल किया.

Abstract

यह लेख एक सस्ती विधि के लिए जिलेटिन बनाना प्रस्तुत करता है, एक प्राकृतिक बहुलक के रूप में, मोनोफिलामेंट फाइबर या अन्य उपयुक्त रूपों में. गीला कताई विधि के माध्यम से, जिलेटिन फाइबर एक उपयुक्त जमाव माध्यम में चिकनी बाहर निकालना द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । इन जिलेटिन फाइबर की कार्यात्मक सतह और ऊतकों की सुविधाओं की नकल करने की उनकी क्षमता को बढ़ाने के लिए, जिलेटिन को इस अवधारणा की चर्चा करते हुए एक ट्यूब के रूप में ढाला जा सकता है । विट्रो में और vivo परीक्षणों में जांच की, जिलेटिन ट्यूबों ऊतक इंजीनियरिंग में आवेदन के लिए एक महान क्षमता का प्रदर्शन । एक उपयुक्त भरने के अंतराल सामग्री के रूप में अभिनय, जिलेटिन ट्यूबों क्षतिग्रस्त क्षेत्र में ऊतक स्थानापन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (जैसे, तंत्रिका या हृदय प्रणाली में), के रूप में अच्छी तरह से स्टेम सेल और तंत्रिका circuitry के एक प्रत्यक्ष प्रतिस्थापन प्रदान करके उत्थान को बढ़ावा देने के लिए. यह प्रोटोकॉल एक प्राकृतिक बहुलक पर आधारित बायोमटेरियल बनाने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है, और इसके कार्यान्वयन के लिए बहुत सहसंबंधी प्राकृतिक पॉलिमर के विकास के लाभ की उम्मीद है, जो ऊतक पुनर्जनन रणनीतियों का एहसास करने में मदद.

Introduction

ऊतक पुनर्जनन में नवीनतम विकास ऊतक इंजीनियरिंग के आवेदन शामिल है, जो चिकित्सा उपचार में नई चिकित्सीय रणनीतियों के सुधार के लिए एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है. उदाहरण के लिए, तंत्रिका तंत्र के उत्थान की सीमित क्षमता, चोट या बीमारी के बाद, दुनिया भर में एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य समस्या बन गई है । तंत्रिका तंत्र के साथ जुड़े पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं की जटिलता के कारण, पारंपरिक ऑटोग्रैफ्ट या स्थिरीकरण सर्जरी के कार्यान्वयन का उपयोग कार्यात्मक परिणामों में लाभ प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन इसके लिए कोई पुख्ता सबूत नहीं है रीढ़ की हड्डी निर्धारण सर्जरी के प्रभाव1,2. क्षतिग्रस्त क्षेत्र में ऊतक खो दिया है और hypertrophically प्रेरित astrocytes3के साथ प्रतिस्थापित, अंततः एक घने glial निशान बनाने4,5. इस मैट्रिक्स एक बाधा के रूप में कार्य करता है कि ब्लॉक तंत्रिका समारोह की वसूली6,7 और है, इस प्रकार, बहुत उत्थान hinders । इसलिए, एक उपयुक्त भरने के अंतराल सामग्री ऊतक के नुकसान को रोकने और क्षतिग्रस्त क्षेत्र की अखंडता को बनाए रखने के द्वारा निशान से जुड़े संयोजी ऊतक के गठन को कम करने की उम्मीद है, साथ ही साथ तंत्रिका कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रतिस्थापन प्रदान करके और circuitry axon उत्थान को बढ़ावा देने के लिए ।

बहुलक बायोमैट्रिक्स ऊतक पुनर्जनन चिकित्सा के लिए मचाने के रूप में पसंद किया गया है, सेल या axon व्यवहार और प्राकृतिक extracellular मैट्रिक्स (ecm) समर्थन के माध्यम से ऊतक प्रगति के विनियमन पर आधारित है । फाइबर प्रारूप आमतौर पर विभिन्न सामग्रियों के लिए एक इमारत ब्लॉक के रूप में माना जाता है, इसकी एक आयामी संरचना8के कारण. फाइबर आम तौर पर पिघल बाहर निकालना या गीला कताई विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, बड़े आकार और उपकरणों की लागत और इन तरीकों को पूरा करने के लिए कठिनाई चुनौतीपूर्ण हैं । इसके अलावा, बहुलक फाइबर से संबंधित काम के बहुमत सिंथेटिक या समग्र सामग्री पर ध्यान केंद्रित किया गया है. बायोमटेरियल के स्रोत के रूप में प्राकृतिक पॉलिमर मानव शरीर के लिए बेहतर जैवसंगतता गुणों की पेशकश करते हैं । बहरहाल, प्राकृतिक बहुलक फाइबर के संरेखण प्राप्त करने के लिए अपेक्षाकृत अधिक मुश्किल सिंथेटिक बहुलक स्रोतों की तुलना में है9. इसलिए, बायोमेटेरियल फाइबर में प्रोटीन का एक समृद्ध स्रोत के रूप में एक प्राकृतिक बहुलक का रूपांतरण एक महत्वपूर्ण रणनीति है-न केवल बायोमेटेरियल फाइबर कच्चे माल से सीधे अलग हो सकता है, इस प्रकार मोनोमर के लिए एक अनावश्यक परिवर्तन से परहेज, लेकिन प्रोटीन फाइबर भी एक अच्छी उपस्थिति और अनुकूल विशेषताओं है10.

इस संबंध में, हम गीला कताई की बुनियादी अवधारणा के माध्यम से प्राकृतिक बहुलक फाइबर के निर्माण के लिए एक सस्ती प्रसंस्करण विधि का वर्णन, कि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए प्रयोगशाला पैमाने पर कार्यान्वित किया जा सकता. गीले कताई एक उपयुक्त बहुलक nonसॉल्वेंट में बाहर निकालना और एक बहुलक समाधान के कोगुलेशन द्वारा किया जाता है. एक उपयुक्त, चिपचिपा समाधान कोगुलेशन माध्यम में मैगनेट बहुलक अणुओं को भंग करने के लिए कारण बनता है । चरण संक्रमण के माध्यम से, तंतु तो उनके घुलनशीलता खो देते है और एक ठोस बहुलक चरण11के रूप में उपजी हैं । इस अवधारणा की चर्चा करते हुए, हम तो एक मोल्डिंग प्रक्रिया है, जो ऊतक पुनर्जनन आवेदन के लिए उचित माना जाता है द्वारा ट्यूब फार्म में जिलेटिन के विकास का विस्तार किया । इसके अलावा, आंतरिक रूप से, हम भी जिलेटिन फाइबर से सामग्री के किसी भी आकार विकसित कर सकते हैं (जैसे, जिलेटिन नाली कई जिलेटिन फाइबर से लुढ़का), अन्य वांछित अनुप्रयोगों के लिए.

जिलेटिन, एक biodegradable प्राकृतिक बहुलक, विकृत और hydrolyzed कोलेजन से गठन किया है, किसी भी semicrystalline, अक्रिस्टलीय, या ट्रिपल कोलेजन की स्थिति12सहित । यह सर्वविदित है कि कोलेजन रीढ़ के सभी संयोजी ऊतकों में आवश्यक संरचनात्मक प्रोटीन है और13,14अकशे्य, जो मुख्य ecm के प्रोटीन संरचना के समान है कि तंत्रिका विकास लाती और, इसके साथ ही, रीढ़ की हड्डी चोटों के दौरान स्रावित glycosaminoglycan की एक बड़ी राशि की जगह. इसलिए, एक स्रोत के रूप में जिलेटिन का उपयोग किसी भी चिकित्सा वाहन के लिए एक बहुत अच्छा विकल्प होगा । एक सस्ता स्रोत होने के अलावा, जिलेटिन भी biodegradable और cytocompatible और चिकित्सकीय एक अस्थाई दोष भराव15साबित हो रहा है । एक ट्यूब के रूप में विकसित, इन विट्रो में और vivo परीक्षण में यहां वर्णित है कि जिलेटिन एक उत्कृष्ट biocompatibility और भविष्य ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्तता है प्रदर्शित करता है । मानव वसा स्टेम कोशिकाओं के साथ संवर्धित, जिलेटिन ट्यूबों एक तंत्रिका कोशिका मार्कर के रूप में सकारात्मक तंत्रिका धुंधला का उपयोग करके तंत्रिका जनक कोशिकाओं में सेल भेदभाव में सुधार. इसके अलावा, अंतराल सामग्री भरने के रूप में जिलेटिन, के रूप में इस अध्ययन में स्थापित विधि द्वारा उत्पादित, के लिए प्रबंधनीय और सुरक्षित होने की उंमीद है और बहुत ऊतक इंजीनियरों जो वर्तमान में ऊतक की वृद्धि के लिए सहसंबंधी प्राकृतिक पॉलिमर विकसित कर रहे है लाभ पुनर्जनन रणनीतियां ।

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Protocol

वसा ऊतकों आर्थोपेडिक सर्जरी से प्राप्त किए गए के रूप में त्रि-सेवा सामान्य अस्पताल, ताइपे, ताइवान, आरओसी प्रक्रियाओं से जुड़े पशु चिकित्सा समीक्षा बोर्ड द्वारा प्रमाणित राष्ट्रीय में पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है रक्षा चिकित्सा केंद्र, ताइवान (आर. ओ. सी.).

1. गीला कताई प्रक्रिया

  1. समाधान तैयारी
    1. 5 ग्राम में जिलेटिन पाउडर की १०० मिलीलीटर डबल-आसुत जल का घोल ५% (w/
    2. किसी भी बुलबुले के बिना एक पूरी तरह से सजातीय फैलाव को प्राप्त करने के लिए रात भर ६०-७० डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को धीरे-से हिलाओ ।
  2. गीला कताई
    1. रेशा गठन
      नोट: विधि का एक योजनाबद्ध चित्र 1aमें दिखाया गया है । कताई सेटअप एक सिकुड़नेवाला पंप मशीन के साथ सुसज्जित है ( सामग्री की तालिकादेखें) है कि उच्च परिशुद्धता गति प्रदान करता है और प्रवाह के चिकनी वितरण नियंत्रण ।
      1. प्लग एक 26 जी एक्स 1/2 इंच (०.४५ मिमी x 12 मिमी) स्पष्ट vinyl टयूबिंग में समाधान सुई लगानेवाला के रूप में सिरिंज ।
      2. एक बीकर कांच में ९९.५% एसीटोन समाधान के १०० मिलीलीटर को कोगुलेशन स्नान के रूप में उपयोग करने के लिए तैयार करें ।
      3. 21 rpm (३.२५ मिलीलीटर/मिनट पर सिकुड़नेवाला पंप मशीन भागो और जिलेटिन समाधान यह रोलिंग से पहले एसीटोन समाधान में कई सेकंड के लिए खड़े हो जाओ ।
      4. एसीटोन समाधान से जिलेटिन फाइबर को बाहर ले जाएं और उन्हें २.५% (w/v) पॉलीकैप्रोलैक्टोन/डाइक्लोरोमेथेन (PCL/DCM) समाधान 1:20 (w/
      5. PCL/DCM समाधान में जिलेटिन फाइबर रात भर सूखने दें, कमरे के तापमान पर हुड के नीचे ।
    2. नलिका निर्माण
      नोट: पद्धति का एक योजनाबद्ध चित्र 1खमें दर्शाया गया है ।
      1. ट्यूब मोल्ड के रूप में 24 जी एक्स 3/4 इंच (०.७ मिमी x 19 मिमी) के एक परिधीय शिरापरक कैथेटर का उपयोग करें ।
      2. जिलेटिन समाधान में कैथेटर लोड और 3 एस के लिए इसे पकड़ो ।
      3. एसीटोन समाधान में कैथेटर लोड और 1 मिनट के लिए पकड़ो ।
      4. कैथेटर को फिर से जिलेटिन समाधान में लोड करें और 3 एस के लिए इसे पकड़ो ।
      5. दोहराएं इस वैकल्पिक प्रक्रिया 20x ।
      6. एसीटोन समाधान से कैथेटर को बाहर ले जाएं और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ढाला ट्यूब सूखने दें ।
      7. धीरे एक hemostat का उपयोग करके कैथेटर से जिलेटिन ट्यूब ले लो और ध्यान से एक गिलास pasteur पिपेट में २.५% के विसर्जन के साथ जिलेटिन ट्यूब हस्तांतरण (w/
      8. चलो pasteur जिलेटिन ट्यूब और PCL/डीसीएम समाधान सूखी रात भर, कमरे के तापमान पर हुड के नीचे युक्त पिपेट ।

2. जिलेटिन ट्यूब की morphology

  1. एक कार्बन डिटेल पर सूखे जिलेटिन ट्यूब का टुकड़ा माउंट ।
  2. आयन स्पुटर कोटर मशीन में नमूना रखो ( सामग्री की तालिकादेखें) और कोट ६० s के लिए सोने के साथ नमूना; फिर, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा अपने आकारिकी निरीक्षण ( सामग्री की तालिकादेखें).

3. मानव की संस्कृति वसा स्टेम कोशिकाओं

  1. वसा ऊतकों (नैदानिक सर्जरी द्वारा मौखिक वसा ऊतक से प्राप्त) एक पेट्री में स्थानांतरण समाधान के 10 मिलीलीटर युक्त डिश में ०.१ मीटर फास्फेट-buffered खारा (pbs), 1% penicillin/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और ०.१% ग्लूकोज ।
  2. ऊतकों को छोटे टुकड़ों में काटें (1 मिमी से कम2) एक स्केलपेल ब्लेड के साथ ।
  3. एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में ऊतकों को स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए ५०० एक्स जी में सेंटिपोज करें ।
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक प्लास्टिक की ट्यूब में तलछट सेते है dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम की 10 मिलीलीटर युक्त (dmem, 4 मिमी एल-glutamine से मिलकर, 1 मिमी सोडियम pyruvate, और 15 मिलीग्राम/एल phenol लाल) के साथ ०.१% कोलेजीनेस में ३७ ° c, एक humidified वातावरण में 1 दिन के लिए ९५% हवा और 5% सह2, युक्त ।
  5. 5 मिनट के लिए ५०० एक्स जी पर प्लास्टिक ट्यूब अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला ध्यान से त्यागें (तलछट स्पर्श नहीं), और फिर, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त dmem के 10 मिलीलीटर जोड़कर तलछट धीरे निलंबित (fbs) और यह ३७ में 1 दिन के लिए खड़े हो जाओ ° c , ९५% हवा और 5% सह2युक्त एक humidified वातावरण में ।
  6. 5 मिनट के लिए ५०० एक्स जी पर प्लास्टिक ट्यूब अपकेंद्रिका और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें; फिर, स्टेम सेल मीडियम के 1 मिलीलीटर (केराटिनोसाइट सीरम-फ्री मीडियम (K-sfm) से मिलकर जोड़ें, 5% एफबीएस, एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन, एस्कॉर्बिक एसिड-2-फॉस्फेट, स्ट्रेप्टोमाइसिन, और एम्फोटेरिसिन) तलछट को निलंबित करने के लिए, इसे T25 संस्कृति फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें 4 मिलीलीटर की स्टेम सेल मध्यम, और यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए खड़े हो जाओ, एक humidified वातावरण में ९५% हवा और 5% सह2युक्त ।
  7. supernatant छोड़ें, 1 मिलीलीटर ०.२५% trypsin-एथिलिनेडिअम्मिनेटेट्रासिटिक एसिड (edta) जोड़ें, और इसे ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, जिसमें एक ह्यूमिफाइड वायुमंडल में ९५% हवा और 5% सह2 के लिए ३.५ मिनट, संस्कृति फ्लास्क के नीचे से कोशिकाओं को अलग करने के लिए ।
  8. एफबीएस की 1 मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण को निलंबित करें, और इसे एक माइक्रोसेंफेरेज ट्यूब पर ट्रांसफ़र करें ।
  9. ३.५ मिनट के लिए ५०० एक्स जी पर निलंबन अपकेंद्रित्र, स्टेम सेल माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ तलछट निलंबित, और यह संस्कृति कुप्पी स्टेम सेल माध्यम के 5 मिलीलीटर युक्त करने के लिए स्थानांतरण; फिर, इसे ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखें जिसमें ९५% हवा और 5% सह2के साथ एक ह्यूमीफाइड वायुमंडल है ।
  10. स्टेम सेल मीडियम को हर 3 दिन में बदलकर उपसंस्कृति बनाए रखें ।

4. जिलेटिन ट्यूब पर कोशिकाओं की खेती

  1. 2 एच के लिए यूवी प्रकाश के साथ जिलेटिन ट्यूब जीवाणुरहित; फिर, यह ७५% (v/v) इथेनॉल में विसर्जित कर दिया और स्टेम सेल माध्यम से यह 2x धोने के लिए अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें ।
  2. संस्कृति फ्लास्क से मानव वसा स्टेम सेल (hascs) लीजिए ।
    1. संस्कृति फ्लास्क से माध्यम निकालें ।
    2. 1 मिलीलीटर ०.२५% ट्रिप्सिन-edta जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिफाइड वायुमंडल में ९५% हवा और ३.५ मिनट के लिए 5% सह2 के लिए, संस्कृति फ्लास्क के नीचे से hascs को अलग करने के लिए ।
    3. एफबीएस की 1 मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण को निलंबित करें, और इसे एक माइक्रोसेंफेरेज ट्यूब पर ट्रांसफ़र करें ।
    4. ३.५ मिनट के लिए ५०० x जी पर microcentrifuge ट्यूब अपकेंद्रिका; फिर, सतह पर तैरनेवाला ध्यान से त्यागें, और स्टेम सेल माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ तलछट निलंबित ।
  3. एक 6-अच्छी तरह से स्टेम सेल मध्यम और बीज के 3 मिलीलीटर युक्त थाली में जिलेटिन ट्यूब प्लेस ट्यूब के लिए hascs के 4 x 104 ; उन्हें ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह के लिए सेते हैं, एक ह्यूमीफाइड वातावरण में ९५% हवा और 5% सह2।
  4. सेल के विकास के लिए पर्याप्त पोषण प्रदान करने के लिए स्टेम सेल मीडियम को हर 3 दिन में बदलें ।

5. इम्यूनोसिटोकैमिस्ट्री

  1. स्टेम सेल माध्यम निकालें और pbs के साथ अच्छी तरह से धो लें ।
  2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ०.१% एसिटिक एसिड हिमनदीय के साथ कोशिकाओं के साथ ट्यूब फिक्स ।
  3. pbs के साथ अच्छी तरह से 2x धो लें ।
  4. एक सर्फैक्टेंट जोड़ें (NP-४०, ०.०५%) और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं ।
  5. pbs के साथ अच्छी तरह से 3x धो लें ।
  6. 2% सामान्य बकरी सीरम जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते ।
  7. समाधान decant, प्राथमिक एंटीबॉडी nestin (तंत्रिका जनक सेल मार्कर) जोड़ने के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते ।
  8. pbs के साथ अच्छी तरह से 3x धो लें ।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी गधा विरोधी माउस-fluorescein आइसोथियोसिनेट (fitc) जोड़ें और 2 एच के लिए अंधेरे में नमूना रखने के लिए ।
  10. pbs के साथ अच्छी तरह से 3x धो लें ।
  11. नापोई दाग और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते करने के लिए hoechst ३३३४२ के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  12. अच्छी तरह से धो लें और इसे एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के नीचे देखें ।

6. Vivo में biocompatibility टेस्ट

नोट: २०१-२२५ जी के बीच एक वजन के साथ चूहों को सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर परीक्षण किया गया है.

  1. संज्ञाहरण
    1. प्रेरित और संज्ञाहरण को बनाए रखने; अधिमानतः, एक चूहा (8 सप्ताह पुराने sprague dawley चूहा, महिला) के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के माध्यम से एनेस्थेटाइज़ और zolazepam (25 मिलीग्राम/किलो + 25 मिलीग्राम/किग्रा, क्रमशः) और xylazine (5 मिलीग्राम/ निश्चेतिकरण की पुष्टि करने के लिए चूहे की उंगलियों को दबाकर एक दर्द उत्तेजना परीक्षण करें ।
  2. सर्जिकल साइट की नसबंदी
    1. दाढ़ी और चूहे की trapezius क्षेत्र की त्वचा को साफ (गर्दन के पीछे) और यह पोविटोन के साथ पोंछ-आयोडीन लोशन त्वचा की सड़न रोकनेवाला हालत तैयार (१०० मिलीग्राम/
    2. बैक्टीरिया के हस्तांतरण और शल्य साइट के बाद के संदूषण को कम करने के लिए बाँझ सर्जिकल पर्दे के साथ चूहे को कवर करें ।
  3. जिलेटिन ट्यूब का प्रत्यारोप
    1. धीरे एक शल्य कैंची के साथ चूहे trapezius क्षेत्र की त्वचा में कटौती ।
    2. 2 सेमी का एक घाव बनाएं और जेलाटीन ट्यूब को सीधे प्रावरणी और मांसपेशी के बीच की परत पर रखें ।
  4. पॉस्टिमबागान सर्जरी
    1. नायलॉन सीवन के साथ घाव को बंद करें और पोविटोन-आयोडीन समाधान (१०० मिलीग्राम/एमएल) के साथ पोंछ दें ।
    2. केटोप्रोफेन के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के माध्यम से चूहा प्रेरित (२.५ मिलीग्राम/किग्रा) और cefazolin (15 मिलीग्राम/किग्रा).
    3. 7 दिनों के लिए सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत चूहा रखो ।
  5. इच्छामृत्यु
    1. चूहा इच्छामृत्यु के लिए अवमा दिशा निर्देशों के अनुसार सह2 asphyxiation के माध्यम से euthanized है । पैर की अंगुली और पूंछ चुटकी द्वारा चूहा की मौत की पुष्टि करें, छाती को छूने के बाद दिल की धड़कन सुनिश्चित करने के लिए ।
    2. एक स्केलपेल ब्लेड से चूहे को धीरे से काटें, प्रत्यारोपित ऊतक निकालें, और अवलोकन के लिए तस्वीरें लें ।

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Representative Results

इस अध्ययन में, हम सफलतापूर्वक फाइबर में जिलेटिन विकसित (चित्रा 2एक) और ट्यूबों (चित्रा 2बी, सी) उपयोगकर्ता के अनुकूल गीला कताई अवधारणा के माध्यम से. इन जिलेटिन आधारित सामग्री किसी भी चिकित्सा उपकरण के रूप में उपयोग किया जा सकता है, उनके आकार के आधार पर. यह देखते हुए कि कार्यात्मक सतह और ऐसी सामग्री के फ्रेम ऊतक पुनर्जनन के लिए अधिक उपयुक्त हैं, हम विट्रो में और vivo परीक्षणों में प्रदर्शन करके जिलेटिन ट्यूब के biocompatibility की जांच की ।

जिलेटिन ट्यूब का एक सिंहावलोकन प्राप्त करने के लिए, पहले, हम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके रूपात्मक टिप्पणियों का आयोजन किया (चित्रा 3). परिणामों से पता चला है कि जिलेटिन ट्यूब की सतह बहुत चिकनी नहीं थी(चित्रा 3ए), अपने भीतरी व्यास से अधिक था २०० μm (चित्रा 3बी), और इसकी मोटाई लगभग था 20 μm (चित्रा 3सी).

फिर, immunocytochemistry विट्रो में जिलेटिन ट्यूब के biocompatibility की जांच करने के लिए किया गया था (चित्रा 4). शुरू में, जिलेटिन ट्यूब 2 सप्ताह के लिए मानव वसा स्टेम कोशिकाओं के साथ incubated और एक तंत्रिका कोशिका मार्कर के रूप में nestin के साथ दाग था (चित्रा 4ए) । प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत, धुंधला पता चला सकारात्मक nestin धुंधला मार्कर (हरा रंग) के साथ एक गुच्छा के साथ पाया गया नानाशी (नीला रंग), जो सुझाव दिया है कि कोशिकाओं घुसना और जिलेटिन ट्यूब के लिए अच्छी तरह से पालन और में अंतर कर सकता है न्यूरल जनक कोशिकाएं (चित्र 4ख) । इसके अलावा, जिलेटिन ट्यूब के विवो biocompatibility परीक्षण में अनुरूप परिणाम दिखाया । जिलेटिन ट्यूब को 7 दिनों के लिए एक चूहे के trapezius क्षेत्र में प्रावरणी परत में डाला गया था । परिणाम दर्शाता है कि प्रावरणी परत में जिलेटिन ट्यूब के प्रत्यारोपण अपनी सुरक्षा और महान biocompatibility संकेत दिया, लाली, सूजन, या स्थानीय ऊतक के अंय सूजन के लक्षणों का कोई संकेत नहीं दिखाया, और से घिरा हुआ था अच्छी तरह से विकसित संयोजी ऊतक (चित्रा 5ए, बी) ।

Figure 1
चित्रा 1 : गीला कताई सेटअप की योजना । (क) जिलेटिन तंतु (ब) जिलेटिन ट्यूब । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : गीला कताई विधि के माध्यम से प्राप्त जिलेटिन आधारित सामग्री के उज्ज्वल दृश्य छवियों । (क) जिलेटिन तंतु (ब) जिलेटिन ट्यूब । (ग) पीबीएस समाधान में जिलेटिन ट्यूब । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : जिलेटिन ट्यूब की आकृति विज्ञान, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा मनाया । (क) जिलेटिन ट्यूब की सतह का सतही दृश्य (स्केल बार = ५० μm) । (इ) आनत समतल दृश्य (स्केल बार = २०० μm) । (ग) ऊर्ध्वाधर दृश्य (स्केल बार = 25 μm) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4 : जेलाटीन ट्यूब पर मानव एडिपोज स्टेम सेल (hasc) विकास का अवलोकन । (क) जिलेटिन ट्यूब के उज्ज्वल दृश्य छवि-hascs । (ख) प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत, धुंधला के साथ सकारात्मक nestin धुंधला मार्कर दिखाया के साथ नाभिका एक गुच्छा के साथ दाग hoechst 33342. जिलेटिन ट्यूब hascs के लिए एक इष्टतम वातावरण प्रदान करने का पालन करें और ट्यूब के अंदर हो जाना (स्केल बार = २०० μm; नीला रंग = नाभिका; हरा रंग = नेस्टिन) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: जेलाटीन ट्यूब के विवो biocompatibility परीक्षण में । (क) प्रावरणी परत में जिलेटिन ट्यूब का रोपण. (ख) 7 दिनों के बाद जिलेटिन ट्यूब (लाल आयत क्षेत्र) के साथ प्रत्यारोपित स्थानीय ऊतक पर्यावरण का प्रेक्षण । कोई लाली, सूजन, या अंय सूजन लक्षण मनाया गया, और ट्यूब अच्छी तरह से विकसित संयोजी ऊतकों से घिरा हुआ है 7 दिन प्रत्यारोपण के बाद । यह स्थानीय ऊतक वातावरण के साथ जिलेटिन ट्यूब के एक उत्कृष्ट biocompatibility का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

हम एक सरल गीला कताई तकनीक है कि ऊतक पुनर्जनन के लिए प्राकृतिक पॉलिमर के अध्ययन में लागू किया जा सकता का उपयोग करके जिलेटिन आधारित biomaterials के विकास प्रस्तुत किया. इस काम के अंय स्रोतों के अलावा बिना एक महान प्रोटीन स्रोत के रूप में जिलेटिन निर्माण की संभावना का प्रदर्शन, उद्देश्य के साथ जिलेटिन ही के गुणों का अनुकूलन करने के लिए । जिलेटिन आधारित बायोटेरियल्स का विकास पूरी तरह से कमरे के तापमान (22-26 डिग्री सेल्सियस) में किया गया था । एक सौंय समाधान तैयारी प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम है, के रूप में एक सटीक समाधान एकाग्रता बनाए रखने और समाधान सरगर्मी बहुत आसानी से किसी भी बुलबुले से बचने के लिए है । समाधान में बुलबुले की उपस्थिति, विशेष रूप से जब सिरिंज में लोड, जमावट माध्यम में जिलेटिन के रूप को प्रभावित करेगा.

जिलेटिन आधारित बायोमटेरियल्स को एक उपयुक्त कोगुलेशन माध्यम में जिलेटिन समाधान के चरण संक्रमण के माध्यम से प्राप्त किया गया था जो बहुलक अणुओं के उजाड़ होने का कारण बनता है और जिलेटिन समाधान को ठोस बहुलक चरण11में शामिल करता है । गीला कताई विधि की इस बुनियादी अवधारणा को रोजगार से, हम ट्यूब फार्म में जिलेटिन के आकार का उपयोग करने के लिए अपनी सतह की कार्यक्षमता बढ़ाने के लिए और मोल्डिंग प्रक्रिया के माध्यम से मानव ऊतकों की सुविधाओं की नकल । इस मामले में, पर्याप्त बार लोड करने के लिए, पकड़, और चरणों को दोहराने के लिए एक सटीक ट्यूब फार्म का निर्माण करने के लिए आवश्यक हैं. इस प्रोटोकॉल में, प्रक्रिया के दौरान ट्यूब आकार की एकरूपता को नियंत्रित नहीं किया जा सकता है, नीचे से ट्यूब के ऊपर के भाग में संक्रमण चरण के एसिंक्रोनस पर विचार । इसके अतिरिक्त, इस सामग्री के लिए संरक्षित और बंध्याकरण तरीकों अपनी प्रोटीन सामग्री की वजह से सीमित हैं ।

विट्रो में और vivo परीक्षणों में द्वारा जांच की, वर्तमान परिणामों का प्रदर्शन किया है कि जिलेटिन इस प्रोटोकॉल के साथ बनाया ट्यूबों एक उत्कृष्ट biocompatibility प्रदर्शन और ऊतक इंजीनियरिंग में महान क्षमता प्रयोज्यता है । इस अध्ययन में प्राप्त जिलेटिन ट्यूबों के भीतरी व्यास से अधिक २०० μm (चित्रा 3बी), जो कोशिकाओं के माध्यम से पारित करने के लिए और आसानी से ट्यूबों ' भीतरी सतह16का पालन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, मोटाई और ट्यूब की हल्का asperous सतह सेल लगाव के लिए एक उचित टेंपलेट प्रदान करता है (चित्रा 3ए, सी) । लगातार, immunocytochemistry परिणामों से पता चला है कि कोशिकाओं में प्रवेश किया और जिलेटिन ट्यूब का पालन-विशेष रूप से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं, के रूप में मार्कर तंत्रिका के साथ तंत्रिका कोशिकाओं के सकारात्मक धुंधला के माध्यम से मनाया (चित्रा 4बी ). के रूप में nestin मार्कर axon विस्तार के चरणों के दौरान विकास शंकु के क्षेत्र में पाया गया था, nestin के सकारात्मक धुंधला शंकु वृद्धि17का संकेत है । अंततः, इस सकारात्मक जिलेटिन-hascs संयोजन तंत्रिका तंत्र उत्थान के उपचार में लागू किया जा सकता है । स्पाइनल कॉर्ड ंयूरॉन axons और रीढ़ की हड्डी कशेरुकाओं के साथ तंत्रिका तंतुओं के बंडलों के समूहों से बना है । इस प्रकार, जिलेटिन ट्यूब न केवल उपयुक्त भरने के अंतर सामग्री प्रदान कर सकते हैं, लेकिन यह भी तंत्रिका फाइबर वृद्धि और पुनर्जनन ट्यूब के माध्यम से मार्गदर्शन करेंगे. इसके अलावा, प्रावरणी परत में एक जिलेटिन ट्यूब के प्रत्यारोपण द्वारा मनाया महान biocompatibility स्थानीय ऊतकों पर किसी भी हानिकारक और सूजन प्रभाव का प्रदर्शन नहीं किया था, और ट्यूब अच्छी तरह से विकसित संयोजी ऊतकों से घिरा हुआ था (चित्रा 5 ए, बी).

अंत में, हम सफलतापूर्वक जिलेटिन के निर्माण के लिए एक सरल और उपयोगी प्रोटोकॉल विकसित-उत्कृष्ट biocompatibility और सेल वातावरण है कि संभावना ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ biomaterials आधारित, ऐसे में तंत्रिका के रूप में प्रणाली पुनर्जनन, रक्त वाहिका प्रतिस्थापन, मूत्र पथ के पुनर्निर्माण, और अंग भागों की पुन: निर्माण में. इस प्रोटोकॉल ऊतक इंजीनियरों जो वर्तमान में किसी भी सिंथेटिक बहुलक इसके अलावा के बिना सहसंबंधी प्राकृतिक पॉलिमर विकसित कर रहे हैं द्वारा कार्यान्वित किया जा सकता. प्रोटोकॉल पर आसानी से विस्तार किया जा सकता है और विशिष्ट बायोटेरियल्स के डिजाइन को अनुकूलित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । भविष्य में, इस प्रोटोकॉल प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-एक बड़े पैमाने पर बायोटेरियल्स आधारित, इस प्रकार ऊतक उत्थान का एहसास करने में मदद.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के राष्ट्रीय रक्षा मंत्रालय द्वारा समर्थित था (mab-105-070; मब-106-077; मब-107-032; mab-107-065), विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (सबसे 107-2320-B016-016), त्रि-सेवा जनरल अस्पताल, राष्ट्रीय रक्षा चिकित्सा केंद्र, ताइवान (tsgh-C106-046; tsgh-C106-115; tsgh-C107-041), और चेंग-hsin जनरल अस्पताल और राष्ट्रीय सुरक्षा चिकित्सा केंद्र सहयोग (CH-ndmc-107-8) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine) Ferak Art. -Nr. 10733 500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump Gilson Model M312 Minipuls*3
Plastic tube connector World Precision Instruments 14011 1 box
Syringe Sterican 5A06258541 26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone Ferak Art. -Nr. 00010 2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500 Perstorp 24980-41-4 -
Dichloromethane  Scharlau CL03421000 1 L vial
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A -
Hemostat Shinetec instruments ST-B021 -
Peripheral venous catheter (Introcan Certo) B. Braun 1B03258241 24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine  Hitachi e1010 -
Scanning electron microscopy Hitachi S-3000N -
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA Gibco 488625 100 mL vial
Fetal bovine serum Gibco 923119 500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium  Gibco 31600-034 Powder
Keratinocyte-SFM medium Gibco 10744-019 500 mL vial
T25 culture flask TPP 90025 VENT type
6-well plate Falcon 1209938 -
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline Gibco 654471 500 mL vial
Acetic acid glacial Ferak Art. -Nr. 00697 500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution) Sigma 056K0151 500 mL vial
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000-20 20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology SC-23927 -
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) Santa Cruz Biotechnology SC-2099 -
Hoechst 33342 Anaspec AS-83218 5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam  Virbac BC91 5 mL vial
Xylazine Bayer korea KR03227 10 mL vial
Ketoprofen Astar 1406232 2 mL vial
Povidone-iodine solution Everstar HA161202 4 L barrel
Cefazolin China Chemical & Pharmaceutical 18P909 1 g vial
Scalpel blade Shinetec instruments ST-B021 -
Surgical scissor Shinetec instruments ST-B021 -

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References

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bioengineering मुद्दा १४५ जिलेटिन फाइबर ट्यूब गीला कताई मोल्डिंग ऊतक इंजीनियरिंग उत्थान बायोमटेरियल
ऊतक उत्थान के लिए जिलेटिन की गीली कताई आधारित मोल्डिंग प्रक्रिया
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Wang, C. Y., Sartika, D., Wang, D.… More

Wang, C. Y., Sartika, D., Wang, D. H., Hong, P. D., Cherng, J. H., Chang, S. J., Liu, C. C., Wang, Y. W., Wu, S. T. Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (145), e58932, doi:10.3791/58932 (2019).

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