Summary
我们开发并描述了一种基于湿法纺纱概念的协议, 用于构建用于组织工程应用的明胶基生物材料。
Abstract
本文提出了一种廉价的方法, 以制备明胶, 作为一种天然聚合物, 成单丝纤维或其他适当的形式。通过湿法纺丝法, 在合适的凝固介质中, 通过光滑挤压生产明胶纤维。为了增加这些明胶纤维的功能表面和它们模仿组织特征的能力, 明胶可以通过参考这个概念被塑造成一个管状。通过体外和体内试验, 明胶管在组织工程中具有巨大的应用潜力。明胶管作为合适的填充间隙材料, 可用于替代受损区域 (如神经或心血管系统) 的组织, 并通过直接替代干细胞和神经电路来促进再生。该协议提供了一个基于天然聚合物的生物材料的详细过程, 其实施有望极大地有利于相关天然聚合物的开发, 这有助于实现组织再生策略。
Introduction
组织再生的最新发展涉及组织工程的应用, 这对改进医疗新的治疗策略提出了挑战。例如, 在受伤或疾病之后, 神经系统再生的潜力有限, 在全世界造成了严重的健康问题。由于与神经系统相关的病理生理过程的复杂性, 传统的自体移植或稳定手术的实施已被证明在功能结果方面有好处, 但没有有力的证据表明脊柱固定手术的效果 1,2。受损部位的组织丢失, 取而代之的是肥大诱导的星形胶质细胞3, 最终形成致密的胶质瘢痕 4,5。这个基质作为一个屏障, 阻止恢复神经功能6, 7, 因此, 极大地阻碍了再生。因此, 通过保持受损区域的完整性, 以及通过直接替换神经细胞和电路, 以促进轴突再生。
聚合物生物材料被首选为组织再生治疗的支架, 基于调节细胞或轴突行为和组织进展, 通过自然细胞外基质 (ecm) 的支持。纤维格式通常被认为是各种材料的组成部分, 因为它是一维结构8。纤维一般可以通过熔体挤出或湿法纺丝获得;然而, 设备的大尺寸和成本以及执行这些方法的难度是具有挑战性的。此外, 与聚合物纤维相关的大部分工作都集中在合成材料或复合材料上。天然聚合物作为生物材料的来源, 为人体提供了更好的生物相容性。然而, 要获得天然聚合物纤维的对齐是相对困难的比合成聚合物来源9。因此, 将天然聚合物作为丰富的蛋白质来源转化为生物材料纤维是一项重要的策略--不仅可以直接从原料中分离出生物材料纤维, 从而避免不必要地转化为单体, 而且蛋白质纤维也具有良好的外观和良好的特性10。
在这方面, 我们通过湿法纺丝的基本概念描述了一种制造天然聚合物纤维的廉价加工方法, 该方法可在组织工程的实验室规模上实施。湿法纺丝是通过将聚合物溶液挤压和凝固成合适的聚合物非溶剂来进行的。适当的粘性溶液掺杂到凝固介质中, 会使聚合物分子溶解。通过相变, 细丝失去其溶解度,并以固体聚合物11相的形式沉淀。参照这一概念, 我们通过成型工艺将明胶的发展扩展到管形, 这被认为适合组织再生应用。此外, 本质上, 我们还可以开发任何形状的材料从明胶纤维 (例如, 明胶导管卷起从几个明胶纤维), 为其他所需的应用。
明胶是一种可生物降解的天然聚合物, 由变性和水解胶原蛋白形成, 包括胶原蛋白12的任何半晶、无定形或三重螺旋状态.众所周知, 胶原蛋白是脊椎动物和无脊椎动物13,14的所有结缔组织中必不可少的结构蛋白, 这类似于诱导神经生长的主要 ecm 的蛋白质结构,同时, 取代脊髓损伤过程中分泌的大量糖胺多糖。因此, 使用明胶作为来源将是一个伟大的选择, 任何医疗车辆。除了是一个廉价的来源, 明胶也是生物降解和细胞兼容和临床证明是一个临时缺陷填充 15.在这里描述的体外和体内测试中发展成一种管状,表明明胶具有优异的生物相容性, 适合未来的组织工程应用。明胶管利用人脂肪干细胞培养, 以阳性 nestin 染色为神经细胞标记, 改善细胞分化为神经祖细胞的作用。此外, 明胶作为填充间隙材料, 由本研究中建立的方法, 预计将是可控和安全的, 并大大有利于组织工程师谁目前正在开发相关的天然聚合物, 以增强组织再生策略。
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Protocol
这些脂肪组织是经台湾台北市三服务总医院机构审查委员会认证的骨科手术中获得的, 涉及动物主体的程序已得到国家动物护理委员会的批准国防医疗中心, 台湾 (r. c.)
1. 湿法纺纱工艺
-
解决方案准备
- 将5克明胶粉溶解在100毫升的双蒸馏水中, 得到 5% (w v) 溶液浓度。
- 在60-70°c 下一夜慢慢搅拌混合物, 以实现完全均匀的分散, 而不会产生任何气泡。
-
湿法纺纱
- 纤维形成
请注意:该方法的示意图如图 1a所示。纺纱装置配备了一个蠕动泵机 (见材料表), 提供高精度的速度, 并控制流量的顺利输送。- 将 26 g x 半英寸 (0.45 mm x 12 mm) 注射器插入透明的乙烯基管中, 作为溶液喷射器。
- 在烧杯中制备100毫升99.5% 丙酮溶液, 用作凝固浴。
- 在晚上21转 (3点25mlmmin) 运行蠕动泵机, 让明胶溶液在丙酮溶液中站立几秒钟, 然后卷起它。
- 从丙酮溶液中取出明胶纤维, 用 1:20 (w/w) 将其浸入聚氯丁胺/氯甲烷 (pcl/dcm) 溶液的 2.5% (w/v) 中。
- 让 pcl/dcm 溶液中的明胶纤维在室温下在引擎盖下干燥一夜。
- 管材成型
请注意:该方法的示意图如图 1b 所示。- 使用 24 g x 英寸 (0.7 mm x 19 毫米) 的外周静脉导管作为管模。
- 将导管加载到明胶溶液中, 并将其固定在那里3秒。
- 将导管装入丙酮溶液并保持1分钟。
- 将导管再次加载到明胶溶液中, 并将其保持在那里3秒。
- 重复此替代过程20x。
- 从丙酮溶液中取出导管, 让成型管在室温下干燥5分钟。
- 用止血剂轻轻取出导管中的明胶管, 并小心地将明胶管转移到玻璃巴斯德移液器中, 浸入 pcl/dcm 溶液的比例为 2.5% (w/v)。
- 让含有明胶管和 pcl/dcm 溶液的巴斯德移液器在室温下在引擎盖下干燥一夜。
- 纤维形成
2. 明胶管的形态
- 将干明胶管安装在碳存根上。
- 将样品放入离子溅射涂布机 (见材料表), 并将样品涂上60秒的黄金;然后, 用扫描电子显微镜观察它的形态 (见材料表)。
3. 人体脂肪干细胞的培养
- 将脂肪组织 (通过临床手术从口腔脂肪组织中获得) 放入培养皿中, 其中含有10毫升的转移溶液, 其中包括 0.1 m 磷酸盐缓冲盐水 (pbs)、1% 的青霉素/链霉素和0.1% 的葡萄糖。
- 用手术刀刀片将组织切成小块 (小于1毫米2)。
- 以 500 x g 的速度将组织转移到15毫升塑料管和离心机中5分钟。
- 在37°c 的高温下, 取出含有10毫升 dulbecco 改装的 eagle 培养基 (dmem, 由 4 mL l-谷氨酰胺、1 mL 丙酮酸钠和 15 mgl 苯酚红组成), 在37°c 的低温下, 取出上清液并在含有10毫升的塑料管中孵育沉积物, 并将其培养成液。含有95% 的空气和5% 的二氧化碳,为期1天。
- 以 500 x克的速度离心塑料管 5分钟, 小心丢弃上清液 (不要接触沉积物), 然后加入含有10% 胎儿牛血清 (fbs) 的10毫升 dmem, 轻轻悬浮沉淀物, 让它在37°c 时站立1天, 在加湿的大气中含有95% 的空气和5% 的二氧化碳.
- 以 500 x g离心塑料管 5分钟, 并小心丢弃上清液;然后, 加入1毫升的干细胞培养基 (由角质形成细胞无血清学媒介 (k-sfm) 组成), 5% 的 fbs、n-乙酰-l-半胱氨酸、抗坏血酸-2-磷酸、链霉素和两性霉素悬浮沉积物, 并将其转移到含有4毫升的 t25 培养瓶中。干细胞培养基, 并让它在37°c 下站立 3天, 在加湿的气氛中含有95% 的空气和5% 的 co2.
- 丢弃上清液, 加入1毫升0.25% 的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 (edta), 并在37°c 孵育, 在含有95% 空气和 5% co2 的加湿气氛中孵育 3.5分钟, 将细胞从培养瓶的底部分离。
- 加入1毫升的 fbs, 悬浮混合物, 并将其转移到微离心管。
- 以 500 x克离心悬浮液3.5 分钟, 用1毫升的干细胞培养基悬浮沉淀物, 并将其转移到含有5毫升干细胞培养基的培养瓶中;然后, 将其保持在37°c 的加湿大气中, 其中含有95% 的空气和5% 的二氧化碳.
- 通过每3天改变干细胞培养基来维持亚培养。
4. 明胶管细胞的培养
- 用紫外线灭菌明胶管 2小时;然后, 将其浸入 75% (v/v) 乙醇中, 用干细胞培养基清洗 2倍, 去除残留乙醇。
-
从培养瓶中收集人体脂肪干细胞 (hASCs)。
- 从培养瓶中取出介质。
- 加入1毫升0.25% 的胰蛋白酶 edta, 在含有95% 空气和 5% co2 的加湿大气中孵育 3.5分钟, 将 hASCs从培养瓶底部分离。
- 加入1毫升的 fbs, 悬浮混合物, 并将其转移到微离心管。
- 以 500 x g 离心微离心管3.5 分钟; 然后, 小心地丢弃上清液, 用1毫升的干细胞培养基悬浮沉淀物。
- 将明胶管放入含有3毫升干细胞的6孔板中, 种子 4 x10 4 的hASCs 放入管中;在37°c 条件下, 在含有95% 空气和5% 二氧化碳的加湿大气中孵育2周。
- 每3天改变一次干细胞培养基, 为细胞生长提供足够的营养。
5. 免疫细胞化学
- 取出干细胞培养基, 用 pbs 清洗油井。
- 将带有0.1% 醋酸冰糖的细胞固定在试管30分钟内。
- 用 pbs 清洗2倍的井。
- 添加表面活性剂 (np-40, 0.05%)并在室温下孵育10分钟。
- 用 pbs 清洗3x 的井。
- 加入2% 的正常山羊血清, 在室温下孵育30分钟。
- 分解溶液, 加入原代抗体 nestin (神经祖细胞标记), 在4°c 下孵育过夜。
- 用 pbs 清洗3x 的井。
- 加入二级抗体驴抗鼠荧光素异硫氰酸酯 (fitc), 并将样品保持在黑暗中2小时。
- 用 pbs 清洗3x 的井。
- 加入1毫升的 hoechst 33342, 在室温下染色细胞核并孵育10分钟。
- 轻轻清洗油井, 用荧光显微镜观察。
6. 活体生物相容性试验
请注意:体重在201-225 克之间的大鼠已使用该协议成功测试。
-
麻醉
- 产生和维持麻醉;最好是通过肌肉注射替拉明和唑拉西帕 (分别为 25 mg/kg + 25 mg kg) 和 xylazine (5 mg/kg) 麻醉大鼠 (8周龄 sprague dawley 大鼠, 雌性). 通过按老鼠的手指来确认麻醉, 进行疼痛刺激测试。
-
手术部位的消毒
- 对大鼠梯形区域 (颈部后部) 的皮肤进行擦拭和清洁, 并将其擦拭为 pavido-ido 化妆水, 以制备皮肤无菌状态 (100 mg/ml)。
- 用无菌手术窗帘覆盖大鼠, 以减少细菌转移和随后对手术部位的污染。
-
明胶管的植入
- 用手术剪刀轻轻割伤大鼠梯形区域的皮肤。
- 创建2厘米的伤口, 并将明胶管直接放在筋膜和肌肉之间的层。
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种植后手术
- 用尼龙缝合线缝合伤口, 用 povidone-did 溶液 (100 mg/ml) 擦拭伤口。
- 通过肌肉注射酮洛芬 (2.5 mg/kg) 和头孢唑啉 (15 mg/kg) 诱导大鼠。
- 让老鼠保持无菌状态7天。
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安乐 死
- 根据 avma 安乐死指南,通过二氧化碳窒息对大鼠进行安乐死。通过脚趾和尾巴确认大鼠死亡, 然后用胸部触摸以确保心跳。
- 用手术刀轻轻切下大鼠, 取出植入的组织, 并拍照观察。
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Representative Results
在这项研究中, 我们成功地将明胶开发成纤维 (图 2a) 和管 (图 2b, c), 通过用户友好的湿纺概念。这些基于明胶的材料可作为任何医疗工具使用, 具体取决于其形状。考虑到这种材料的功能表面和框架更适合组织再生, 我们通过体外和体内试验来检测明胶管的生物相容性。
为了获得明胶管的概述, 首先, 我们使用扫描电子显微镜进行了形态学观察 (图 3)。结果表明, 明胶管表面不是很光滑 (图 3a), 内径大于200微米 (图 3b), 厚度约为 20μm (图 3c)。
然后, 进行免疫细胞化学检查明胶管的体外生物相容性 (图 4)。最初, 明胶管与人类脂肪干细胞孵育 2周, 并染色尼斯坦作为神经细胞标记 (图 4a)。在荧光显微镜下, 染色显示阳性 nestin 染色标记 (绿色) 与一系列检测到的细胞核 (蓝色), 这表明细胞可以很好地渗透和粘附到明胶管, 并分化为神经祖细胞 (图 4b)。此外, 明胶管的体内生物相容性试验显示了类似的结果。明胶管入到热像层在鼠的梯形区域 7 天。结果表明, 明胶管植入筋膜层表明其安全性和良好的生物相容性, 没有表现出局部组织发红、肿胀或其他炎症症状的迹象, 并被发育良好的结缔组织 (图 5a, b)。
图 1: 湿法纺纱装置的方案.(a) 明胶纤维。(b) 明胶管。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 通过湿法纺丝法获得的明胶基材料的明亮图像.(a) 明胶纤维。(b) 明胶管。(c) pbs 溶液中的明胶管。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 明胶管的形态, 用扫描电镜观察.(a) 明胶管表面的表面视图 (刻度棒 = 50μm)。(b) 倾斜平面视图 (刻度柱 = 200μm)。(c) 垂直视图 (刻度杆 = 25μm)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 观察人脂肪干细胞 (hasc) 在明胶管上的生长.(a) 明胶管-hasc 的明亮视图图像。(b) 在荧光显微镜下, 染色显示出阳性的 nestin 染色标记, 以及一堆用 hoechst 33342 染色的细胞核。= 200 微米;蓝色 = 原子核;绿色 = nestin)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:明胶管的体内生物相容性试验.(a) 明胶管植入筋膜层。(b) 观察7天后植入明胶管 (红色矩形区) 的局部组织环境。未观察到发红、肿胀或其他炎症症状, 植入后 7天, 导管周围有发育良好的结缔组织。这表明明胶管与当地组织环境具有良好的生物相容性。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
我们介绍了明胶基生物材料的发展, 使用简单的湿法纺丝技术, 可用于研究天然聚合物的组织再生。这项工作证明了明胶制造作为一个伟大的蛋白质来源, 而无需添加其他来源的可能性, 目的是优化明胶本身的性能。基于明胶的生物材料的开发完全是在室温 (22-26°c) 下进行的。温和的溶液制备是协议中的关键一步, 因为保持精确的溶液浓度和非常平稳地搅拌溶液以避免任何气泡也是如此。溶液中气泡的出现, 尤其是装入注射器时, 会影响凝固介质中明胶的形式。
明胶基生物材料是通过明胶溶液在合适的凝固介质中的相变获得的, 这种相变会导致聚合物分子的脱盐和沉淀明胶溶液进入固体聚合物11相.通过采用湿法的这一基本概念, 我们利用明胶的形状成管状, 以增加其表面的功能, 并通过成型过程模拟人体组织的特征。在这种情况下, 需要足够的时间来加载、保持和重复步骤, 以建立一个精确的管形。在该协议中, 考虑到从管道底部到上部的过渡阶段的异步, 不能控制该过程中管形状的同质性。此外, 由于这种材料的蛋白质含量, 这种材料的保存和灭菌方法有限。
通过体外和体内试验, 目前的结果表明, 使用该协议创建的明胶管具有良好的生物相容性, 在组织工程中具有很大的潜在适用性。在这项研究中获得的明胶管的内径超过200微米 (图 3b), 这使得细胞通过, 并容易粘附在管的内表面16。此外, 管的厚度和轻度粗糙的表面为细胞连接提供了一个合适的模板 (图 3a, c)。免疫细胞化学结果一致显示, 这些细胞穿透并粘附明胶管, 特别是神经干细胞, 通过神经细胞的阳性染色观察到的 nestin 标记 (图 4b)。).由于在轴突延伸阶段的生长锥区发现了尼斯汀标记物, 因此 nestin 的阳性染色表明圆锥生长为 17。最终, 这种积极的明胶-hasc 组合可用于神经系统再生的治疗。脊髓是由神经元轴突和沿脊椎的神经纤维束组成的。因此, 明胶管不仅可以提供适当的填充间隙材料, 而且还将引导神经纤维生长和再生通过管。此外, 明胶管植入筋膜层所观察到的巨大生物相容性并没有显示出对局部组织有任何有害和炎症的影响, 导管周围都是发育良好的结缔组织 (图 5)。 A、B)。
总之, 我们成功地开发了一个简单而有用的协议, 用于构建具有良好生物相容性和细胞环境的明胶基生物材料, 可用于未来组织工程应用, 如神经。系统再生, 血管置换, 尿路重建, 并在重建器官部位。该协议可由组织工程师实施, 他们目前正在开发相关的天然聚合物, 无需添加任何合成聚合物。该协议可以很容易地扩展, 并可用于定制特定生物材料的设计。在未来, 该协议可以适应生产基于蛋白质的生物材料在质量尺度上, 从而有助于实现组织再生。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国防部的支持 (mab-105-070);ma6-106-077;ma6-107-032;maba-107-065), 科技部 (最低 107-2320-b016-016), 三科总医院, 国防医疗中心, 台湾 (tgh-c106-046;tgh-c106-115;tgh-c107-041), 和成新总医院和国防医疗中心合作 (ch-ndmc-107-8)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | - |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | - |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | - |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | - |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | - |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | - |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | - |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
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