Summary
Abbiamo sviluppato e descrivere un protocollo basato sul concetto di filatura bagnata, per la realizzazione di biomateriali basati su gelatina utilizzata per l'applicazione dell'ingegneria tissutale.
Abstract
Questo articolo presenta un metodo economico per fabbricare gelatina, come un polimero naturale, in fibre monofilamento o altre forme appropriate. Attraverso sul bagnato metodo di filatura, fibre di gelatina sono prodotte per estrusione liscia in un mezzo adatto coagulazione. Per aumentare la superficie funzionale di queste fibre di gelatina e la loro capacità di imitare le caratteristiche dei tessuti, la gelatina può essere modellato in una forma di tubo facendo riferimento a questo concetto. Esaminato dai test in vitro e in vivo, i tubi di gelatina dimostrano un grande potenziale per l'applicazione nell'ingegneria tissutale. Agendo come un materiale di riempimento adatto gap, gelatina tubi possono essere utilizzati per sostituire il tessuto nella zona danneggiata (ad esempio, nel sistema nervoso o cardiovascolare), nonché per promuovere la rigenerazione fornendo una sostituzione diretta delle cellule staminali e circuiti neurali. Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata per la creazione di un biomateriale basato su un polimero naturale, e la sua attuazione è previsto per lo sviluppo del correlativi polimeri naturali, che aiutano a realizzare strategie di rivitalizzazione del tessuto di grande beneficio.
Introduction
L'ultimo sviluppo nella rigenerazione del tessuto comporta l'applicazione dell'ingegneria tissutale, che rappresenta una sfida per il miglioramento di nuove strategie terapeutiche nei trattamenti medici. Ad esempio, il limitato potenziale di rigenerazione del sistema nervoso, seguenti lesioni o malattia, pone un problema significativo per la salute in tutto il mondo. A causa della complessità dei processi fisiopatologici associati con il sistema nervoso, l'uso di autoinnesto tradizionale o l'esecuzione di chirurgia di stabilizzazione ha dimostrato di offrire benefici in esiti funzionali, ma non ci è prova forte per gli effetti della fissazione spinale Chirurgia1,2. Il tessuto presso l'area danneggiata è perso e sostituito con hypertrophically indotto astrociti3, alla fine formano un denso cicatrice gliale4,5. Questa matrice agisce come una barriera che blocchi il recupero del nervo funzione6,7 ed è, quindi, ostacola notevolmente rigenerazione. Pertanto, si prevede un materiale di divario di riempimento adatto per prevenire la perdita di tessuto e ridurre la formazione di cicatrice-collegato del tessuto connettivo, mantenendo l'integrità della zona danneggiata, nonché offrendo la sostituzione diretta delle cellule neurali e circuiti per promuovere la rigenerazione dell'assone.
Biomateriali polimerici sono state preferite come scaffold per la terapia di rigenerazione del tessuto, sulla base del regolamento della cella o dell'assone comportamento e tessuto progressione attraverso il sostegno naturale della matrice extracellulare (ECM). Il formato della fibra è comunemente considerato come un blocco di costruzione per vari materiali, a causa della sua struttura unidimensionale8. Le fibre si ottengono generalmente dei melt estrusione o wet spinning metodo; Tuttavia, le grandi dimensioni e il costo dell'apparecchiatura e la difficoltà di eseguire questi metodi sono impegnativi. Inoltre, la maggior parte del lavoro relazionato a fibre di polimeri è stata concentrata su materiali sintetici o compositi. Polimeri naturali come fonte di biomateriale offrono migliori proprietà di biocompatibilità per il corpo umano. Tuttavia, per ottenere l'allineamento delle fibre di polimeri naturali è relativamente più difficile che di polimero sintetico fonti9. Quindi, la conversione di un polimero naturale come una ricca fonte di proteine in fibre di biomateriale è una strategia importante — non solo possono essere direttamente le fibre di biomateriale isolato dalla materia, evitando così una trasformazione inutile ai monomeri, ma la fibre di proteine hanno anche un bell'aspetto e caratteristiche favorevoli10.
A questo proposito, descriviamo un metodo di trattamento economico per la produzione di fibre di polimeri naturali attraverso il concetto di base della filatura bagnata, che può essere implementata su scala di laboratorio per l'ingegneria tissutale. Filatura bagnata avviene mediante estrusione e la coagulazione di una soluzione di polimero in un nonsolvent di polimero adatto. Una soluzione appropriata, viscosa drogata nel mezzo di coagulazione provoca le molecole di polimero a dissolversi. Attraverso la transizione di fase, i filamenti quindi perdono la loro solubilità e sono precipitati sotto forma di un polimero solido fase11. Riferendosi a questo concetto, abbiamo quindi ampliato lo sviluppo della gelatina in forma tubo tramite un processo di stampaggio, che è considerato adeguato per l'applicazione di rigenerazione del tessuto. Inoltre, intrinsecamente, possiamo anche sviluppare qualsiasi forma di materiale dalle fibre di gelatina (ad es., condotto di gelatina arrotolato da parecchie fibre di gelatina), per altre applicazioni desiderate.
Gelatina, un polimero naturale biodegradabile, è formata da collagene denaturato ed idrolizzato, compreso qualsiasi stato semicristalline, amorfo o Tripla elicoidale di collagene12. È ben noto che il collagene è la proteina strutturale essenziale in tutti i tessuti connettivi di vertebrati e invertebrati13,14, che è simile alla struttura di proteina della ECM principale che induce la crescita del nervo e, contemporaneamente, sostituisce una grande quantità di glicosaminoglicani secernuta durante lesioni del midollo spinale. Pertanto, l'utilizzo della gelatina come fonte sarebbe un'ottima scelta per qualsiasi veicolo di intervento medico. Oltre ad essere una fonte economica, la gelatina è anche biodegradabile e citocompatibili e clinicamente dimostrato di essere un temporaneo difetto filler15. Sviluppato in una forma di tubo,, test in vitro e in vivo, descritti qui dimostrano che la gelatina ha un'eccellente biocompatibilità e idoneità per future applicazioni di tessuto. Coltivate con cellule staminali adipose umane, tubi di gelatina migliorano differenziamento in cellule progenitrici neurali utilizzando la macchiatura positiva nestina come un indicatore delle cellule neurali. Inoltre, la gelatina come materiale di riempimento gap, come prodotto dal metodo stabilito in questo studio, è previsto di essere gestibile e sicuro e di grande beneficio ingegneri di tessuto che stanno attualmente sviluppando correlativi polimeri naturali per la valorizzazione del tessuto strategie di rivitalizzazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I tessuti grassi sono stati ottenuti da interventi chirurgici ortopedici, come certificato da istituzionale Review Board di Tri-Service ospedale generale, Taipei, Taiwan, r.o.c. procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di cura degli animali a livello nazionale Centro medico della difesa, Taiwan (R.O.C).
1. Inumidire il processo di filatura
-
Preparazione della soluzione
- Sciogliere 5 g di gelatina in polvere in 100 mL di acqua bidistillata per ottenere la concentrazione della soluzione di 5% (p/v).
- Mescolare il composto lentamente a 60-70 ° C durante la notte per ottenere una dispersione completamente omogenea senza eventuali bolle.
-
Bagnato di filatura
- Formazione della fibra
Nota: Un disegno schematico del metodo è illustrato nella Figura 1A. Il programma di installazione di filatura è dotato di una macchina pompa peristaltica (Vedi Tabella materiali) che fornisce velocità di alta precisione e controlla la fluidità di erogazione del flusso.- Collegare una siringa di 26 x 1/2 pollice (0,45 mm x 12 mm) come l'iniettore soluzione tubazione del vinile chiaro.
- Preparare 100 mL di soluzione di acetone 99,5% in un vetro di bicchiere da utilizzare come il bagno di coagulazione.
- Eseguire la macchina pompa peristaltica a 21 giri (3,25 mL/min) e lasciar riposare per alcuni secondi in soluzione di acetone prima di distribuirlo la soluzione di gelatina.
- Estrarre le fibre di gelatina dalla soluzione di acetone e immergerli nel 2,5% (p/v) di diclorometano/policaprolattone (PCL/DCM) con 01:20 (w/w).
- Lasciate che la gelatina fibre nella soluzione di PCL/DCM asciutta durante la notte, sotto il cofano a temperatura ambiente.
- Formazione del tubo
Nota: Un disegno schematico del metodo è illustrato nella Figura 1B.- Utilizzare un catetere venoso periferico di 24 x 3/4 di pollice (0,7 mm x 19 mm) come stampo tubo.
- Inserire il catetere nella soluzione di gelatina e tenerlo lì per 3 s.
- Inserire il catetere nella soluzione di acetone e tenere premuto per 1 min.
- Caricare nuovamente il catetere nella soluzione di gelatina e tenerlo lì per 3 s.
- Ripetere questa procedura alternativa 20x.
- Estrarre il catetere dalla soluzione di acetone e lasciare il tubo sagomato asciugare a temperatura ambiente per 5 min.
- Estrarre delicatamente il tubo di gelatina dal catetere utilizzando una pinza emostatica e trasferire con cautela il tubo di gelatina in un bicchiere pipetta Pasteur con l'immersione del 2,5% (p/v) della soluzione PCL/DCM.
- Lasciate che la pipetta di Pasteur contenente che il tubo di gelatina e la soluzione PCL/DCM asciutto durante la notte, sotto il cofano a temperatura ambiente.
- Formazione della fibra
2. morfologia del tubo gelatina
- Montare il pezzo di tubo di gelatina secche su un albero mozzo del carbonio.
- Mettere il campione nella macchina spalmatrice Polverizzi dello ione (Vedi Tabella materiali) e rivestire il campione con l'oro per 60 s; poi, osservare la sua morfologia di microscopia elettronica a scansione (Vedi Tabella materiali).
3. cultura di cellule staminali Adipose umane
- Inserire i tessuti grassi (ottenuti dal tessuto adiposo orale di clinica chirurgica) in una capsula di Petri contenente 10 mL di soluzione di trasferimento costituita da 0.1 M tampone fosfato salino (PBS), 1% di penicillina/streptomicina e 0,1% di glucosio.
- Tagliare i tessuti in piccoli pezzi (meno di 1 mm2) con un bisturi.
- Trasferire i tessuti in un tubo di plastica da 15 mL e centrifugare a 500 g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e incubare il sedimento in un tubo di plastica contenente 10 mL di terreno dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM, composto da 4 mM L-Glutammina, piruvato di sodio di 1 mM e 15 mg/L rosso fenolo) con collagenasi 0,1% a 37 ° C, in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO2, per 1 giorni.
- Centrifugare la provetta in plastica a 500 x g per 5 min, scartare il surnatante con attenzione (non toccare il sedimento) e quindi, sospendere il sedimento delicatamente aggiungendo 10 mL di DMEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e lasciar riposare per 1 giorno a 37 ° C , in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO2.
- Centrifugare la provetta in plastica a 500 x g per 5 min e scartare il surnatante con cura; quindi, aggiungere 1 mL di mezzo di cellule staminali (consistendo del keratinocyte medium senza siero (K-SFM), 5% di FBS, N-acetil-L-cisteina, acido ascorbico-2-fosfato, streptomicina e amfotericina) di sospendere il sedimento, trasferirlo in un matraccio di cultura T25 contenente 4 mL di gambo medio delle cellule e lasciar riposare per 3 giorni a 37 ° C, in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO2.
- Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di acido di 0,25% tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a 37 ° C, in atmosfera umidificata contenente aria 95% e 5% CO2 per 3,5 min, per staccare le cellule dal fondo del matraccio di cultura.
- Aggiungere 1 mL di FBS, sospendere la miscela e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga.
- Centrifugare la sospensione a 500 x g per 3,5 min, sospendere il sedimento con 1 mL di mezzo di cellule staminali e trasferirlo nel matraccio di cultura contenente 5 mL di mezzo di cellule staminali; quindi, tenere a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO2.
- Mantenere la sottocultura modificando il mezzo di cellule staminali ogni 3 giorni.
4. coltivazione delle cellule del tubo di gelatina
- Sterilizzare il tubo di gelatina con luce UV per 2 h; quindi, immergerla in etanolo di 75% (v/v) e lavarlo 2x con il mezzo di cellule staminali per rimuovere il residuo dell'etanolo.
-
Raccogliere le cellule staminali adipose umane (hASCs) dal matraccio di cultura.
- Rimuovere il supporto dal pallone di cultura.
- Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA 0.25% e incubare a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO2 per 3,5 min, per staccare hASCs dal fondo del matraccio di cultura.
- Aggiungere 1 mL di FBS, sospendere la miscela e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga.
- Centrifugare la provetta per microcentrifuga a 500 x g per 3,5 min; quindi, eliminare il supernatante attentamente e sospendere il sedimento con 1 mL di mezzo di cellule staminali.
- Posizionare il tubo di gelatina in una piastra a 6 pozzetti contenente 3 mL di terreno di cellule staminali e seme 4 x 104 di hASCs al tubo; li Incubare per 2 settimane a 37 ° C, in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO2.
- Cambiare il mezzo di cellule staminali ogni 3 giorni per fornire abbastanza nutrizione per la crescita cellulare.
5. immunocitochimica
- Rimuovere il supporto di cellule staminali e lavare bene con PBS.
- Fissare il tubo con le cellule con 0,1% di acido acetico glaciale per 30 min a temperatura ambiente.
- Lavare il ben 2 volte con PBS.
- Aggiungere un tensioattivo (0.05% NP-40) ed incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare il ben 3 volte con PBS.
- Aggiungere il 2% di siero di capra normale e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Decantare la soluzione, aggiungere anticorpo primario nestina (indicatore delle cellule progenitrici neurali) e incubare per una notte a 4 ° C.
- Lavare il ben 3 volte con PBS.
- Aggiungere anticorpo secondario asino anti-mouse-isotiocianato di fluoresceina (FITC) e mantenere il campione al buio per 2 h.
- Lavare il ben 3 volte con PBS.
- Aggiungere 1 mL di Hoechst 33342 per macchiare i nuclei ed incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Il pozzo di lavare delicatamente e osservarlo con un microscopio a fluorescenza.
6. in Vivo Test di biocompatibilità
Nota: Ratti con un peso fra 201-225 g sono stati testati con successo utilizzando questo protocollo.
-
Anestesia
- Indurre e mantenere l'anestesia; preferibilmente, anestetizzare un rat (ratto Sprague Dawley 8-settimana-vecchio, donna) tramite un'iniezione intramuscolare di tiletamina e zolazepam (25 mg / kg + 25mg / kg, rispettivamente) e xilazina (5 mg/kg). Eseguire una prova di stimolo di dolore premendo le dita del ratto per confermare l'amputate.
-
Sterilizzazione del sito chirurgico
- La barba e pulire la pelle della zona trapezio di ratto (sopra la parte posteriore del collo) e pulirlo con lozione povidone-iodio per preparare la condizione asettica della pelle (100 mg/mL).
- Coprire il topo con teli chirurgici sterili per ridurre il trasferimento batterico e successiva contaminazione del sito chirurgico.
-
Impianto del tubo gelatina
- Tagliare delicatamente la pelle dell'area trapezio di ratto con una forbice chirurgica.
- Creare una ferita di 2 cm e inserire il tubo di gelatina direttamente sullo strato tra la fascia e il muscolo.
-
Chirurgia delle
- Chiudere la ferita con sutura in nylon e pulirlo con soluzione povidone-iodio (100 mg/mL).
- Indurre il ratto tramite un'iniezione intramuscolare di ketoprofene (2,5 mg/kg) e cefazolina (15 mg/kg).
- Mantenere il ratto in condizioni asettiche per 7 giorni.
-
Eutanasia
- Ratto è eutanasia tramite CO2 asfissia conformemente agli orientamenti AVMA per eutanasia. Confermare la morte del ratto di pizzico di punta e coda, seguito da petto toccante per garantire il battito cardiaco.
- Tagliare il ratto delicatamente con un bisturi, rimuovere il tessuto impiantato e scattare foto per l'osservazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In questo studio, abbiamo sviluppato con successo la gelatina in fibre (Figura 2A) e tubi (Figura 2B, C) attraverso il concetto di filatura bagnata user-friendly. Questi materiali a base di gelatina possono essere utilizzati come qualsiasi strumento medico, a seconda delle loro forme. Considerando che la superficie funzionale e telaio di tali materiali sono più adatti per la rigenerazione tissutale, abbiamo esaminato la biocompatibilità del tubo di gelatina eseguendo test in vitro e in vivo.
Per ottenere una panoramica del tubo di gelatina, in primo luogo, abbiamo condotto osservazioni morfologiche mediante microscopia elettronica a scansione (Figura 3). I risultati hanno mostrato che la superficie del tubo gelatina non era molto liscia (Figura 3A), il diametro interno era più di 200 µm (Figura 3B), e suo spessore era circa 20 µm (Figura 3C).
Allora, immunocitochimica è stata effettuata per esaminare la biocompatibilità del tubo gelatina in vitro (Figura 4). Inizialmente, il tubo di gelatina è stato incubato con cellule staminali adipose umane per 2 settimane ed è stato macchiato con la nestina come indicatore neurale delle cellule (Figura 4A). Sotto il microscopio di fluorescenza, la colorazione ha mostrato la nestina positivo che macchia di pennarello (colore verde) insieme a un mucchio di nuclei rilevati (colore blu), che ha suggerito che le cellule potrebbero penetrare e aderire bene il tubo di gelatina e differenziarsi in cellule progenitrici neurali (Figura 4B). Ulteriormente, il test di biocompatibilità in vivo del tubo gelatina ha mostrato risultati analoghi. Il tubo di gelatina è stato inserito nello strato fascia nell'area trapezio di un topo per 7 giorni. Il risultato dimostra che l'impianto del tubo gelatina nello strato fascia indicato la sua sicurezza e ottima biocompatibilità, ha mostrato alcuna indicazione di sintomi di arrossamento, gonfiore, o altre infiammazioni del tessuto locale ed era circondato da ben sviluppati tessuti connettivi (Figura 5A, B).
Figura 1 : Schema di wet spinning setup. (A) fibre di gelatina. (B) gelatina del tubo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Vedi luminose immagini di materiale a base di gelatina ottenuta attraverso il metodo di filatura di bagnato. (A) fibre di gelatina. (B) gelatina del tubo. (C) gelatina tubo soluzione PBS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Morfologia del tubo di gelatina, osservata da microscopia elettronica a scansione. (A) A vista superficiale della superficie del tubo gelatina (barra della scala = 50 µm). (B) piano inclinato vista (barra della scala = 200 µm). (C) vista verticale (barra della scala = 25 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Osservazione della crescita di cellule staminali adipose umane (hASC) sul tubo di gelatina. (A) immagine di brillante di gelatina tubo-hASCs. (B) sotto il microscopio di fluorescenza, la colorazione ha mostrato il positivo nestina macchiatura marcatore insieme a un mucchio di nuclei macchiato con Hoechst 33342.The tubo di gelatina fornito un ambiente ottimale per hASCs di aderire e far crescere all'interno del tubo (barra della scala = 200 µm; colore blu = nuclei; colore verde = nestina). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: test di biocompatibilità In vivo del tubo gelatina. (A) l'impianto del tubo gelatina nello strato di fascia. (B) osservazione dell'ambiente locale del tessuto impiantato con il tubo di gelatina (area del rettangolo rosso) dopo 7 giorni. Nessun rossore, gonfiore o altri sintomi di infiammazione sono stati osservati, e il tubo è circondato da ben sviluppati tessuti connettivi 7 giorni dopo l'impianto. Questo è indicativo di un'eccellente biocompatibilità del tubo gelatina con l'ambiente locale del tessuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Abbiamo presentato lo sviluppo di biomateriali a base di gelatina utilizzando un semplice wet spinning tecnica può essere applicata nello studio dei polimeri naturali per la rigenerazione tissutale. Questo lavoro ha dimostrato la possibilità di fabbricazione di gelatina come fonte proteica grande senza l'aggiunta di altre fonti, con l'obiettivo di ottimizzare le proprietà della gelatina stessa. Lo sviluppo di biomateriali a base di gelatina è stato interamente effettuato a temperatura ambiente (22-26 ° C). Una preparazione di soluzione delicata è un passo fondamentale nell'ambito del protocollo, come è mantenere una concentrazione di soluzione esatta e mescolando la soluzione molto agevolmente per evitare eventuali bolle. La comparsa di bolle nella soluzione, soprattutto quando caricate nella siringa, influenzerà la forma di gelatina nel mezzo di coagulazione.
Biomateriali a base di gelatina sono stati ottenuti attraverso la transizione di fase della soluzione di gelatina in un mezzo adatto di coagulazione che provoca la desolvatazione delle molecole di polimero e precipita la soluzione di gelatina in un polimero solido fase11. Impiegando questo concetto di base del metodo di filatura bagnato, abbiamo utilizzato la forma della gelatina in forma di tubo per aumentare la funzionalità della sua superficie e per imitare le caratteristiche di tessuti umani attraverso il processo di stampaggio. In questo caso, i tempi adeguati al carico, tenere e ripetere i passaggi sono necessari per costruire una forma esatta del tubo. In questo protocollo, l'omogeneità della forma tubo durante il processo non può essere controllato, considerando l'in modo asincrono della fase di transizione dal fondo per la parte alta del tubo. Inoltre, i metodi di sterilizzazione e conservati per questo materiale sono limitati a causa del suo contenuto di proteine.
Esaminato dai test in vitro e in vivo, i risultati attuali hanno dimostrato che i tubi di gelatina creati con questo protocollo esibiscono un'eccellente biocompatibilità e hanno grande potenziale applicabilità nell'ingegneria tissutale. Il diametro interno dei tubi di gelatina ottenuti in questo studio era più di 200 µm (Figura 3B), che permette alle cellule di passare attraverso e facilmente aderire a interno superficie16 dei tubi. Inoltre, lo spessore e la superficie leggermente Bumpy del tubo fornisce un modello appropriato per il collegamento delle cellule (Figura 3A, C). Costantemente, i risultati di immunocitochimica hanno mostrato che le cellule hanno penetrato e rispettate la gelatina tubo-particolarmente neurali staminali, come osservato attraverso la macchiatura positiva delle cellule neurali con il marcatore nestina (Figura 4B ). Come il marcatore nestina è stato trovato nella zona di coni di crescita durante le fasi di estensione dell'assone, la macchiatura positiva della nestina è indicativa del cono crescita17. In definitiva, questa combinazione di gelatina-hASCs positivo può essere implementata nel trattamento di rigenerazione del sistema nervoso. Il midollo spinale è costituito da gruppi di assoni del neurone e fasci di fibre nervose lungo le vertebre spinali. Così, il tubo di gelatina può non solo fornire il materiale di riempimento appropriati divario ma sarà anche guida fibre nervose crescita e la rigenerazione attraverso il tubo. Inoltre, l'ottima biocompatibilità osservato tramite l'impianto di un tubo di gelatina nella fascia strato non ha dimostrato affatto nocivo ed effetto di infiammazione sui tessuti locali e il tubo era circondato da ben sviluppati tessuti connettivi (Figura 5 A, B).
In conclusione, abbiamo sviluppato con successo un protocollo semplice e utile per la costruzione di biomateriali a base di gelatina con ambiente eccellente biocompatibilità e delle cellule che può essere utilizzato in ingegneria applicazioni, come ad esempio in nervoso tissutale di prospettiva rigenerazione del sistema, la sostituzione di vaso sanguigno, la ricostruzione del tratto urinario e nella ricostruzione di parti di organi. Questo protocollo può essere implementato da ingegneri di tessuto che stanno attualmente sviluppando correlativi polimeri naturali senza alcuna aggiunta di polimeri sintetici. Il protocollo può essere facilmente estesa e può essere utilizzato per personalizzare il design dei biomateriali specifici. In futuro, questo protocollo può essere adattato per produrre biomateriali a base di proteine su scala di massa, contribuendo così a realizzare la rigenerazione dei tessuti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Ministero della difesa nazionale (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; MAB-107-065), il Ministero della scienza e della tecnologia (la maggior parte 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, la Nazionale Difesa centro medico, Taiwan (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041) e Cheng-Hsin General Hospital e centro medico della difesa nazionale cooperazione (CH-NDMC-107-8).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | - |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | - |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | - |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | - |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | - |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | - |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | - |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
References
- Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury. Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725 (2008).
- Fehlings, M. G., Perrin, R. G. The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence. Injury. 36, Suppl 2 13-26 (2005).
- Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. J. Excitotoxic model of post-traumatic syringomyelia in the rat. Spine. 26, 1842-1849 (2001).
- Rolls, A., et al. Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation. PLoS Medicine. 5, 1262-1277 (2008).
- Properzi, F., Asher, R. A., Fawcett, J. W. Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury. Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Research Bulletin. 49, 377-391 (1999).
- Yang, Z., Mo, L., Duan, H., Li, X. Effects of chitosan/collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells. Science China Life Sciences. 53, 215-222 (2010).
- Chawla, K. K. Fibrous Materials. , Cambridge University Press. London, UK. (1998).
- Pickering, K. L., Aruan Efendy, M. G. A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance. Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).
- Lundgren, H. P. Synthetic fibers made from proteins. Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).
- Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. Coagulation mechanism in wet spinning of fibres. Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).
- Yannas, I. V. Collagen and gelatin in the solid state. Journal of Macromolecular Science Part C Polymer Reviews. 7, 49-106 (1972).
- Baer, E., Cassidy, J. J., Hiltner, A. Hierarchical structure of collagen composite Systems: lessons from biology. Pure and Applied Chemistry. 6, 961-973 (2009).
- Harrington, W. F., Von Hippel, P. H. The structure of collagen and gelatin. Advances in Protein Chemistry. 16, 1-138 (1961).
- Veis, A. The Macromolecular Chemistry of Gelatin. , Academic Press. New York, NY. (1994).
- Freyman, T. M., Yannas, I. V., Gibson, L. J. Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering. Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).
- Michalczyk, K., Ziman, M. Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization. Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).
