Summary
כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.
Abstract
נוכחות, היעדרות, או רמות של חלבונים סינפטיים מסוימים יכול להשפיע באופן חמור הסינאפסית. בנוסף שחקרתי את הפונקציה של חלבון, זה חיוני גם לקבוע תפוצתו. כאן, אנו מתארים נוהל העסקת immunofluorescence קונפוקלית, מבוססת מחשב ניתוח כדי לקבוע את ההתפלגות של החלבון סינפטית Mover (המכונה גם TPRGL או SVAP30). אנו משווים את חלוקת Mover לזה של synaptophysin חלבון שלפוחית סינפטית, ובכך לקבוע את חלוקת Mover בצורה כמותית יחסית השפע הסינפטיות. ראוי לציין, ניתן ליישום שיטה זו פוטנציאל כדי לאפשר השוואה של ההתפלגות של חלבונים באמצעות נוגדנים שונים או מיקרוסקופ או דרך מחקרים שונים. השיטה שלנו עוקף ההשתנות הטבועה של immunofluorescent stainings נכנע יחס מאשר רמות קרינה פלואורסצנטית מוחלטת. בנוסף, השיטה נתאר מאפשר לנתח את ההתפלגות של חלבון ברמות שונות: מן כל המוח פרוסות לאזורים במוח כדי לאזורי משנה שונים באזור מוח אחד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס או חושית cortices. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות המשויך הסינפטיות. בשיטה זו, אנו מראים כי Mover heterogeneously מפוזרים על-פני אזורים במוח, עם רמות גבוהות של pallidum הגחון, גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית ו האמיגדלה, וגם בתוך אזורים במוח יחיד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס.
Introduction
התקשורת בין הנוירונים קורה באתרי קשר מיוחד שנקרא הסינפסות. הסינפסות להכיל מספר עצום של חלבונים שונים שננהל הסינאפסית. חלק אלה חלבונים להראות התפלגות הטרוגנית לאורך מערכת העצבים, אינם נוכחים בכל סינפסה1. דוגמה אחת על חלבון כזה היא Munc13, שבה הוא מעורב בתהליך לקרקע של הסינפטיות. ישנם איזופורמים שונים של Munc13, אשר heterogeneously מופצים ברחבי המוח2, נוכחות או היעדרות של איזופורמים ספציפי יכול להשפיע לטווח קצר פלסטיות סינפטית, שלפוחית סינפטית dynamics3, 4 , 5. לפיכך, יש חשיבות חיונית כדי להיות מסוגל לזהות הנוכחות של חלבונים סינפטיים שונים על פני אזורים במוח.
השיטות של בחירה על כימות של חלבונים סינפטיים - כה - הן ספקטרומטר מסה המערבי סופג, במקום אימונוהיסטוכימיה6,7,8,9. במקרים מסוימים, מספר שיטות משמשות משלימים אחד את השני כדי להעריך את הכמות וגם הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים (קרי, וילהלם. et al. 10). שיטת נתאר כאן מאפשרת התאמה לשפות אחרות, כימות של חלבונים עניין ללא צורך באמצעות כל שיטה ביוכימית, פשוט העסקת immunofluorescent stainings. יתרון נוסף כאן הוא כימות יכול להיעשות על אזורים הרבה יותר קטן, לכן, ספציפיות יותר, מאשר אלה מושגת על ידי שיטות אחרות. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי חלבון התייחסות אמין יש צורך להעריך את ההתפלגות של החלבון עניין.
צביעת פלורסנט מאת אימונוהיסטוכימיה מאפשר לנו לזהות באופן שגרתי הלוקליזציה של חלבונים על פני אזורים במוח, כמו גם בתוך תאים עצביים שונים. כדי לזהות את מדורים שונים, משמשות סמני ספציפיים. בדרך כלל, נוגדנים נגד סינפסין ו synaptophysin11 ניתן לתייג הסינפטיות, בעוד נוגדנים נגד בסון תווית האזור הפעיל של מסוף presynaptic12. Vesicular מובילים, כגון שנאים גלוטמט vesicular (vGluT) או גאבא vesicular טרנספורטר (vGAT), משמשים להוספת תווית סינאפסות13 ו מעכבות14 מסופי presynaptic, בהתאמה. בצד postsynaptic, נוגדנים נגד החלבון הומר יכול להיות מועסק כדי לסמן מסופי postsynaptic ולאחר נוגדנים נגד צפיפות postsynaptic חלבון 95 (PSD95)15,16,17 או gephyrin18 , 19 , 20 יכול תווית מסופי postsynaptic סינאפסות או מעכבות, בהתאמה. באמצעות נוגדנים נגד חלבון של עניין סמנים כגון אלה שתוארו לעיל, ניתן לקבוע הלוקליזציה של חלבון כזה. מחקרים רבים עד היום לעשות את זה באופן איכותי21 עם זאת, כדי לקבוע באופן אמין ההתפלגות דיפרנציאלית של חלבון ספציפי סינפטית, אחד חייב לא רק לקבוע נוכחותו או היעדרות אלא גם הריכוז היחסי שלו. את הטרוגניות בגדלים וצפיפות של הסינפסות הופך חשוב להקים יחס בין דה מרקר סינפטית החלבון עניין. אחרת, סינפסה-עשיר אזורים כגון שכבות שאינן פירמידה של ההיפוקמפוס, השכבה המולקולרית של הצרבלום יראה צפיפות גבוהה של חלבונים סינפטיים, רק בשל צפיפות גבוהה יותר של הסינפסות אך לא בשל נוכחות חזקה של חלבון זה כל סינפסה (למשל, Wallrafen, Dresbach1). מצד שני, חלבונים ב- סומא עצביים (למשל, TGN3822) בדרך כלל יראה נוכחות חזקה שכבת תאים כפירמידה בהיפוקמפוס או שכבת תאים בהיפוקמפוס או אסטרוציטומה גרגר בשל הריכוז הגבוה של גופי תאים עצביים באזורים אלו. לכן, התפלגות זו אי-הומוגניות של מבנים, במקרה זה synapses, יכול להוביל שערוך שווא של ההתפלגות של החלבון עניין עצמו. יתר על כן, יש השתנות מהותי צביעת עוצמות מדגמים ב- immunohistochemical stainings. הפרוטוקול המתואר כאן לוקח זאת בחשבון ומונעת הטיות כזה, כמו גם אזהרות אחרים הנובעים משימוש בשיטות immunohistochemical.
האחרונים שלנו לומדים, אנחנו השתמשו בשיטה זו כדי לתאר את הביטוי דיפרנציאלית של Mover (הנקרא גם TPRGL23 או SVAP3024) על פני אזורים שונים במוח116. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות סינפטית זה ניתן למצוא האגודה כדי הסינפטיות ומשפיע על2726,25,שחרור נוירוטרנסמיטר. לנו יש הקשורים לביטוי Mover שפע הסינפטיות, על ידי צביעת עבור synaptophysin כסמן הפניה שלפוחית סינפטית. מצאנו רמות גבוהות של Mover בפרט גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית pallidum על הגחון, האמיגדלה. בתוך ההיפוקמפוס, מצאנו בהתפלגות הטרוגנית של Mover, עם רמות גבוהות הרבדים הקשורים למחשוב אינטרה-בהיפוקמפוס, רמות נמוכות בשכבות הקלט והפלט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אינו כרוך בניסויים בבעלי חיים. בניסויים המערבים המתות חסד של בעלי החיים כדי להשיג דגימות המוח אושרו על ידי רשויות מקומיות להגנת בעלי חיים (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin גטינגן) תחת מספר אישור T 10/30.
הערה: עבור פרוטוקול זה, 3 עכברים C57BL/6 מבוגרים זכר שימשו.
1. הכנת הדוגמא
- להכין מקבע מאגר פוספט 0.1 M (PB; ראה טבלה 1).
- לתקן את החיה על-ידי transcardial זלוף כפי שמתואר Gage. et al. 28. קודם לשטוף את הדם עם 0.9% NaCl-פתרון, אז perfuse עם 30 מ של 4% paraformaldehyde (PFA).
- לפתוח את הגולגולת עם מספריים ולבודד בזהירות בעזרת כפית עם קצוות קהים כדי למנוע נזק לרקמת המוח.
- מלא צינור תגובה 50 מ עם מקבע, postfix המוח ב- 4% מחברים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- הסר את מקבע, לשטוף את המוח ב- 50 מ של 0.1 M PB-מטרף למשך 30 דקות.
- לאחר הרחצה, דגירה המוח בשפופרת תגובה 50 מ ב- 30% סוכרוז ב PB 0.1 M 48 שעות או עד שהיא שוקעת בצינור ב 4 ° C עבור cryoprotection.
- לקצץ את המוח cryoprotected עם סכין חדה, מניחים אותה cryomold, תטביע אותו עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם. להימנע בועות. אוריינט המוח, להקפיא את cryomold במקפיא-80 ° C.
- הר הרקמה קפוא על חלוקתה. Equilibrate את הרקמה כדי הטמפרטורה cryomicrotome למשך לפחות 15 דקות לפני חלוקתה.
- בסעיף המוח 25 מיקרומטר הילתית פרוסות עבות. לגעת OCT בזהירות עם קרס זכוכית בלי לגעת על רקמת המוח. לאסוף 3 סמוך פרוסות לכל באר היטב צלחת 24 ואחסן אותם ב- 0.1 M PB ב 4 ° C עד מכתים.
הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן עד שבועיים. עוד פעמים אחסון ניתן לשבש מאיכות רקמות, ובכך להשפיע על תוצאות הניסוי.
2. immunofluorescence
- להכין פתרונות כולל מאגר חסימה, מאגר נוגדן, שטיפת מאגר 1, ומאגר כביסה 2 (ראה טבלה 1).
- לשטוף פרוסות פעם אחת עם חמאת בוטנים כדי להסיר עודפי OCT.
- הסר את הפתרון עם פיפטה פלסטיק ללא מכניסה את פרוסות המוח. להוסיף 250 µL של חמאת בוטנים טריים עם פיפטה µL 1000.
התראה: פרוסות צריך לא יתייבש, אז להסיר ולהוסיף נוזלים טוב מאת טוב.
- הסר את הפתרון עם פיפטה פלסטיק ללא מכניסה את פרוסות המוח. להוסיף 250 µL של חמאת בוטנים טריים עם פיפטה µL 1000.
- להסיר את חמאת בוטנים עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 מאגר חסימה לכל באר עם פיפטה 1000 µL. תקופת דגירה של 3 שעות בטמפרטורת החדר (RT) על ניעור.
- במהלך זמן הדגירה, לדלל הנוגדנים העיקרית במאגר נוגדן בשפופרת התגובה. השתמש מאגר נוגדן µL 250 לכל טוב ולהוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים (ראה טבלה 2) מאת pipetting זה ישירות לתוך הפתרון באמצעות פיפטה 2 µL. מערבבים את הפתרון על-ידי pipetting בעדינות לאורך מספר פעמים. מערבולת זמן קצר לאחר מכן כדי להבטיח לערבב.
הערה: כדי לקבוע את הרקע פלורסצנטיות, stainings יש גם לבצעו ללא הוספת נוגדן ראשוני. בשביל זה, דגירה הפרוסה ב נוגדן פתרון ללא נוגדנים העיקרי לפי הפרוטוקול. - לאחר זמן הדגירה, להסיר את המאגר חסימה עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של נוגדן פתרון המכיל נוגדנים העיקרי לכל טוב. דגירה פרוסות עם נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C-מטרף.
- ביום למחרת, לשטוף את הפרוסות עם שטיפה מאגר 1 3 x 10 דקות ב RT-מטרף.
- להסיר את המדיום עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 300 µL לרחוץ את מאגר 1 לכל טוב. תקופת דגירה-RT של 10 דקות חוזרת 3 פעמים.
- במהלך השלבים כביסה, לדלל הנוגדנים משני מצמידים fluorophore במאגר נוגדן בשפופרת התגובה. השתמש מאגר נוגדן µL 250 לכל טוב ולהוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים (ראה טבלה 2) מאת pipetting זה ישירות לתוך הפתרון באמצעות פיפטה 2 µL. מערבבים את הפתרון על-ידי pipetting בעדינות לאורך מספר פעמים. מערבולת זמן קצר לאחר מכן כדי להבטיח לערבב.
התראה: בגלל הנוגדנים הם רגישים לאור, כל הצעדים מנקודה זו ואילך יש לבצע בחושך. - אחרי הצעדים כביסה, הסר הכביסה מאגר עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של נוגדן פתרון המכיל נוגדנים משניים לכל טוב. דגירה את הפרוסות עם נוגדנים משניים עבור 90 דקות ב RT בחושך.
- לשטוף את הפרוסות עם שטיפה מאגר 2 3 x 10 דקות ב- RT.
- במהלך השלבים כביסה, לדלל 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ב PB 0.1 M בריכוז של 1:2000.
- להסיר את המאגר כביסה 2 עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של דאפי פתרון לכל טוב. תקופת דגירה של 5 דקות ב RT-ניעור.
- להסיר את הפתרון דאפי עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 500 µL של 0.1 M PB לכל באר עם פיפטה 1000 µL.
- הר פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ.
- בשקופית מיקרוסקופ תחת סטריאוסקופ המקום. עם מברשת בסדר, להוסיף 3 טיפות נפרדים של 0.1 M PB אותן לשקופית. מניחים פרוסה אחת לכל טיפה על גבי השקופית מיקרוסקופ.
- השתמש בכלי מברשת בסדר כדי לרדד, אוריינט את הפרוסות על השקופית מיקרוסקופ.
- כאשר כל הפרוסות ממוקמות כהלכה, להסיר את עודף חמאת בוטנים עם טישו ויבש השקופית בקפידה.
זהירות: הימנעו ייבוש את פרוסות המוח לגמרי. - הוסף µL 80 הטבעה בינוני אותן לשקופית. בזהירות הנמך את coverslip על גבי השקופית, ובכך להטביע את פרוסות המוח.
- להשאיר את השקופיות להתייבש בשכונה fume במשך 1-2 h (לכסות אותם כדי למנוע חשיפה קלה) ולאחסן אותם בקופסה שקופיות מיקרוסקופ ב 4 º C.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
3. הדמיה
- לאחר המדיום ההטבעה לחלוטין מוקשה, במקום השקופית מיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
הערה: מיקרוסקופ Epifluorescence בשילוב עם תוכנת deconvolution אמור להניב איכות תמונה דומה. - התאם את הגדרות לייזר על-ידי הגדלת או הקטנת עוצמת לייזר עבור כל ערוץ כך כמה פיקסלים הם חשיפת כדי להבטיח הפצה המרבי של ערכי אפור.
- רוכשים את רקמות וירטואלי של הפרוסה כל המוח עבור הערוצים השונים.
- בתוכנת הדמיה (ראה טבלה של חומרים), בחרו באפשרות ' אריחים ', ניסחו באופן ידני על הפרוסה המוח בעזרת הגדרת אזור אריח.
- להפיץ נקודות תמיכה ברחבי אזור אריח ולהתאים את המוקד על הנקודות התמיכה השונים על-ידי הקשת לוודא אריח אזורים/תפקידים.
- התאם את ההגדרות במצב רכישה בהתאם לגודל הרצוי הרזולוציה ואת הקובץ של התמונה שתיווצר ולהתחיל את הסריקה.
- עם סיום הסריקה, השתמש בפונקציה Stitching לעבד את הרקמה וירטואלי. לייצא את הקובץ. tif עם הפונקציה לייצא את התמונה.
4. המחשב המבוסס על ניתוח
- לטעון כל הערוצים יחיד עבור תמונה אחת לתוך פיג'י29 על ידי לחיצה על קובץ | פתוח.
- בעזרת הכלי בחירה ביד חופשית , ניסחו אחד בחצי הכדור דאפי-הערוץ. ליצירת מסיכה של הבחירה על ידי לחיצה עריכה | בחירה | יצירת מסיכת.
- לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד (Mover ו- synaptophysin) על ידי לחיצה נתח | מדד.
הערה: הקפד לבחור את הערוצים השונים כדי לקבוע את ערכי העוצמה של זריחה מתכוון לכל ערוץ. - העתק את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד לתוך גיליון אלקטרוני.
- לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע עבור הערוצים יחיד באזור עניין על ידי בהתוויית האזור גם בעזרת הכלי בחירה ביד חופשית . השתמש אטלס מוח של עכבר כהפניה.
- חזור על הצעדים 4.1-4.5 כל האונות ואת כל תחומי עניין.
הערה: לקבוע את הערכים עבור האונה כל בנפרד על מנת מאוחר יותר להשוות את הערכים באזור לעניין זה בחצי הכדור הצפוני (ראה שלב 5.2).
5. נתונים טיפול
- במקרה הרקע הוא גבוה (ראה דיון), ייתכן שיש צורך חיסור רקע. בשביל זה, לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע על הפרוסה ללא ראשי נוגדן כנגד החלבון הפניה (כאן: synaptophysin) החסר ערך זה מ כל הערכים שהתקבלו עבור אזורים במוח והאונות.
- מתי נקבע עוצמות קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד עבור כל חצי הכדור ואזור בכל עניין (ראו טבלה 3), לחשב את היחס שבין Mover כדי synaptophysin על-ידי חלוקת הערך עבור Mover לפי הערך עבור synaptophysin ( צהוב בטבלה3). בצע פעולה זו עבור כל חצי הכדור ואזור בכל עניין בנפרד.
- לחלק של היחס שהתקבל עבור אזור אחד של עניין על-ידי היחס שהתקבל עבור הכדור המתאים (כתום בטבלה3) כדי לקבוע את היחס של האזור בעל עניין הכדור.
- כדי לקבוע את השפע Mover היחסי, לתרגם את היחס שהתקבל ב- 5.2 באחוזים על-ידי קביעת שלו סטייה 1 (אדום בטבלה3). יחס של 1.25 ייתן לכן שפע Mover היחסי של 25% מעל הממוצע, יחס של 0.75 יניב שפע Mover היחסי של 25% מתחת לממוצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נציג מכתים דפוסים של סמנים שונים ניתן לראות באיור1. התבנית משתנה בהתאם להתפלגות של החלבון. דוגמאות של חמש רמות rostro-סימטרית מוצגים בעמודות (א)-(E). צביעת דאפי נציג מוצג בשורה הראשונה: דאפי לאנאפוליס ה-DNA של התא, ובכך גרעינים מוכתמים. התוצאה היא דפוס punctate. אזורים עם צפיפות גבוהה תא בהירים יותר אזורים עם צפיפות נמוכה התא. ניתן לראות דוגמא לכל חלבון heterogeneously מבוזרת בשורה השניה. מצביע התזוזה מכתים מגלה התפלגות דיפרנציאלית ברחבי המוח, באזורים חמה בהיר ופינות דימר. בשורה השלישית, מוצגת דוגמא אישית synaptophysin סמן הפניה מבוזרת יותר homogeneously. כיסוי של שני חלבונים (שורה רביעית) מציג את חלוקת Mover דיפרנציאלית (אדום) לעומת את סמן חלבון synaptophysin (ירוק).
איור 2 מציג כימות המתוארים בשלב 4 של הפרוטוקול. מוצגות ערכי העוצמה של זריחה רעה עבור הערוצים השונים על פני את ההמיספרות (Mover, איור 2A; synaptophysin, איור 2ב') ועל -פני את תחומי עניין (Mover, איור 2C; synaptophysin, איור 2D). כדי לקבוע את השפע Mover יחסית מספר הסינפטיות, נלקח יחס ערכי פלורסצנטיות Mover לערכים זריחה synaptophysin. אלה יחסי עבור תחומי עניין מוצגים באיור 2E, כבר מספקות אינדיקציה חלוקת Mover הטרוגנית, עם אזורים עם גבוה ונמוך Mover רמות ביחס הסינפטיות. בנוסף לפיצוי על ההשתנות טכני הטבועה, היחס באזור אחד של עניין (איור 2E) לעומת זאת על פני הכדור (לא מוצג) ותורגם באחוזים. זה מעניק שפע (איור 2F) יחסית Mover מודד כמה Mover קיים באזור אחד של ריבית יחסית את הממוצע.
כפי שהוזכר לעיל, אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא היכולת לקבוע את השפע של החלבון של עניין על-פני אזורים קטנים מאוד, אפילו לאזורי משנה ושכבות של תחומי עניין. דוגמה אחת של יישום זה מוצג באיור 3, שבו שפע Mover היחסי נקבע על הרבדים השונים תחומים של ההיפוקמפוס. כימות ברבדים שונים המוצגים באיור 3D, איור 3Fו- איור 3H מתייחס הרבדים שמוצג באיור 3C, איור 3Eו- איור 3G, עם הצבעים המתאימים. בתוך ההיפוקמפוס, Mover heterogeneously מופץ, עם רמות גבוהות Mover ביחס הסינפטיות בשכבות המשויך חישוב אינטרה-בהיפוקמפוס (קרי, השכבה פולימורף של הפיתול משוננת [די. ג'י], הרובד radiatum, מחזירת אור, oriens של Cornu Ammonis 3 [CA3], הרובד radiatum ו oriens של Cornu Ammonis 1 [CA1]), רמות נמוכות בשכבות הקלט והפלט (השכבה המולקולרית הפנימיים והחיצוניים של די. ג'י, הרבדים כפירמידה תא של CA3 ושל CA1, ו הרובד lacunosum-moleculare של CA1).
איור 1 : Immunofluorescence נציג תמונות של דאפי (בשורה הראשונה), Mover (שורה שנייה), synaptophysin (בשורה השלישית), שלהם כשכבת-על (שורה רביעית, מיצבנו synaptophysin אדום, בירוק) ברמות rostro-סימטרית 5 (A-E)- תחומי עניין לעריכה מוצללים באפור בשורה העליונה של לוחות. M1, קליפת מנוע העיקרית; הוועד האולימפי הבינלאומי, איים של Calleja; ACC, cingulate cortex הקדמי; סנו, גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית; VPa, הגחון pallidum; NuA, גרעין האקומבנס; CP, putamen המזונבת; S1, קליפת המגע העיקרית; Hc, ההיפוקמפוס; אני, האמיגדלה; מנהל, habenula המדיאלי; פג, גריי periaqueductal; SN, הסובסטנציה ניגרה; מע' ' מ, אזור הטגמנטום הגחוני; MLC, שכבה מולקולרית של הצרבלום; GLC, שכבה פרטנית של הצרבלום. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. איור זה השתנה בין Wallrafen ו Dresbach1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : כימות של ההתפלגות Mover על פני 5 רמות סימטרית-rostro. זאת אומרת פלורסצנטיות עוצמת האות Mover (A), האות synaptophysin (B) ברמות שונות. מתכוון פלורסצנטיות עוצמת האות Mover (C), האות synaptophysin (D)-16 אזורים במוח באופן ידני מוגדרים היטב. (E) יחסי של Mover, synaptophysin את המוח 16 תחומי עניין. כימות (F) של שפע Mover היחסי, השוואת יחס Mover/synaptophysin-האזור בהתאמה ליחס של הכדור המתאים. M1, קליפת מנוע העיקרית; הוועד האולימפי הבינלאומי, איים של Calleja; ACC, cingulate cortex הקדמי; סנו, גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית; VPa, הגחון pallidum; NuA, גרעין האקומבנס; CP, putamen המזונבת; S1, קליפת המגע העיקרית; Hc, ההיפוקמפוס; אני, האמיגדלה; מנהל, habenula המדיאלי; פג, גריי periaqueductal; SN, הסובסטנציה ניגרה; מע' ' מ, אזור הטגמנטום הגחוני; . MLC, שכבה מולקולרית של הצרבלום. נקודות שחורות מייצגים נקודות נתונים יחיד. ברים להציג זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). איור זה השתנה בין Wallrafen ו Dresbach1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : התפלגות mover בהיפוקמפוס העכבר. Stainings immunofluorescence פרוסות הילתית ההיפוקמפוס העכבר. סקירה של ההיפוקמפוס מציגים התבנית ביטוי Mover הטרוגנית (A) וגם את Synaptophysin המתאים מכתים (B). שלושה אזורים מעניינים (DG, איור 3C; CA3, איור 3E; CA1, איור 3G) מפורטים עם קווים מנוקדים לבנים. (D,F,H) כימות השוואת היחס בין הרבדים בהתאמה ליחס של הכדור המתאים. הצבעים מגרפים תואמות ההצללה המתאימים בחלוניות C, E, ו- G. הביטוי mover היא גבוהה ברמות המשויך חישוב אינטרה-בהיפוקמפוס (קרי, השכבה פולימורף של די. ג'י, הרובד radiatum, מחזירת אור, oriens של CA3, ואת הרובד radiatum ו- oriens של CA1), ונמוך הקלט העיקרי - ואת הפלט שכבות ( שכבה מולקולרית הפנימיים והחיצוניים של די. ג'י, הרבדים כפירמידה תא של CA3 ושל CA1, ולא את הרובד lacunosum-moleculare של CA1). OML, השכבה המולקולרית החיצונית; IML, השכבה המולקולרית הפנימית; GrL, שכבה פרטנית; PmL, פולימורף שכבה/hilus; אז, הרובד oriens; מרגל, הרובד pyramidale; מחש, שכבה מחזירת אור; SR, הרובד radiatum; הסים, הרובד lacunosum-moleculare. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. נקודות שחורות לייצג נתונים יחיד נקודות. ברים להראות את זאת אומרת ± ב- SEM. איור זה השתנה בין Wallrafen ו Dresbach1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: פתרונות שימוש בפרוטוקול זה.
טבלה 2: נוגדנים בשימוש בפרוטוקול זה.
טבלה 3: דוגמה נתונים טיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת כאן מטרות ב לכימות ההתפלגות של חלבון עניין יחסית השפע של חלבון מרקר עם התפלגות ידוע. Immunofluorescence מכתים יכול להראות השתנות גבוהה של צביעת עוצמות בין הפרוסות שונים. הגישה כימות המתוארים כאן עוקף את הבעיה על-ידי קביעת היחס של החלבון לעניין הממוצע על פני הכדור. לכן, עוצמות מכתימים שונים על פני פרוסות מבוטלות ומאפשרים לקבלת תיאור כמותי.
כמו עם כל פרוטוקול immunofluorescence, איכותי או כמותי, מספר גורמים יכולים להשפיע על ההצלחה, ובכך וחיסול הניתוח. לכן, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולם כדי השלבים הקריטיים של הפרוטוקול. ראשית, אובססיה תקין של הרקמות דרושה. הסובבים בדרך כלל יכולה להיות מושגת על ידי זלוף transcardial מוצלח. איכות זלוף ניתנת לאימות כמקורית על-ידי בדיקת הכבד זמן קצר לאחר לשטוף את הדם. מחוון הראשון עבור זלוף מוצלח הוא קרחת היער של הכבד ואת הגפיים28. הנוכחות של קרישי דם יכולים מצביעים על כך זלוף אולי היה איטי מדי צריכה להתבצע מהר יותר בפעם הבאה. חלבונים מסוימים דורשים פרוטוקולים קיבוע שונות, כמו קיבוע כימי עם כדורגלן יכול לגרום חסימה epitope30. במקרה זה, הקפאת קיבוע או קיבוע כימיים שונים, כגון, מתנול, להתייחס. שנית, לאחר חלוקתה, זה קריטי כדי להכתים את המוח פרוסות כמו מהר ככל האפשר, רצוי על אותו הדבר או המילה הבאה. אחסון ארוך ב PB יכול להוביל לזיהום חיידקי, תוך הוספת נאן3 אפשר למנוע את זה במידה מסוימת, איכות רקמת מתדרדר בדרך כלל עם הזמן אחסון. שלישית, במהלך ההליך מוכתמים, חשוב לבצע פעולות כביסה טוב-מאת-טוב כדי למנוע ייבוש הפרוסות. כאשר הפרוסות להתייבש, רקע זריחה ניתן להגדיל, ובכך לגרום דעה קדומה בניתוח. רביעית, לאחר היישום של הנוגדן המשני, זה חיוני לבצע את כל הפעולות הבאות בחושך. Fluorophores הם רגישים לאור, לאור החשיפה קשות יכולה לעוות את האות זריחה.
אופטימיזציה של התהליך מוכתמים, כולל הבחירה של הנוגדנים הולמת ראשיים ומשניים, ריכוז נוגדן אופטימלית ושעת תערוכות, הוא תנאי הכרחי על מנת להשיג את יחס אות לרעש הטובה ביותר וכן ביצוע אמין ניתוח כמותי immunofluorescence. נוגדנים על מדהימה רקמת מכונה כנ ל צריך להיות הבחירה המועדפת, גם אם לא תמיד זמין. תמיד הקפידו לבצע ניסויים בקרה נאותה כדי לא לכלול crosstalk בין נוגדנים שונים. כמות קרינה פלואורסצנטית רקע הנובעות autofluorescence ואיגוד לא ספציפי של הנוגדן משני יכול להיות מוערך על ידי הדמיה הפרוסות בו נוגדן ראשוני לא הוחל. . זה לא טריוויאלי להקים כמה גבוה עוצמות האות צריך להיות בהשוואה ברקע יש יחס אות לרעש מקובל. עם זאת, על סמך תצפיות אמפירי, המחברים הייתי מציע מכוון שיש אות לפחות קיפול כפול חזק יותר רקע על מנת לאמוד באופן מהימן את התפלגות חלבון. במקרה הרקע הוא גבוהה בתנאי בקרה (ללא הנוכחות של הנוגדן ראשי), זריחה רקע הממוצע צריך להיות מופחתים מן התמונות ניסוי.
היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא להפניה פנימית שלה: עוצמת immunofluorescence של החלבון היעד (קרי, Mover) באזור עניין מושווה סמן הפניה (קרי, synaptophysin) וכדי בעוצמה הכוללת של חלבונים אלה על-פני הכדור כולו. לפיכך, מהחישוב שאנו מבצעים, ניתן באופן חד משמעי להסיק כי השפע של החלבון היעד הוא x מקפלים גבוה/נמוך באזור מסוים של מעניינת יותר השפע של החלבון ההפניה ביחס להתפלגות של החלבונים על פני כל חצי הכדור ברמה זו ביחס Bregma31. דבר זה מאפשר השוואת תוצאות באמצעות נוגדנים שונים, מיקרוסקופים שונים, או אפילו על-פני מחקרים שונים. עקביות זו מדגמים שונים מגיע מן הטבע השוואתית של שיטה זו: השתנות מפצה על כך לוקח את היחס בין על ידי קרינה פלואורסצנטית באזור של הריבית לבין זה של הכדור. לכן, שוני בערכים מוחלטים הנובעים הבדלים טכניים בטלים. יתרון מרכזי נוסף של טכניקה זו היא העובדה כי תחומי עניין יכול להיות קטנה כפי שאתה רוצה להיות, מוגבל רק על-ידי הרזולוציה של המיקרוסקופ. לכימות רמות החלבון עם שיטות ביוכימיות, לדוגמה המערבי כתם או ספקטרומטר מסה6,7,8,9, דורש ניתוח של הרקמה לתוך האזור עניין. הקרע הזה קשה עבור אזורים של המוח, כגון קליפת המגע הראשית, וזה הופך כמעט בלתי אפשרי כאשר מכוון לאזורי משנה, כגון שכבות שונות של קליפת המוח או ההיפוקמפוס.
אזהרה של הגישה היא כי רמות שונות במוח ישירות לא יכול להיות אחד עם השני. ההמיספרות עם אזורים רבים עשירה בחלבון עניין יהיה ערך ממוצע שונה מאשר ההמיספרות עם רק כמה אזורים עשירים בחלבון. ערכים של 20% מעל הממוצע, לדוגמה, לכן ישקף כמות מוחלטת שונים של חלבון ברמה אחת ביחס Bregma לעומת אישה שנייה. יש לזכור גם כי שיטה זו אינה מאפשרת קביעת רמות החלבון מוחלטת, רק את השפע היחסי לעומת הסמן להפניה פנימית לבין הממוצע על פני הכדור.
בשיטה זו ניתן להתאים בקלות כדי לקבוע את ההתפלגות של החלבון עניין ביחס סמנים עבור תאים עצביים שונים, לא רק presynaptic אתרים. זה גם יכול להיות מותאם בקלות רקמות חוץ המוח ועם נוגדנים מתאימים - מערכות מודל אחרות מאשר עכברים32,33. בעוד השימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי הוא שיטת הבחירה של המחברים, שילוב של מיקרוסקופ epifluorescence ותוכנות deconvolution עליו תשואה באותה איכות נתונים, ובכך להרחיב את השימושיות של הפרוטוקול. בנוסף, stainings אותו יכול לשמש כדי לקבוע את התפלגות subcellular, לדוגמה עם סופר-רזולוציה מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים אירמגרד וייס לסיוע טכני מעולה. המחברים להכיר תמיכה על ידי הרמס Pofantis ו Andoniya Petkova. המחברים גם תודה מכון מדעי המוח האירופית השימוש של LSM800, סיוע טכני, במיוחד על ידי ד ר נילס Halbsgut. עבודה זו מומן על ידי גטינגן במרכז הרפואי אוניברסיטת. JSV מאשר תמיכה על ידי המרכז עבור ננו מיקרוסקופ ופיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CNMPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
