Summary
우리가 개발 하 고 젤라틴 기반 생체 조직 공학의 응용 프로그램에 대 한 사용의 건설에 대 한 젖은 회전 개념에 따라 프로토콜을 설명.
Abstract
이 문서는 monofilament 섬유 또는 다른 적절 한 형태의 젤라틴, 천연 폴리머로 조작 하는 저렴 한 메서드를 제공 합니다. 회전 방법 젖은 통해 젤라틴 섬유는 적당 한 응고 매체에 부드럽게 밀어 남에 의해 생산 됩니다. 이 젤라틴 섬유 및 직물의 기능을 모방 하는 능력의 기능 표면 증가, 젤라틴이이 개념을 참조 하 여 튜브 형태로 성형 수 있습니다. 생체 외에서 그리고 vivo에서 테스트 검사, 젤라틴 튜브 조직 공학에서 응용 프로그램에 대 한 좋은 잠재력을 보여 줍니다. 행동으로 적당 한 충전 간격 재, 젤라틴 (예를 들어, 긴장 또는 심장 혈관 시스템에), 손상된 된 영역에 조직을 대체할 뿐 아니라 줄기 세포와 신경 회로의 직접 교체를 제공 하 여 재생을 촉진 하 튜브를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 천연 폴리머에 따라 소재를 만들기 위한 자세한 절차를 제공 합니다 그리고 구현 크게 조직 재생 전략을 실현 하는 데 도움이 상호 천연 고분자의 개발 혜택을 받을 것으로 예상 된다.
Introduction
조직 재생의 최신 개발 조직 공학, 의료 치료에 새로운 치료 전략의 개선에 대 한 도전을 나타내는 응용 프로그램을 포함 한다. 예를 들어 신 경계 재생, 다음 부상 또는 질병의 제한 가능성 전세계 중요 한 건강 문제가 포즈지 않습니다. 신 경계와 관련 pathophysiological 프로세스의 복잡성 때문에 안정화 수술의 구현 또는 전통적인 autograft 사용 표시 되었습니다 기능 결과에 혜택을 제공 하지만 대 한 강력한 증거가 없다 척추 고정 수술1,2의 효과. 손상된 된 영역에서 조직 손실 이며 hypertrophically 유도 이다3, 결국 밀도 glial 흉터4,5형성으로 바뀝니다. 이 매트릭스는 블록 신경의 복구6,7 을 작동 하 고, 따라서, 크게 방해 재생 방 벽으로 작동 합니다. 따라서, 적당 한 충전 간격 재 조직의 손실을 방지 하 고 신경 세포의 직접 교체를 제공 하 여 뿐만 아니라 손상된 된 영역 무결성을 유지 관리 하 여 흉터에 관련 된 결합 조직 형성을 줄일 것으로 예상 되 고 축 삭 재생을 촉진 하는 회로가
고분자 생체 조직 재생 치료, 자연 세포 외 기질 (ECM) 지원을 통해 셀 또는 축 삭 행동과 조직 진행의 규정에 따라 건설 기계로 선호 되었습니다. 섬유 포맷은 다양 한 재료 때문에 그것의 1 차원 구조8대 한 빌딩 블록으로 일반적으로 간주 됩니다. 섬유는 용융 압출 또는 습식 방법; 회전에 의해 일반적으로 얻을 수 있습니다. 그러나, 큰 크기와 비용의 장비와 이러한 방법을 수행 하는 데 어려움은 도전. 또한, 고분자 섬유에 관련 된 일의 대부분은 합성 또는 복합 재료에 집중 되었습니다. 천연 고분자 소재의 원천으로 인간의 신체에 대 한 더 나은 생체 적합성 속성을 제공합니다. 그럼에도 불구 하 고, 자연 고분자 섬유의 맞춤을 상대적으로 더 어렵습니다 보다 합성 폴리머 소스9. 따라서, 소재 섬유에 단백질의 풍부한 원천으로 자연적인 중합체의 변환은 중요 한 전략은-뿐만 아니라 소재 섬유 수 직접 따라서, 단위체에는 불필요 한 변환을 피하 원료에서 분리 하지만 단백질 섬유는 또한 좋은 모양 및 유리한 특성10있다.
이와 관련는 조직 공학에 대 한 실험실 규모에 구현할 수 있는 젖은 회전의 기본 개념을 통해 천연 고분자 섬유의 제조에 대 한 저렴 한 처리 방법에 설명 합니다. 젖은 회전 압출 및 응고 폴리머 솔루션의 적당 한 폴리머 nonsolvent에 의해 수행 됩니다. 응고 중에 첨가 하는 적절 한, 점성 솔루션 폴리머 분자 분해를 하면 됩니다. 위상 전환을 통해는 필 라 멘 트 다음 그들의 용 해도 잃게 되 고 고체 폴리머 단계11의 형태로 침전 된다. 이 개념을 언급 하는, 우리가 다음 확장 튜브 형태로 젤라틴의 개발 성형 프로세스, 조직 재생 응용 프로그램에 대 한 적절 한 간주 됩니다. 또한, 본질적으로, 우리는 또한 개발할 수 있습니다 젤라틴 섬유에서 자료의 어떤 모양 든 지 (예를 들어, 젤라틴 도관 올리고 여러 젤라틴 섬유에서), 다른 응용 프로그램을 원하는.
젤라틴, 생 분해성 천연 폴리머, 변성 및 분해 된 콜라겐, 콜라겐12의 모든 semicrystalline, 비정 질, 또는 3 배 나선형 상태를 포함 하 여에서 형성 된다. 그것은 잘 알려져 그 콜라겐은 척추 동물 및 무척 추 동물13,14, 신경 성장 유도 주요 ECM의 단백질 구조와 비슷한의 모든 결합 조직에 필수적인 구조 단백질, 동시에, glycosaminoglycan 척수 부상 중 분 비의 다량을 대체 합니다. 따라서, 소스로 젤라틴을 사용 하 여 모든 의료 차량에 대 한 좋은 선택 것입니다. 되 고 게다가 저렴 한 소스, 젤라틴은 또한 생 분해성 및 cytocompatible 및 임시 제거 필러15수를 임상적으로 입증 된. , 튜브 형태로 개발 여기 설명 하는 생체 외에서 그리고 vivo에서 테스트 젤라틴은 우수한 생체 적합성 고 미래의 조직 엔지니어링 응용 프로그램에 대 한 적합성을 보여줍니다. 인간 지방 줄기 세포 배양, 젤라틴 튜브 신경 셀 표식으로 긍정적인 nestin 얼룩을 사용 하 여 신경 조상 세포로 세포 분화를 향상. 또한,이 연구에서 설립 하는 방법에 의해 생산 격차 자료 작성으로 젤라틴 관리 하 고 안전 하 고 크게 혜택을 현재 조직의 향상을 위한 상호 천연 고분자를 개발 하는 조직 엔지니어 예정입니다. 재생 전략입니다.
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Protocol
지방 조직으로는 제도적 검토 보드의 세 배 서비스 종합 병원에 의해 인증 정형 외과 수술에서 가져온, 타이 페이, 대만, R.O.C. 절차 동물 주제와 관련 된 국가에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 국방 의료 센터, 대만 (R.O.C)입니다.
1. 젖은 프로세스 회전
-
솔루션 준비
- 5% (w/v) 솔루션 농도를 이중 증 류 물 100 mL에 젤라틴 가루 5g을 분해.
- 어떤 거품 없이 완전히 균질 분산을 달성 하기 위해 하룻밤 60-70 ° C에서 천천히 혼합물을 저 어.
-
젖은 회전
- 섬유 형성
참고: 방법의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 회전 설정 연동 펌프 기계를 갖춘 하 높은-정밀 속도 제공 하 고 제어 흐름의 매끄러운 납품 ( 재료의 표참조).- 명확한 비닐 튜브에 솔루션 인젝터로 26 G x 1/2 인치 (0.45 m m x 12 m m) 주사기를 연결 합니다.
- 100 mL 비 커 유리 응고 목욕으로 사용할 99.5% 아세톤 솔루션의 준비.
- 연동 펌프 기계 21 rpm (3.25 mL/min)에서 실행 하 고 젤라틴 솔루션 배포 하기 전에 아세톤 솔루션에 몇 초 동안 서 보자.
- 아세톤 솔루션에서 젤라틴 섬유 밖으로가 고 1:20 (w/w) polycaprolactone/dichloromethane (PCL/DCM) 솔루션의 2.5% (w/v)에 그들을 담가.
- 섬유 건조 PCL/DCM 솔루션에 하룻밤 실 온에서 후드 젤라틴을 하자.
- 관 형성
참고: 방법의 회로도 그림 1B에 표시 됩니다.- 24 G x 3/4 인치 (0.7 m m x 19 m m)의 말 초 정 맥 카 테 터를 사용 하 여 관 형으로.
- 젤라틴 솔루션에 테 로드 누르고 거기 3에 대 한 s.
- 아세톤 솔루션으로 카 테 터를 로드 하 고 1 분 동안.
- 젤라틴 솔루션으로 카 테 터를 다시 로드 하는 방법 그것을 잡고 거기 3에 대 한 s.
- 이 대체 프로시저 20 x를 반복 합니다.
- 아세톤 솔루션에서 카 테 터를 꺼내와 성형된 튜브 5 분 동안 실내 온도에 건조 하 게.
- 부드럽게는 hemostat를 사용 하 여 카 테 터에서 젤라틴 튜브를 꺼내와 신중 하 게 한잔에 2.5% (w/v)의 침수와 파스퇴르 피펫으로 PCL/DCM 솔루션 젤라틴 튜브를 전송.
- 파스퇴르 피 펫 포함 젤라틴 튜브 및 PCL/DCM 솔루션 건조 하룻밤 실 온에서 후드를 하자.
- 섬유 형성
2입니다. 젤라틴 튜브의 형태
- 탄소 스텁에 말린된 젤라틴 튜브의 조각을 탑재 합니다.
- 이온 스퍼터 coater 기계에 샘플을 넣어 ( 재료의 표참조)와 60에 대 한 골드 샘플 코트 s; 다음, 전자 현미경 검사 법을 검사 하 여 그 형태를 관찰 ( 재료의 표참조).
3입니다. 인간 지방 줄기 세포의 문화
- 지방 조직 (임상 수술에 의해 구두 지방 조직에서 얻은) 10 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 1% 페니실린/스, 및 0.1% 포도 당으로 구성 된 전송 솔루션을 포함 하는 배양 접시에 놓습니다.
- 메스 칼 날 작은 조각 (1 m m2미만)으로 조직을 잘라.
- 15 mL 플라스틱 튜브를 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기로 조직을 전송 합니다.
- 제거는 상쾌한 고 37 ° c, 습도 분위기에서 0.1% 콜라와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (4 m L-글루타민 m, 1 mM 나트륨 pyruvate, 및 15 mg/L 페 놀 레드의 구성 된 DMEM) 10 mL를 포함 하는 플라스틱 튜브에 앙금을 품 어 1 일에 대 한 95% 공기와 5% CO2를 포함 하는.
- 5 분 동안 500 x g 에 플라스틱 튜브를 원심, 신중 하 게는 상쾌한 삭제 (만지지 마십시오는 앙금), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함 된 DMEM의 10 mL를 추가 하 여 퇴적 물을 부드럽게 중단 하 고 그것은 37 ° C에서 1 일 서 보자 95% 공기와 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서.
- 5 분 동안 500 x g 에 플라스틱 튜브를 원심 및 삭제는 상쾌한 신중 하 게; 다음, 4 mL를 포함 하는 T25 문화 플라스 크에 줄기 세포 매체 (keratinocyte 혈 청 무료 매체 (K-SFM), 5 %FBS, N-아 세 틸-L-시스테인, ascorbic 산-2-인산 염, 스 고 암포의의 구성 된)는 앙금을 중단, 전송의 1 mL를 추가 줄기 세포 매체, 그리고 그것은 포함 된 95% 공기와 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 3 일 동안 서 보자.
- 삭제는 상쾌한 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL을 추가 하 고 문화 술병의 바닥에서 세포를 분리 하려면 95% 공기와 5% CO2 3.5 분,를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 품 어.
- FBS의 1 mL을 추가 하 고 혼합물, 중단 microcentrifuge 관에 그것을 전송.
- 500 x g 3.5 분에서 현 탁 액을 원심, 줄기 세포 매체의 1 mL와 앙금을 일시 중단 하 고 줄기 세포 매체;의 5 mL를 포함 하는 문화 플라스 크에 전송 그런 다음 포함 된 95% 공기와 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 그것을 유지.
- 3 일 마다 줄기 세포 매체를 변경 하 여 subculture를 유지 합니다.
4. 젤라틴 튜브에 세포의 경작
- 2 h;에 대 한 자외선과 젤라틴 관 소독 그런 다음, 75% (v/v) 에탄올에 몰두 하 고 그것을 씻어 잔여 에탄올을 제거 하려면 줄기 세포 매체와 2 배.
-
인간 지방 줄기 세포 (hASCs) 문화 플라스 크에서 수집 합니다.
- 문화 플라스 크에서 매체를 제거 합니다.
- 0.25 %trypsin-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c 95% 공기와 5% CO2 3.5 분, hASCs 문화 술병의 바닥에서 분리를 포함 하는 습도 분위기에서 품 어.
- FBS의 1 mL을 추가 하 고 혼합물, 중단 microcentrifuge 관에 그것을 전송.
- 500 x g 3.5 분;에서 microcentrifuge 관을 원심 그리고는 상쾌한을 신중 하 게, 삭제 줄기 세포 매체의 1 mL와 앙금을 일시 중단 합니다.
- 줄기 세포 매체의 3 mL를 포함 하는 6-잘 접시에서 젤라틴 튜브를 놓고 4 x 104 ; 튜브에 hASCs의 씨앗 포함 된 95% 공기와 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 2 주 동안 그들을 품 어.
- 변경 줄기 세포 매체 3 일 마다 세포 성장에 대 한 충분 한 영양을 제공 합니다.
5입니다. Immunocytochemistry
- 줄기 세포 매체를 제거 하 고 PBS 가진 잘 씻어.
- 0.1% 아세트산 빙하 실 온에서 30 분으로 셀과 튜브를 수정 합니다.
- PBS로 세척 잘 2 배입니다.
- 계면 활성 제 (NP-40, 0.05%)를 추가 그리고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
- PBS로 세척 잘 3 배입니다.
- 2% 정상 염소 혈 청을 추가 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 솔루션을 가만히 따르다, 1 차적인 항 체 nestin (신경 조상 세포 마커), 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
- PBS로 세척 잘 3 배입니다.
- 이차 항 체 당나귀 안티 mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)를 추가 하 고 샘플 2 h에 대 한 어둠 속에서 계속.
- PBS로 세척 잘 3 배입니다.
- Hoechst 33342 핵 얼룩 및 실 온에서 10 분 동안 품 어의 1 mL를 추가 합니다.
- 잘 씻어 부드럽게 형광 현미경으로 관찰 하 고.
6. Vivo 생체 적합성 테스트에서
참고: 201-225 g 사이의 무게로 쥐 성공적으로 테스트 되었습니다이 프로토콜을 사용 하 여.
-
마 취
- 유도 하 고 유지 하는 마 취; 가급적 이면, anesthetize는 쥐 (8 주 된 Sprague Dawley 쥐, 여성)를 통해 tiletamine와 zolazepam의 근육 내 주사 (25 mg/kg + 25 mg/kg, 각각) 및 xylazine (5 mg/kg). 통증 자극 테스트를 수행 하는 anesthetization를 확인 하는 쥐의 손가락을 눌러.
-
수술 사이트의 살 균
- 면도 및 (이상 목 뒤쪽) 쥐의 trapezius 영역의 피부를 깨끗 하 고 피부 (100mg/mL)의 무 균 상태를 준비 povidone-요오드 로션으로 닦아.
- 세균성 전송 및 외과 사이트의 후속 오염 줄이기 위해 불 임 수술 커튼으로 쥐를 커버.
-
젤라틴 튜브의 주입
- 부드럽게 수술가 위를 쥐의 trapezius 영역의 피부를 잘라.
- 2cm의 상처를 만들고 근 막 및 근육 사이의 레이어에 직접 젤라틴 튜브를 배치 합니다.
-
Postimplantation 수술
- 나일론 봉합 된 상처를 닫고 povidone-요오드 솔루션 (100 mg/mL)와 그것을 닦아.
- Ketoprofen (2.5 mg/kg) 및 cefazolin (15 mg/kg)의 근육 주사를 통해 쥐를 유도.
- 7 일 동안 무 균 조건 하에서 쥐를 유지.
-
안락사
- 쥐는 안락사에 AVMA 지침에 따라 CO2 질 통해 안락사 이다. 발가락과 꼬리 핀치, 뒤에 하트 비트를 위해 가슴을 만져 여 쥐의 죽음을 확인 합니다.
- 부드럽게 메스 칼 날 쥐를 잘라, 이식된 조직, 제거 하 고 관찰에 대 한 사진을 찍어.
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Representative Results
이 연구에서 우리는 성공적으로 섬유 (그림 2A)에 젤라틴과 사용자 친화적인 젖은 회전 개념을 통해 튜브 (그림 2B, C)을 개발. 이 젤라틴 기반 물자는 그들의 모양에 따라 어떤 의료 도구로 활용할 수 있습니다. 우리 생체 외에서 그리고 vivo에서 테스트를 수행 하 여 젤라틴 튜브의 생체 적합성 시험 기능 표면과 같은 소재의 프레임은 조직 재생을 위해 더 적당 한 고려 하 고.
젤라틴 튜브에 대 한 개요를 얻으려면, 먼저, 우리가 실시 형태학 관찰 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (그림 3)를 사용 하 여. 결과 젤라틴 튜브의 표면이 매우 부드러운 없음을 보여주었다 (그림 3A), 그것의 내부 직경은 이상의 200 µ m (그림 3B), 그리고 두께 약 20 µ m (그림 3C).
다음, immunocytochemistry 젤라틴 튜브 생체 외에서 (그림 4)의 생체 적합성 검사를 수행 했습니다. 처음에, 젤라틴 튜브 인간 지방 줄기 세포와 함께 알을 품는 2 주 동안 하 고(그림 4)신경 세포 마커로 nestin 물 했다. 형광 현미경 얼룩 마커 (그린 색상) 검색 된 핵 (파란색)는 건의 했다 셀 수 침투 및 젤라틴 튜브에 잘 고착으로 차별화의 무리와 함께 긍정적인 nestin 보였다는 얼룩 신경 조상 세포 (그림 4B). 또한, 젤라틴 튜브의 vivo에서 생체 적합성 테스트는 유사한 결과 보였다. 젤라틴 튜브는 7 일 쥐의 trapezius 영역에서 근 막 층에 삽입 되었다. 근 막 층으로 젤라틴 튜브의 주입의 안전과 좋은 생체 적합성, 지방 조직, 빨갛게, 붓기, 또는 다른 염증 증상의 징후를 보였다 표시 그리고에 의해 포위 되었다 결과 보여 줍니다. 잘 발달 된 결합 조직 (그림 5A, B).
그림 1 : 젖은 설치 회전의 계획. (A) 젤라틴 섬유. (B) 젤라틴 튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 젤라틴 기반 소재의 밝은 보기 이미지 회전 방법 젖은 통해 얻은. (A) 젤라틴 섬유. (B) 젤라틴 튜브. (C) 젤라틴 PBS 솔루션에 관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 스캐닝 전자 현미경으로 관찰 하는 젤라틴 튜브의 형태. 젤라틴 튜브의 표면 (A) A 표면 보기 (눈금 막대 = 50 µ m). (B) 경사진 평면 뷰 (눈금 막대 = 200 µ m). (C) 세로 보기 (눈금 막대 = 25 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 젤라틴 튜브에 인간 지방 줄기 세포 (hASC) 성장의 관찰. (A) 젤라틴 튜브-hASCs의 밝은 보기 이미지. (B) 형광 현미경 보였다 Hoechst 33342.The 젤라틴 튜브로 얼룩진 긍정적인 nestin 핵의 무리와 함께 마커 얼룩 얼룩 준수 관 (눈금 막대 안쪽에 성장 하는 hASCs에 대 한 최적의 환경을 제공 = 200 µ m; 블루 색상 = 핵; 그린 색상 nestin =). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 젤라틴 튜브의 vivo에서 생체 적합성 테스트. (A) 근 막 층으로 젤라틴 튜브의 주입. (B) 젤라틴 튜브 (빨간 사각형 영역)와 7 일 후 이식 로컬 조직 환경에의 관찰. 더 빨갛게, 붓기, 또는 다른 염증 증상, 관찰 되었다 하 고 튜브로 둘러싸여 발달된 결합 조직 이식 후 7 일. 이것은 로컬 조직 환경 젤라틴 튜브의 우수한 생체 적합성의 지표 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 간단한 젖은 조직 재생에 대 한 천연 고분자의 연구에 적용할 수 있는 기술 회전을 사용 하 여 젤라틴 기반 생체 재료의 개발을 제시. 이 작품 자체는 젤라틴의 속성을 최적화 하는 목적으로 다른 소스를 추가 하지 않고 훌륭한 단백질 소스로 젤라틴 제조의 가능성을 보여주었다. 젤라틴-기반 생체 재료의 개발 실 온 (22-26 ° C)에서 완전히 실행 되었다. 정확한 솔루션 농도 유지 하 고 모든 거품을 피하기 위해 솔루션을 매우 원활 하 게 교 반 부드러운 솔루션 준비는 프로토콜 내에서 중요 한 단계입니다. 솔루션에 거품의 모양, 주사기에 로드 하는 경우에 특히 응고 매체에 젤라틴의 형태로 적용 됩니다.
젤라틴-기반 바이오 폴리머 분자의 desolvation를 일으키는 원인이 되 고 고체 폴리머 단계11에 젤라틴 솔루션을 침전 하는 적당 한 응고 매체에 젤라틴 솔루션의 위상 전환을 통해 얻은 했다. 습식 방법 회전의이 기본 개념을 채용 하 여 우리 튜브 형태로 표면의 기능 향상 및 성형 과정을 통해 인간의 조직의 기능을 모방 하는 젤라틴의 모양을 활용. 이 경우에, 로드, 적절 한 시간, 누른 정확한 튜브 형태를 구축 하는 데 필요한 단계를 반복 합니다. 이 프로토콜에 과정에서 튜브 모양의 동질성 제어할 수 없습니다, 고려는 튜브의 위쪽 부분에 아래쪽에서 인계의 비동기적으로. 또한,이 자료에 대 한 보존 및 멸 균 방법의 단백질 함량으로 인해 제한 됩니다.
생체 외에서 그리고 vivo에서 테스트로 검사 하는, 현재 결과이 프로토콜을 사용 하 여 만든 젤라틴 튜브는 우수한 생체 적합성을 전시 하 고 조직 공학에 있는 큰 잠재적인 적용을 시연 했다. 이 연구에서 얻어진 젤라틴 튜브 내경 200 µ m (그림 3B), 통과 하는 튜브의 내부 표면16쉽게 준수 셀 수 있도록 했다. 또한, 두께 튜브의 약간 asperous 표면 셀 첨부 파일 (그림 3A, C)에 대 한 적절 한 서식 파일을 제공. 일관 되 게, immunocytochemistry 결과 보였다 세포 관통 하 고 준수 하는 젤라틴 튜브-특히는 신경 줄기 세포, 신경 세포 마커 nestin (그림 4B와의 긍정적인 얼룩을 통해 관찰 ). Nestin 마커 축 삭 확장의 단계 성장 콘의 지역에서 발견 되었다, nestin의 긍정적인 얼룩은 콘 성장17의 암시. 궁극적으로,이 긍정적인 젤라틴-hASCs 조합 신경 재생 치료에 구현할 수 있습니다. 척수는 신경 축 삭의 그룹과 함께 척추 척추 신경 섬유의 묶음의 구성 되어 있습니다. 따라서, 젤라틴 튜브 수 있습니다 뿐만 아니라 적절 한 충전 간격 재를 제공 하지만 또한 가이드 신경 섬유 성장 및 튜브를 통해 재생 됩니다. 또한, 훌륭한 생체 적합성 관찰 근 막에 젤라틴 튜브의 주입에 의해 레이어 어떤 유해한 증명 하지 않았다 지역 조직, 그리고 튜브에 염증 효과 발달된 결합 조직 (그림 5에 의해 포위 되었다 A, B).
결론적으로, 우리는 성공적으로 젤라틴 기반 바이오 엔지니어링 응용 프로그램와 같은 긴장에 전망 조직에 사용할 수 있는 우수한 생체 적합성 및 셀 환경 건설에 대 한 간단 하 고 유용한 프로토콜 개발 시스템 재생, 혈관, 방광 재건, 그리고 기관 부품의 재건에. 이 프로토콜은 현재 어떤 합성 폴리머 추가 없이 상호 천연 고분자를 개발 하는 조직 엔지니어에 의해 구현할 수 있습니다. 프로토콜에 따라 쉽게 확장 될 수 있다 그리고 특정 생체의 디자인을 사용자 지정 하는 데 사용할 수 있습니다. 미래에이 프로토콜 따라서 돕는 조직 재생을 실현 하는 대량 규모에 단백질 기반 바이오 소재 생산에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 국가 방위 정부 (MAB-105-070;에 의해 지원 되었다 MAB-106-077; MAB-107-032; MAB-107-065)의 과학 및 기술 (대부분 107-2320-B016-016), 세 배 서비스 종합 병원, 국가 방위 의료 센터, 대만 (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041), 쳉-Hsin 종합 병원 그리고 국가 방위 의료 센터 협력 (CH-NDMC-107-8).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | - |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | - |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | - |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | - |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | - |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | - |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | - |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
References
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