Summary
Wir entwickelten und beschreiben ein Protokoll basiert auf dem nass Spinnerei-Konzept für den Bau von Gelatine-basierten Biomaterialien für die Anwendung des Tissue Engineering verwendet.
Abstract
Dieser Artikel stellt eine kostengünstige Methode, um Gelatine, als ein natürliches Polymer in monofilen Fasern oder andere geeignetsten Formen zu fabrizieren. Durch den nassen Methode Spinnen werden Gelatine-Fasern durch reibungslosen Extrusion in einem geeigneten Koagulation Medium produziert. Zur Erhöhung der funktionalen Oberfläche diese Gelatine-Fasern und ihre Fähigkeit, die Eigenschaften der Gewebe nachahmen kann Gelatine in eine u-Form geformt werden, mit dem Hinweis auf dieses Konzept. Von in-vitro- und in-vivo-Tests untersucht, zeigen die Gelatine-Röhren ein großes Potenzial für den Einsatz in Gewebetechnik. Handeln als geeignete Lücke Füllmaterial, Gelatine, die Rohre, das Gewebe in den beschädigten Bereich (z. B. in der nervös oder Herz-Kreislauf-System) zu ersetzen, sowie die Regeneration zu fördern, durch die Bereitstellung eines direkten Ersatz von Stammzellen und neuralen Schaltkreis verwendet werden können. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Anleitung zum Erstellen von Biomaterial basierend auf ein natürliches Polymer, und seine Umsetzung wird voraussichtlich die Entwicklung von korrelativen natürlichen Polymeren, profitieren die Gewebe Regenerationsstrategien realisieren helfen.
Introduction
Die neueste Entwicklung in der Geweberegeneration beinhaltet die Anwendung des Tissue Engineering, was eine Herausforderung für die Verbesserung der neue Therapiestrategien bei medizinischen Behandlungen darstellt. Zum Beispiel stellt das begrenzte Potential des Nervensystems Regenerierung, folgende Verletzungen oder Krankheiten, ein erhebliche gesundheitliche Problem weltweit. Aufgrund der Komplexität der pathophysiologischen Prozesse im Zusammenhang mit dem Nervensystem die Verwendung von traditionellen Spendertransplantat oder die Umsetzung der Stabilisierung Chirurgie hat gezeigt, dass Vorteile in funktionellen Ergebnisse bieten, aber es gibt keine Evidenz für die Auswirkungen von spinaler Fixierung Chirurgie1,2. Das Gewebe an den beschädigten Bereich verloren und ersetzt mit hypertrophisch induzierte Astrozyten3, schließlich bildet einen dichten glial Narbe4,5. Diese Matrix dient als eine Sperre, dass Blöcke die Erholung des Nervs Funktion6,7 und ist somit erheblich behindert Regeneration. Daher geeignete Füllmaterial Lücke wird voraussichtlich verhindern den Verlust von Gewebe und reduzieren die Bildung von Bindegewebe Narbe verbunden, durch die Aufrechterhaltung der Integrität der beschädigten Bereich sowie durch Bereitstellung den direkten Ersatz von neuronalen Zellen und Schaltung, Axon Regeneration zu fördern.
Polymere Biomaterialien wurden als Gerüste für Gewebe-Regeneration-Therapie, basierend auf der Verordnung der Zelle oder Axon Verhalten und Gewebe Progression durch natürliche extrazelluläre Matrix (ECM) Unterstützung bevorzugt. Das Faser-Format gilt allgemein als ein Baustein für verschiedene Materialien, aufgrund deren eindimensionale Struktur8. Die Fasern erhalten Sie in der Regel durch Schmelze Extrusion oder nass Spinnerei Methode; Allerdings sind die Größe und die Kosten für die Ausrüstung und die Schwierigkeit, diese Methoden ausführen herausfordernd. Darüber hinaus hat ein Großteil der Arbeit im Zusammenhang mit Polymerfasern auf synthetische oder zusammengesetzte Materialien konzentriert. Natürliche Polymere als Quelle von Biomaterial bieten bessere Biokompatibilität Eigenschaften für den menschlichen Körper. Um die Ausrichtung des natürlichen Polymerfasern zu erhalten ist jedoch relativ schwieriger als synthetische Polymer Quellen9. Daher ist die Umwandlung von ein natürliches Polymer als eine reiche Quelle von Protein in Biomaterial Fasern eine wichtige Strategie — nicht nur können der Biomaterial-Fasern werden direkt isoliert vom Rohstoff, wodurch eine unnötige Transformation zu Monomeren, aber die Protein-Fasern haben auch ein gutes Aussehen und positive Eigenschaften10.
In diesem Zusammenhang beschreiben wir eine kostengünstige Verarbeitungsmethode für die Herstellung von natürlichen Polymerfasern durch das Grundkonzept der nass Spinnerei, die im Labormaßstab für das Tissue Engineering umgesetzt werden können. Nass Spinnerei erfolgt durch die Extrusion und Koagulation von einer Polymerlösung in einem geeigneten Polymers Nonsolvent. Eine geeignete, zähflüssige Lösung dotierten in Koagulation Medium bewirkt, dass die Polymermoleküle aufzulösen. Durch den Phasenübergang die Filamente dann verlieren ihre Löslichkeit und in Form von einem festen Polymers Phase11ausgefällt werden. Unter Bezugnahme auf dieses Konzept, erweiterten wir dann die Entwicklung der Gelatine in die u-Form um einen Spritzgießprozess, das richtige für Gewebe-Regeneration-Anwendung gilt. Intrinsisch, darüber hinaus entwickeln wir auch jede Form von Material aus Gelatine Fasern (z. B. Gelatine Conduit aufgerollt aus mehreren Fasern, Gelatine), für andere Anwendungen gewünscht.
Gelatine, ein biologisch abbaubares natürliches Polymer aus denaturierten und hydrolysiertes Kollagen, einschließlich eines teilkristallinen, amorphen oder Dreibettzimmer spiralförmigen Bundesstaates Kollagen12gebildet wird. Es ist bekannt, dass Kollagen ist die wesentlichen Strukturprotein in alle Bindegewebe der Wirbeltiere und Wirbellose13,14, die ähnlich wie die Proteinstruktur des wichtigsten ECM ist das Nervenwachstum induziert und, gleichzeitig ersetzt eine große Menge an Glykosaminoglykan abgesondert während Verletzungen des Rückenmarks. Daher wäre die Verwendung von Gelatine als Quelle eine gute Wahl für alle Fahrzeuge, medizinische. Abgesehen davon, dass eine günstige Quelle, Gelatine ist auch biologisch abbaubar und Cytocompatible und klinisch geprüft zu werden, eine vorübergehende defekt Füller15. Entwickelte sich zu einer Röhre Form, zeigen hier beschriebenen in-vitro- und in-vivo-Tests, dass Gelatine hat eine ausgezeichnete Biokompatibilität und Eignung für zukünftige Tissue engineering-Anwendungen. Kultivierten mit menschlichen Fettgewebe Stammzellen verbessern Gelatine Röhren Zelldifferenzierung in neurale Vorläuferzellen mit positiven nestin Färbung als neuronale Zelle Marker. Darüber hinaus dürfte Gelatine als Füllmaterial Lücke, wie durch die in dieser Studie etablierte Methode produziert, überschaubar und sicher sein und Gewebe Ingenieure profitieren, die derzeit korrelative natürliche Polymeren zur Verbesserung der Gewebe entwickeln Regenerationsstrategien.
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Protocol
Das Fettgewebe stammen aus orthopädischen Operationen, wie von der institutionellen Review Board der Tri-Service General Hospital zertifiziert, Taipei, Taiwan, r.o.c. Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen von Animal Care Committee auf nationaler genehmigt worden Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C).
1. nass Spinnerei Prozess
-
Vorbereitung der Lösung
- Lösen Sie 5 g Gelatine-Pulver in 100 mL bidestilliertem Wasser, Konzentration von 5 % (w/V) Lösung zu erhalten.
- Rühren Sie die Mischung langsam bei 60-70 ° C über Nacht eine völlig homogene Dispersion blasenfrei zu erreichen.
-
Nass Spinnerei
- Faser-Bildung
Hinweis: Abbildung 1Azeigt eine schematische Darstellung der Methode. Das Spinnen-Setup ist ausgestattet mit einer peristaltischen Pumpe Maschine (siehe Tabelle der Materialien), die bietet Hochpräzisions Geschwindigkeit und steuert die reibungslose Lieferung des Stroms.- Klares Vinyl Schlauch stecken Sie 26 X 1/2 Zoll (0,45 x 12 mm) Spritze als Lösung Injektor.
- Bereiten Sie 100 mL 99,5 % Aceton-Lösung in ein Becherglas Glas als Koagulation Bad verwendet werden.
- Laufen Sie die peristaltischen Pumpe Maschine, bei 21 u/min (3,25 mL/min) und lassen Sie die Gelatinelösung stehen für mehrere Sekunden in Aceton-Lösung vor dem einrollen.
- Nehmen Sie die Gelatine-Fasern aus der Aceton-Lösung und Tauchen sie in 2,5 % (w/V) Polycaprolactons/Dichlormethan (PCL/DCM) Lösung mit 01:20 (w/w).
- Lassen Sie die Gelatine, die Fasern in der PCL/DCM Lösung trocken unter der Haube bei Raumtemperatur über Nacht.
- Rohr-Bildung
Hinweis: Abbildung 1Bzeigt eine schematische Darstellung der Methode.- Verwenden Sie einen peripheren Venenkatheter 24 X 3/4 Zoll (0,7 x 19 mm) als Rohr Schimmel.
- Laden Sie den Katheter in die Gelatine-Lösung und halten Sie ihn dort für 3 s.
- Laden Sie den Katheter in die Aceton-Lösung und 1 min warten.
- Laden Sie den Katheter wieder in die Gelatine-Lösung und halten Sie ihn dort für 3 s.
- Wiederholen Sie dieses alternative Verfahren 20 X.
- Nehmen Sie den Katheter aus der Aceton-Lösung und lassen Sie das geformte Rohr bei 5 min bei Raumtemperatur trocknen.
- Herausnehmen Sie sanft die Gelatine-Röhre aus der Katheter mit einer Gefäßklemme und übertragen Sie sorgfältig die Gelatine-Schlauch in ein Glas Pasteurpipette mit das Eintauchen von 2,5 % (w/V) PCL/DCM-Lösung.
- Lassen Sie die Pasteur Pipette enthält, die die Gelatine Rohr- und PCL/DCM-Lösung trocken unter der Haube bei Raumtemperatur Übernachtung.
- Faser-Bildung
2. Morphologie der Gelatine-Röhre
- Montieren Sie das Stück getrocknete Gelatine Schlauch an eine Kohlenstoff-Stub.
- Legen Sie die Probe in die Ionen-Sputter Coater Maschine (siehe Tabelle der Materialien) und Mantel die Probe mit Gold für 60 s; dann beobachten seiner Morphologie von Rasterelektronenmikroskopie (siehe Tabelle der Materialien).
3. Kultur von menschlichen Fettgewebe Stammzellen
- Platzieren Sie das Fettgewebe (gewonnen aus mündlichen Fettgewebe durch klinische Chirurgie) in eine Petrischale mit 10 mL Transferlösung bestehend aus 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,1 % Glukose.
- Schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke (weniger als 1 mm2) mit einer Skalpellklinge.
- Übertragen Sie das Gewebe in eine 15 mL Kunststoffrohr und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min.
- Den Überstand zu entfernen und das Sediment in ein Kunststoffrohr mit 10 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM, bestehend aus 4 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat und 15 mg/L Phenol rot) mit 0,1 % Kollagenase bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre inkubieren 95 % Luft und 5 % CO2, enthält für 1 Tag.
- Das Kunststoffrohr 500 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand sorgfältig entsorgen (das Sediment nicht berühren), und dann das Sediment sanft durch Zugabe von 10 mL DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) auszusetzen und 1 Tag bei 37 ° C stehen lassen , in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2.
- Das Kunststoffrohr 500 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand vorsichtig zu verwerfen; Fügen Sie 1 mL der Stammzell-Medium (bestehend aus Keratinozyten serumfreien Medium (K-SFM), 5 % der FBS, N-Acetyl-L-Cystein, Ascorbinsäure-2-Phosphat, Streptomycin und Amphotericin) auszusetzen, das Sediment, übertragen Sie sie in ein T25-Kultur-Fläschchen mit 4 mL Zelle Medium stammen, und 3 Tage bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2stehen lassen.
- Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und inkubieren Sie es bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2 für 3,5 min, um die Zellen von der Unterseite des Kolbens Kultur zu lösen.
- Fügen Sie 1 mL der FBS, auszusetzen Sie, die Mischung und auf einem Microcentrifuge Schlauch übertragen.
- Zentrifugieren Sie die Federung bei 500 X g für 3,5 min, auszusetzen Sie das Sediment mit 1 mL der Stammzell-Medium und in der Kultur-Flasche mit 5 mL Medium Stammzellen übertragen; dann halten Sie es bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2.
- Pflegen Sie die Subkultur durch Ändern der Stammzell-Medium alle 3 Tage.
(4) die Kultivierung von Zellen mit der Gelatine-U-Bahn
- Sterilisieren Sie die Gelatine-Röhre mit UV-Licht für 2 h; dann tauchen sie in 75 % (V/V) Ethanol und waschen Sie es 2 X mit Stammzell-Medium, das restliche Ethanol zu entfernen.
-
Sammeln Sie die menschlichen Fettgewebe Stammzellen (hASCs) aus der Kultur-Flasche.
- Entfernen Sie das Medium aus der Kultur-Flasche.
- Fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin-EDTA und Inkubation bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2 3,5 min, hASCs von der Unterseite des Kolbens Kultur zu lösen.
- Fügen Sie 1 mL der FBS, auszusetzen Sie, die Mischung und auf einem Microcentrifuge Schlauch übertragen.
- Zentrifugieren Sie die Microcentrifuge Schlauch 500 X g für 3,5 min; dann verwerfen des Überstands vorsichtig, und unterbrechen das Sediment mit 1 mL der Stammzell-Medium.
- Legen Sie die Gelatine-Röhre in eine 6-Well-Platte mit 3 mL Stammzell-Medium und Samen Sie 4 x 104 der hASCs am Rohr; inkubieren sie für 2 Wochen bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2.
- Ändern der Stammzell-Medium alle 3 Tage um genug Nahrung für das Zellwachstum zu bieten.
(5) Immunocytochemistry
- Die Stammzell-Medium zu entfernen und den Brunnen mit PBS waschen.
- Befestigen Sie den Schlauch mit Zellen mit 0,1 % Essigsäure glacial für 30 min bei Raumtemperatur.
- Die gut 2 X waschen mit PBS.
- Fügen Sie ein Tensid (NP-40, 0,05 %) und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie der gut 3 X mit PBS.
- Fügen Sie 2 % normalem Ziegenserum und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.
- Dekantieren Sie die Lösung zu, fügen Sie Primärantikörper nestin (neurale Vorläuferzellen Zellmarkierung hinzu) und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
- Waschen Sie der gut 3 X mit PBS.
- Fügen Sie Sekundärantikörper Esel anti-mouse-Fluorescein erfolgt (FITC) und halten Sie die Probe in der Dunkelheit für 2 h.
- Waschen Sie der gut 3 X mit PBS.
- Fügen Sie 1 mL der Hoechst 33342 zu färben die Kerne und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie den Brunnen sanft und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten.
(6) in Vivo Biokompatibilität Test
Hinweis: Ratten mit einem Gewicht zwischen 201-225 g wurden unter Verwendung dieses Protokolls erfolgreich getestet.
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Anästhesie
- Induzieren und Anästhesie zu erhalten; vorzugsweise ein Ratte (8 Wochen alten Sprague-Dawley Ratten, weiblich) durch eine intramuskuläre Injektion von Tiletamin und Zolazepam zu betäuben (25 mg / kg + 25 mg / kg, beziehungsweise) und Xylazin (5 mg/kg). Führen Sie einen Schmerz Stimulation Test durch Drücken der Ratte in den Fingern, die Anesthetization zu bestätigen.
-
Sterilisation von der Operationsstelle
- Rasieren Sie und reinigen Sie die Haut der Ratte in den Trapezius Bereich (über der Rückseite des Halses) und wischen Sie es mit Povidon-Jod-Lotion zur Vorbereitung des aseptischen Zustand der Haut (100 mg/mL).
- Decken Sie die Ratte mit sterilen OP-Tüchern, bakterielle Übertragung und nachträgliche Kontamination an der Operationsstelle zu reduzieren.
-
Implantation von Gelatine-Rohr
- Schneiden Sie vorsichtig die Haut der Ratte in den Trapezius Bereich mit einer chirurgischen Schere.
- Erstellen Sie eine Wunde von 2 cm und legen Sie die Gelatine-Röhre direkt auf die Schicht zwischen der Faszie und der Muskel.
-
Postimplantation Chirurgie
- Schließen Sie die Wunde mit Nylon-Naht und wischen Sie es mit Povidon-Jod-Lösung (100 mg/mL).
- Induzieren Sie die Ratte über eine intramuskuläre Injektion von Ketoprofen (2,5 mg/kg) und Cefazolin (15 mg/kg).
- Halten Sie die Ratte unter aseptischen Bedingungen für 7 Tage.
-
Euthanasie
- Ratte ist über CO2 Erstickung nach AVMA Richtlinien für Euthanasie eingeschläfert. Bestätigen Sie den Tod der Ratte durch Zehe und Tail Prise, gefolgt von Brust zu berühren, um den Herzschlag zu gewährleisten.
- Schneiden Sie die Ratte sanft mit einer Skalpellklinge, entfernen des implantierten Gewebes und fotografieren für die Beobachtung.
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Representative Results
In dieser Studie haben wir erfolgreich die Gelatine in Fasern (Abb. 2A) und Rohre (Abbildung 2B, C) durch das benutzerfreundliche nass Spinnerei-Konzept entwickelt. Diese Gelatine-basierte Materialien können als jede medizinische Instrument, je nach ihrer Form genutzt werden. Wenn man bedenkt, dass die funktionale Oberfläche und Rahmen solcher Materialien besser geeignet für die Geweberegeneration, untersuchten wir die Biokompatibilität der Gelatine Rohr durch in-vitro- und in-vivo-Tests durchführen.
Um einen Überblick über die Gelatine-Rohr zu erhalten, führten wir zunächst morphologische Beobachtungen mittels Rasterelektronenmikroskopie (Abbildung 3). Die Ergebnisse zeigten, dass die Oberfläche des Rohres Gelatine nicht sehr glatt war(Abbildung 3),seinen Innendurchmesser war mehr als 200 µm (Abb. 3B), und seine Stärke war ca. 20 µm (Abb. 3C).
Dann wurde Immunocytochemistry durchgeführt, um die Biokompatibilität der Gelatine Röhre in-vitro-(Abbildung 4) zu untersuchen. Zunächst die Gelatine-Röhre wurde mit menschlichen Fettgewebe Stammzellen für 2 Wochen inkubiert und war voller Flecken mit nestin als neuronale Zelle Marker (Abb. 4A). Unter dem Fluoreszenzmikroskop zeigte die Färbung der positiven nestin Färbung Marker (grüne Farbe) zusammen mit einer Reihe von erkannten Zellkerne (blau), die vorgeschlagen, dass die Zellen könnte eindringen und gut auf die Gelatine-Röhre haften und differenzieren neurale Vorläuferzellen (Abbildung 4B). Darüber hinaus zeigte der in-vivo Biokompatibilität Test der Gelatine-Röhre analog Ergebnisse. Die Gelatine-Röhre wurde in der Faszie Schicht in eine Ratte in den Trapezius Bereich für 7 Tage eingefügt. Das Ergebnis zeigt, dass die Implantation der Gelatine-Röhre in die Faszie Schicht angegeben, seine Sicherheit und gute Biokompatibilität, zeigte keine Anzeichen von Rötung, Schwellung oder andere Entzündungssymptome des lokalen Gewebes und von umgeben war gut ausgebaute Bindegewebe (Abbildung 5A, B).
Abbildung 1 : Regelung der nassen Spinnen Setup. (A) Gelatine Fasern. (B) Gelatine tube. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Hell sehen Sie Bilder von Gelatine-basierte Material durch die nasse Methode Spinnen erhalten. (A) Gelatine Fasern. (B) Gelatine tube. (C) Gelatine tube in PBS-Lösung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Morphologie der Gelatine-Röhre, beobachtet von Rasterelektronenmikroskopie. (A) A oberflächliche Blick auf die Oberfläche des Rohres Gelatine (Maßstabsleiste = 50 µm). (B) schiefe Ebene Ansicht (Maßstabsleiste = 200 µm). (C) vertikale Ansicht (Maßstabsleiste = 25 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Beobachtung der menschlichen Fettgewebe Stammzellen (hASC) Wachstum auf Gelatine Tube. (A) Bright View-Bild der Gelatine Rohr-hASCs. (B) unter dem Fluoreszenzmikroskop, die Färbung zeigte die positive nestin Färbung Markierung zusammen mit einer Reihe von Kernen befleckt mit Hoechst 33342.The Gelatine Rohr zur Verfügung gestellt eines optimalen Umfeld für hASCs einhalten und wachsen im Inneren des Rohres (Maßstabsleiste = 200 µm; Blau = Kerne; Grün = nestin). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: In-vivo Biokompatibilität Test der Gelatine Röhre. (A) die Implantation der Gelatine-Röhre in die Faszie Schicht. (B) Beobachtung der lokalen Umwelt nach 7 Tagen mit der Gelatine-Röhre (rotes Rechteckbereich) implantiert. Keine Rötung, Schwellung oder andere Entzündungssymptome wurden beobachtet, und das Rohr ist 7 Tage nach der Implantation durch ausgeprägtes Bindegewebe umgeben. Dies ist bezeichnend für eine ausgezeichnete Biokompatibilität der Gelatine-Röhre mit der lokalen Umgebung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir präsentiert die Entwicklung von Gelatine-basierten Biomaterialien mit einem einfachen nassen Drehtechnik, die in der Studie von natürlichen Polymeren für die Geweberegeneration angewendet werden können. Diese Arbeit zeigte die Möglichkeit der Herstellung von Gelatine als eine gute Proteinquelle ohne Zusatz von anderen Quellen, mit dem Ziel, die Eigenschaften der Gelatine selbst optimieren. Die Entwicklung der Gelatine-basierten Biomaterialien wurde vollständig in Raumtemperatur (22-26 ° C) durchgeführt. Eine sanfte Lösung Vorbereitung ist ein wichtiger Schritt im Rahmen des Protokolls wie Aufrechterhaltung eine exakte Lösungskonzentration und rühren die Lösung reibungslos um eventuell Luftblasen zu vermeiden. Luftblasen in der Lösung wird vor allem beim Laden in die Spritze Form von Gelatine in die Gerinnung Medium beeinflusst.
Gelatine-basierten Biomaterialien wurden durch den Phasenübergang von der Gelatine-Lösung in einem geeigneten Koagulation Medium erhalten, die bewirkt, dass die zugeführten die Polymermoleküle und Ausscheidungen der Gelatine-Lösung in einem festen Polymers Phase11. Durch den Einsatz dieses Grundkonzept der nassen Methode dreht, haben wir in Rohr Form um die Funktionalität der Oberfläche zu erhöhen und um die Funktionen des menschlichen Gewebes durch den Spritzgießprozess zu imitieren die Form der Gelatine verwendet. In diesem Fall ausreichend Zeit zu laden, zu halten, und wiederholen Sie die Schritte sind notwendig, um eine genaue Rohr Form aufzubauen. In diesem Protokoll die Homogenität der Röhrenform während des Prozesses nicht kontrollierbar, wenn man bedenkt das asynchron von der Phase des Übergangs von unten auf den neuesten Teil des Rohres. Darüber hinaus sind die erhaltenen und Sterilisation Methoden für dieses Material wegen seiner Eiweißgehaltes beschränkt.
Von in-vitro- und in-vivo-Tests untersucht, die aktuellen Ergebnisse gezeigt, dass die Gelatine-Rohre mit diesem Protokoll erstellt weisen eine ausgezeichnete Biokompatibilität haben großen potenziellen Anwendbarkeit im Tissue Engineering. Der Innendurchmesser der Gelatine Röhren dieser Studie war mehr als 200 µm (Abb. 3B), wodurch die Zellen durchlaufen und inneren Oberflächen der Rohre16leicht einhalten. Darüber hinaus bietet die Dicke und leicht asperous Oberfläche des Rohres eine richtige Vorlage für Zellhaftung (Bild 3A, C). Konsequent, Immunocytochemistry ergab, dass die Zellen eingedrungen und, die Gelatine Rohr-besonders die neuronale eingehalten Stammzellen, wie durch die positive Färbung der neuronalen Zellen mit der Markierung nestin (Abbildung 4B ). Da die nestin Marker im Bereich der Kegel Wachstum während der Ausbaustufen Axon gefunden wurde, zeigt die positive Färbung von nestin Kegel Wachstum17. Letztlich kann diese positive Gelatine-hASCs-Kombination bei der Behandlung des Nervensystems Regenerierung implementiert werden. Das Rückenmark besteht aus Gruppen von Neuronen Axone und bündeln von Nervenfasern entlang der Wirbelsäule Wirbel. So kann die Gelatine-Rohr nicht nur bieten entsprechende Füllmaterial Lücke sondern auch Reiseführer Nervenfaser Wachstums und der Regeneration durch die Röhre. Darüber hinaus beobachtet die große Biokompatibilität durch die Implantation einer Gelatine-Röhre in der Faszie Schicht hat nicht nachgewiesen, schädlich und Entzündung Auswirkungen auf das lokale Gewebe und das Rohr war umgeben von gut ausgebauten Bindegewebe (Abbildung 5 A, B).
Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein einfaches und nützliches Protokoll für den Bau von Gelatine-basierten Biomaterialien mit ausgezeichnete Biokompatibilität und Zelle Umgebung, die Aussicht auf Gewebe, technische Anwendungen, wie z. B. in nervös einsetzbar System Regeneration, Blutgefäß-Ersatz, Harnwege Rekonstruktion und der Wiederaufbau der Orgelteile. Dieses Protokoll kann durch Gewebe Ingenieure implementiert werden, die derzeit korrelative natürliche Polymeren ohne synthetische Polymer entwickeln. Das Protokoll kann leicht erweitert und kann verwendet werden, um das Design von spezifischen Biomaterialien anpassen. In Zukunft kann dieses Protokoll, Protein-basierten Biomaterialien auf einer Massenskala, damit zur Geweberegeneration realisieren zu produzieren angepasst werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch das Ministerium der Nationalverteidigung (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; MAB-107-065), das Ministerium für Wissenschaft und Technologie (die meisten 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, die National Defense Medical Center, Taiwan (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041), Cheng-Hsin General Hospital und National Defense Medical Center Zusammenarbeit (CH-NDMC-107-8).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | - |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | - |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | - |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | - |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | - |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | - |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | - |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
References
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