Summary
Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.
Abstract
La presenza, assenza o livelli di specifiche proteine sinaptiche possono influire gravemente trasmissione sinaptica. Oltre a chiarire la funzione di una proteina, è fondamentale per determinarne anche la distribuzione. Qui, descriviamo un protocollo che impiegano immunofluorescenza, microscopia confocale e l'analisi computerizzata per determinare la distribuzione della proteina sinaptica Mover (chiamato anche TPRGL o SVAP30). Mettiamo a confronto la distribuzione del motore a quello della sinaptofisina proteine delle vescicole sinaptiche, determinando la distribuzione del motore in maniera quantitativa rispetto l'abbondanza delle vescicole sinaptiche. In particolare, questo metodo potrebbe potenzialmente essere implementato per consentire il confronto tra la distribuzione delle proteine usando anticorpi differenti o microscopi o attraverso studi differenti. Il nostro metodo elude la variabilità inerente di immunofluorescente stainings cedendo un rapporto piuttosto che i livelli assoluti di fluorescenza. Inoltre, il metodo descriviamo consente al ricercatore di analizzare la distribuzione di una proteina su diversi livelli: dalle fette di cervello intero a regioni del cervello a subregions differenti nell'area di un cervello, come i diversi strati dell'ippocampo o sensoriali cortecce. Mover è una proteina di vertebrato-specifico che è associata con vescicole sinaptiche. Con questo metodo, dimostriamo che Mover è eterogeneo tra aree del cervello, con gli alti livelli nell'amigdala, i nuclei settali e pallidum ventrale e anche all'interno di aree cerebrali singole, ad esempio i diversi strati dell'ippocampo.
Introduction
Comunicazione tra neuroni avviene presso siti specializzati di contatto chiamati sinapsi. Sinapsi contengono una miriade di diverse proteine che orchestrano trasmissione sinaptica. Alcune di quelle proteine mostrano una distribuzione eterogenea in tutto il sistema nervoso e non sono presenti in ogni sinapsi1. Un esempio di una tal proteina è Munc13, che è coinvolto nel processo di adescamento delle vescicole sinaptiche. Esistono diverse isoforme di Munc13, che sono distribuite in modo eterogeneo in tutto il cervello2, e la presenza o l'assenza di specifiche isoforme possa influenzare la plasticità sinaptica a breve termine e dynamics delle vescicole sinaptiche3, 4 , 5. Pertanto, è di vitale importanza per essere in grado di identificare la presenza di diverse proteine sinaptiche tra aree del cervello.
I metodi di scelta per la quantificazione delle proteine sinaptiche - finora - sono di spettrometria di massa e Western blotting, piuttosto che immunohistochemistry6,7,8,9. In alcuni casi, vengono utilizzati diversi metodi per completarsi a vicenda per valutare sia la quantità e la localizzazione delle proteine specifiche (cioè, Wilhelm et al. 10). il metodo qui descritto consente per la localizzazione e la quantificazione delle proteine di interesse senza la necessità di utilizzare qualsiasi metodo di biochimica, semplicemente che impiegano gli stainings immunofluorescenti. Un altro vantaggio è che la quantificazione può essere fatto su aree molto più piccoli e, dunque, più specifico, rispetto a quelli realizzati con altri metodi. Tuttavia, uno deve prendere in considerazione che una proteina di riferimento affidabile è necessario per valutare la distribuzione della proteina di interesse.
Macchiatura fluorescente da immunohistochemistry permette di identificare sistematicamente la localizzazione delle proteine attraverso aree cerebrali, così come all'interno di diversi compartimenti neuronali. Per identificare i diversi compartimenti, vengono utilizzati gli indicatori specifici. In genere, anticorpi contro la sinapsina e lo synaptophysin11 possono essere usati per etichettare le vescicole sinaptiche, mentre gli anticorpi contro fagotto etichettare la zona attiva di un terminale presinaptico12. Trasportatori vescicolari, quali i trasportatori del glutammato vescicolare dei suini (vGluT) o il trasportatore vescicolare di GABA (vGAT), vengono utilizzati per etichettare eccitatorio13 e inibitorio14 terminali presinaptici, rispettivamente. Sul versante postsinaptico, anticorpi contro la proteina Homer possono essere impiegati per contrassegnare terminali postsinaptici e anticorpi contro densità postsinaptica proteina 95 (PSD95)15,16,17 o gephyrin18 , 19 , 20 può etichettare terminali postsinaptici eccitatori o inibitori, rispettivamente. Usando gli anticorpi contro una proteina di interesse e marcatori come quelle descritte sopra, si può determinare la localizzazione di tali proteine. Molti studi fino ad oggi hanno fatto questo in un modo qualitativo21. Tuttavia, per determinare in modo affidabile la distribuzione differenziale di una specifica proteina sinaptica, si deve non solo determinare la presenza o assenza, ma anche la concentrazione relativa. L'eterogeneità di dimensioni e densità delle sinapsi lo rende importante per stabilire un rapporto tra il marcatore sinaptico e la proteina di interesse. In caso contrario, sinapsi ricche regioni quali gli strati non-piramidali dell'ippocampo e strato molecolare del cervelletto mostrerà un'alta densità di proteine sinaptiche, solo a causa della maggiore densità delle sinapsi, ma non a causa di una forte presenza di quella proteina in ogni sinapsi (ad es., Wallrafen e Dresbach1). D'altra parte, proteine in soma neuronale (ad es., TGN3822) di solito mostrano forte presenza nella strato delle cellule piramidali hippocampal o strato delle cellule ippocampali o cerebellari del granello dovuta all'alta concentrazione di corpi delle cellule neuronali in quelle zone. Pertanto, questa distribuzione non omogenea delle strutture, in questo caso le sinapsi, può portare a una falsa stima della distribuzione della proteina di interesse stesso. Inoltre, vi è un'intrinseca variabilità nell'intensità di colorazione attraverso campioni in stainings immunohistochemical. Il protocollo descritto qui prende questo in considerazione ed evita tali pregiudizi, come pure altri avvertimenti che derivano da metodi immunohistochemical.
Nel nostro recente studio, abbiamo utilizzato questo metodo per descrivere l'espressione differenziale di Mover (chiamato anche TPRGL23 o SVAP3024) attraverso 16 di aree differenti del cervello1. Mover è una proteina sinaptica di vertebrato-specifico che può essere trovata in associazione a vescicole sinaptiche ed influenze neurotrasmettitore rilascio25,26,27. Abbiamo abbiamo riferito l'espressione Mover per l'abbondanza delle vescicole sinaptiche, macchiando per lo synaptophysin come un marcatore di riferimento delle vescicole sinaptiche. Abbiamo trovato alti livelli di Mover in particolare i nuclei settali, pallidum ventrale e l'amigdala. All'interno dell'ippocampo, abbiamo trovato una distribuzione eterogenea di Mover, con alti livelli negli strati connessi con calcolo intra-ippocampale e bassi livelli in livelli di ingresso e di uscita.
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Protocol
Questo protocollo non comporta esperimenti su animali vivi. Gli esperimenti che coinvolgono eutanasia degli animali per ottenere campioni del cervello sono stati approvati dalle autorità locali di protezione animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sotto il numero di omologazione T 10/30.
Nota: Per questo protocollo, sono stati utilizzati topi C57BL/6 3 maschio adulto.
1. preparazione del campione
- Preparare il fissativo e tampone fosfato 0,1 M (PB; si veda tabella 1).
- Difficoltà l'animale mediante perfusione perfusione come descritto in Gage et al. 28. in primo luogo lavare il sangue con 0,9% NaCl-soluzione, quindi irrorare con 30 mL di paraformaldeide al 4% (PFA).
- Aprire il cranio con le forbici e isolare accuratamente il cervello utilizzando un cucchiaio con spigoli arrotondati per evitare di danneggiare il tessuto.
- Riempire una provetta di reazione da 50 mL con fissativo e postfix il cervello nel 4% PFA a 4 ° C durante la notte.
- Rimuovere il fissativo e lavare il cervello in 50 mL di PB 0,1 M su un agitatore per 30 min.
- Dopo il lavaggio, incubare il cervello in un tubo di reazione da 50 mL in 30% di saccarosio in PB 0,1 M per 48 h o fino a quando non si affonda nel tubo a 4 ° C per crioprotezione.
- Tagliare il cervello di crioprotetti con una lama affilata, collocarlo in un cryomold e incorporarlo con temperatura di taglio ottimale (OCT) composto. Evitare le bolle. Orientare il cervello e congelare il cryomold nel congelatore-80 ° C.
- Montare il tessuto congelato per il sezionamento. Equilibrare il tessuto alla temperatura cryomicrotome per almeno 15 min prima di sezionamento.
- Sezione del cervello a 25 µm spessore fette coronali. Toccare il OCT attentamente con un gancio di vetro senza toccare il tessuto cerebrale. Raccogliere 3 fette adiacenti per pozzetto in un piatto ben 24 e archiviarli in PB 0,1 M a 4 ° C fino a colorazione.
Nota: Il protocollo può essere sospeso qui per fino a due settimane. Tempi di conservazione più lungo possono interferire con la qualità del tessuto e quindi influenzare il risultato dell'esperimento.
2. immunofluorescenza
- Preparare soluzioni tra cui il tampone bloccante, il buffer di anticorpo, lavaggio buffer 1 e tampone di lavaggio 2 (Vedi tabella 1).
- Sciacquare le fette una volta con PB per rimuovere l'eccesso OCT.
- Rimuovere la soluzione con una pipetta di plastica senza succhiare le fettine di cervello. Aggiungere 250 µ l di PB fresco con una pipetta di 1000 µ l.
Attenzione: Fette non devono asciugarsi, quindi rimuovere e aggiungere liquidi Pozzetto da altro.
- Rimuovere la soluzione con una pipetta di plastica senza succhiare le fettine di cervello. Aggiungere 250 µ l di PB fresco con una pipetta di 1000 µ l.
- Rimuovere il PB con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di tampone bloccante per pozzetto con una pipetta di 1000 µ l. Incubare per 3 ore a temperatura ambiente (TA) sull'agitatore.
- Durante il periodo di incubazione, diluire gli anticorpi primari nel buffer dell'anticorpo in un tubo di reazione. Utilizzare 250 µ l di tampone di anticorpo per pozzetto e aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (Vedi tabella 2) pipettando esso direttamente la soluzione utilizzando una pipetta 2 µ l. Miscelare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Vortice poco in seguito per garantire la corretta miscelazione.
Nota: Per determinare la fluorescenza di fondo, gli stainings deve essere eseguiti anche senza l'aggiunta dell'anticorpo primario. Per questo, incubare la fetta in soluzione di anticorpo senza anticorpi primari secondo il protocollo. - Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il tampone di bloccaggio con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di soluzione di anticorpo che contiene gli anticorpi primari per pozzetto. Incubare le fette con l'anticorpo primario durante la notte a 4 ° C in un agitatore.
- Giorno successivo, lavare le fette con lavaggio tampone 1 3 x per 10 min a RT su un agitatore.
- Rimuovere il supporto con una pipetta di plastica e aggiungere 300 µ l di tampone 1 di lavaggio per pozzetto. Incubare a + RT 10 min ripetere 3 volte.
- Durante le fasi di lavaggio, diluire i fluoroforo-accoppiati anticorpi secondari nel buffer dell'anticorpo in un tubo di reazione. Utilizzare 250 µ l di tampone di anticorpo per pozzetto e aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (Vedi tabella 2) pipettando esso direttamente la soluzione utilizzando una pipetta 2 µ l. Miscelare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Vortice poco in seguito per garantire la corretta miscelazione.
Attenzione: Poiché gli anticorpi sono sensibili alla luce, tutte le misure da questo punto in poi devono essere eseguite nel buio. - Dopo i passaggi di lavaggio, Rimuovi il lavaggio tampone con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di soluzione di anticorpo contenente anticorpi secondari per pozzetto. Incubare le fette con anticorpo secondario per 90 min a RT nel buio.
- Lavare le fette con lavaggio tampone 2 3 x per 10 minuti a TA.
- Durante le fasi di lavaggio, diluire 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in PB 0,1 M in una concentrazione di 1: 2000.
- Rimuovere il tampone di lavaggio 2 con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di soluzione DAPI per pozzetto. Incubare per 5 min a RT sull'agitatore.
- Rimuovere la soluzione DAPI con una pipetta di plastica e aggiungere 500 µ l di PB 0,1 M per pozzetto con una pipetta di 1000 µ l.
- Montare fette su vetrini da microscopio.
- Posto un vetrino da microscopio sotto lo stereoscopio. Con un pennello fine, aggiungere tre gocce separate di 0.1 M PB sulla diapositiva. Mettete una fetta per goccia sul vetrino del microscopio.
- Utilizzare il pennello sottile per appiattire e orientare le fette sul vetrino da microscopio.
- Quando tutte le sezioni sono posizionate correttamente, rimuovere PB in eccesso con un panno e asciugare accuratamente la diapositiva.
Attenzione: Evitare l'essiccazione le fette di cervello completamente. - Aggiungere 80 µ l di mezzo nella diapositiva di inclusione. Abbassare con cautela il coprioggetto sulla diapositiva, quindi incorporare le fette di cervello.
- Lasciare le diapositive ad asciugare la cappa per 1-2 h (coprirli per evitare l'esposizione alla luce) e memorizzarli in una casella di scorrimento microscopio a 4 ° C.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. imaging
- Dopo il mezzo di inclusione è completamente indurito, posizionare il vetrino al microscopio confocale.
Nota: Epifluorescenza combinato con software di deconvoluzione dovrebbe produrre qualità d'immagine simile. - Regolare le impostazioni di laser aumentando o diminuendo l'intensità del laser per ogni canale in modo che alcuni pixel sono sovraesposte per assicurare la massima distribuzione dei valori di grigio.
- Acquisire tessuti virtuale della fetta intero cervello per i diversi canali.
- Nel software di imaging (Vedi Tabella materiali), selezionare l'opzione di piastrelle e delineare manualmente la fetta di cervello con la Piastrella regione Setup.
- Distribuire i punti di assistenza in tutta la regione di mattonelle e regolare il fuoco per i punti di supporto differente premendo Verificare Tile regioni/posizioni...
- Regolare le impostazioni in Modalità di acquisizione secondo la desiderata ad alta risoluzione e le dimensioni dell'immagine risultante e avviare la scansione.
- Quando la scansione è terminata, è possibile utilizzare la funzione di cucitura per elaborare il tessuto virtuale. Esportare il file come un TIF con la funzione Esporta immagine.
4. computer-based Analysis
- Caricare tutti i singoli canali per un'immagine in Figi29 cliccando File | Aperto.
- Con lo strumento selezione a mano libera , delineare un emisfero nel DAPI-canale. Creare una maschera di selezione facendo clic modifica | Selezione | Creare la maschera.
- Determinare l'intensità media di fluorescenza per i singoli canali (Mover e lo synaptophysin) cliccando Analyze | Misura.
Nota: Assicurarsi di selezionare i canali diversi per determinare i valori di intensità media di fluorescenza per ogni canale. - Copiare l'intensità media di fluorescenza per singoli canali in un foglio di calcolo.
- Determinare l'intensità media di fluorescenza per singoli canali in un'area di interesse di delineare la zona anche con lo strumento selezione a mano libera . Utilizzare un Atlante del cervello del mouse come riferimento.
- Ripetere i passaggi 4.1-4.5 per tutti gli emisferi e tutte le aree di interesse.
Nota: Determinare i valori per ogni emisfero separatamente per poi confrontare i valori in un'area di interesse a quello nell'emisfero (Vedi punto 5.2).
5. il trattamento
- Nel caso in cui la fluorescenza di fondo è alta (Vedi discussione), potrebbe essere necessario una sottrazione di sfondo. Per questo, determinare l'intensità media di fluorescenza per la fetta elaborata senza primaria dell'anticorpo contro la proteina di riferimento (qui: sinaptofisina) e sottrarre tale valore da tutti i valori ottenuti per le regioni del cervello e gli emisferi.
- Quando sono state determinate le intensità media di fluorescenza per singoli canali per ogni emisfero e ogni area di interesse (Vedi tabella 3), calcolare il rapporto di Mover per lo synaptophysin dividendo il valore per Mover per il valore per lo synaptophysin ( giallo nella tabella 3). Questa azione eseguita separatamente per ogni emisfero e ogni area di interesse.
- Dividere il rapporto ottenuto per un'area di interesse per il rapporto ottenuto per l'emisfero corrispondente (arancione nella tabella 3) per determinare il rapporto tra l'area di interesse per l'emisfero.
- Per determinare la relativa abbondanza di Mover, tradurre il rapporto ottenuto in 5.2 in una percentuale da determinare la deviazione da 1 (in rosso nella tabella 3). Un rapporto di 1.25 darebbe quindi una relativa abbondanza di Mover del 25% superiore alla media, e un rapporto di 0,75 produrrebbe una relativa abbondanza di Mover del 25% inferiore alla media.
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Representative Results
Rappresentante modelli dei diversi marcatori di macchiatura può essere visto nella Figura 1. Il modello varia a seconda della distribuzione della proteina. Esempi di cinque livelli di rostro-caudale sono riportati nelle colonne (A)-(E). Un rappresentante colorazione DAPI è indicata nella prima riga: DAPI aderisce al DNA di una cellula e quindi i nuclei sono colorati. Ciò provoca un modello punctato. Regioni con una densità elevata delle cellule sono più luminose rispetto alle regioni con densità bassa delle cellule. Un esempio per una proteina eterogeneo distribuito può essere visto nella seconda riga. Il Mover macchiatura rivela una distribuzione differenziale in tutto il cervello, con aree luminose hotspot e dimmer. In terza fila, è riportato un esempio per lo synaptophysin di marcatore di riferimento più omogeneamente distribuite. Una sovrapposizione di due proteine (quarta riga) Mostra la distribuzione differenziale di Mover (rosso) rispetto al marcatore proteina sinaptofisina (verde).
La figura 2 Mostra la quantificazione descritta nel passaggio 4 del protocollo. Vengono mostrati i valori di intensità media di fluorescenza per diversi canali tra gli emisferi (Mover, Figura 2A; synaptophysin, Figura 2B) e tra le aree di interesse (Mover, Figura 2C; sinaptofisina, Figura 2D). Per determinare l'abbondanza di Mover rispetto al numero di vescicole sinaptiche, un rapporto è prelevato i valori di fluorescenza Mover per i valori di fluorescenza di synaptophysin. Questi rapporti per le aree di interesse sono mostrati in Figura 2Ee già forniscono un'indicazione della distribuzione eterogenea di Mover, con aree con alta e bassa Mover livelli rispetto delle vescicole sinaptiche. Per inoltre compensare la variabilità tecnica inerente, il rapporto in un'area di interesse (Figura 2E) è rispetto a quella in tutto l'emisfero (non mostrato) e tradotta in una percentuale. Questa relativa Mover abbondanza (Figura 2F) dà una misura di quanto Mover è presente in un'area di interesse relativa al media.
Come accennato in precedenza, uno dei principali vantaggi di questa tecnica è la capacità di determinare l'abbondanza della proteina di interesse in aree molto piccole, anche sottoregioni e strati di aree di interesse. Un esempio di questa applicazione è mostrato in Figura 3, dove l'abbondanza relativa di Mover è stato determinato per i differenti strati in sottocampi dell'ippocampo. La quantificazione in diversi strati illustrato nella Figura 3D, Figura 3Fe Figura 3H corrisponde agli strati mostrati in Figura 3Ce Figura 3E Figura 3G, con i colori corrispondenti. All'interno dell'ippocampo, Mover è eterogeneo, con alti livelli di Mover relativo vescicole sinaptiche in strati associati con calcolo intra-ippocampale (cioè, lo strato polimorfo della circonvoluzione dentata [DG], strato radiato, lucidum oriens di Cornu Ammonis 3 [CA3] e strato radiato e oriens di Cornu Ammonis 1 [CA1]) e bassi livelli in ingresso e uscita strati (strato molecolare interno ed esterno della DG, gli strati di cellule piramidali CA3 e CA1 e la strato lacunosum-molecolare di CA1).
Figura 1 : Immagini rappresentative di immunofluorescenza di DAPI (prima fila), Mover (seconda fila), lo synaptophysin (terza riga) e la loro sovrapposizione (quarta fila, Mover in rosso, synaptophysin in verde) in 5 livelli rostro-caudale (A-E). Aree di interesse sono ombreggiate in grigio nella riga superiore dei pannelli. M1, corteccia motoria primaria; Cio, Isole di Calleja; ACC, corteccia anteriore del cingulate; SNu, nuclei settali; VPa, pallidum ventrale; NuA, nucleo accumbens; CP, caudato putamen; S1, corteccia somatosensoriale primaria; HC, ippocampo; Sto, amigdala; MHa, habenula mediale; PAG, grigio periacqueduttale; SN, nigra di substantia; VTA, area tegmentale ventrale; MLC, strato molecolare del cervelletto; GLC, strato granulare del cervelletto. Barra della scala = 500 µm. Questa figura è stata modificata da Wallrafen e Dresbach1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Quantificazione della distribuzione attraverso i 5 livelli rostro-caudale Mover. Significa che l'intensità di fluorescenza del segnale Mover (A) e il segnale lo synaptophysin (B) a diversi livelli. Significa che l'intensità di fluorescenza del segnale Mover (C) e il segnale lo synaptophysin (D) alle regioni del cervello manualmente delineati 16. (E) rapporti di Mover e lo synaptophysin nelle aree del 16 cervello di interesse. (F) quantificazione dell'abbondanza relativa Mover, confrontando Mover/synaptophysin rapporto presso la rispettiva regione al rapporto dell'emisfero corrispondente. M1, corteccia motoria primaria; Cio, Isole di Calleja; ACC, corteccia anteriore del cingulate; SNu, nuclei settali; VPa, pallidum ventrale; NuA, nucleo accumbens; CP, caudato putamen; S1, corteccia somatosensoriale primaria; HC, ippocampo; Sto, amigdala; MHa, habenula mediale; PAG, grigio periacqueduttale; SN, nigra di substantia; VTA, area tegmentale ventrale; MLC, strato molecolare del cervelletto. Puntini neri rappresentano i punti dati singoli. Le barre indicano media ± errore standard della media (SEM). Questa figura è stata modificata da Wallrafen e Dresbach1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Distribuzione di mover nell'ippocampo mouse. Stainings di immunofluorescenza di coronale fette dell'ippocampo del mouse. Panoramica dell'ippocampo che mostra il modello di espressione Mover eterogeneo (A) e la sinaptofisina corrispondente (B) la macchiatura. Le tre regioni di interesse (DG, Figura 3C; CA3, Figura 3E; CA1, Figura 3G) sono delineati con linee bianche tratteggiate. (D,F,H) Quantificazione, confrontando il rapporto nei rispettivi strati al rapporto dell'emisfero corrispondente. I colori nei grafici bar corrispondono ai rispettivo ombreggiatura in pannelli C, Ee G. Espressione di Mover è alto in livelli sono associati con calcolo intra-ippocampale (cioè, lo strato polimorfo della DG, strato radiato, lucidum e oriens di CA3 e strato radiato e oriens di CA1) e bassa nel principale ingresso e uscita strati (il strato molecolare interno ed esterno della DG, gli strati di cellule piramidali CA3 e CA1 e il corneum lacunosum-molecolare di CA1). OML, strato molecolare esterno; IML, strato molecolare interno; GrL, strato granulare; PmL, polimorfo strato/hilus; COSÌ, strato oriens; Spia, corneum pyramidale; SLu, stratum lucidum; SR, strato radiato; SLM, strato lacunosum-molecolare. Barra della scala = 500 µm. puntini neri rappresentano dati singoli punti. Le barre indicano la media ± SEM Questa figura è stata modificata da Wallrafen e Dresbach1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Soluzioni utilizzate in questo protocollo.
Tabella 2: Gli anticorpi usati in questo protocollo.
Tabella 3: Esempio di gestione dei dati.
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Discussion
Il metodo qui presentato mira a quantificare la distribuzione di una proteina di interesse riguardante l'abbondanza di una proteina marker con una nota distribuzione. Colorazione di immunofluorescenza può mostrare un'alta variabilità dell'intensità tra le diverse sezioni di colorazione. L'approccio di quantificazione descritto qui aggira questo problema determinando il rapporto della proteina di interesse per i media in tutto l'emisfero. Di conseguenza, diverse intensità di colorazione attraverso fette sono vanificate e consentono una descrizione quantitativa.
Come con tutti i protocolli di immunofluorescenza, qualitativa o quantitativa, diversi fattori possono influenzare il successo e quindi confondere l'analisi. Di conseguenza, dovrebbe prestare particolare attenzione ai passaggi critici del protocollo. In primo luogo, è necessaria una corretta fissazione del tessuto. Questo sistema di fissaggio si ottengono solitamente un'aspersione di successo perfusione. La qualità di perfusione può essere verificata controllando il fegato poco dopo aver lavato il sangue. Un primo indicatore per un successo di aspersione è lo schiarimento del fegato e le estremità28. La presenza di coaguli di sangue può indicare che la perfusione potrebbe essere stato troppo lenta e dovrebbe essere effettuata più velocemente la prossima volta. Alcune proteine richiedono protocolli di fissazione diversi, come la fissazione chimica con PFA può causare epitopo blocco30. In questo caso, la fissazione di congelare o fissazione con una sostanza chimica diversa, ad esempio metanolo, dovrebbe essere considerata. In secondo luogo, dopo il sezionamento, è fondamentale per macchiare le fette di cervello come rapidamente come possibile, preferibilmente nello stesso o il successivo dire. Archiviazione a lungo in PB può condurre all'infezione batterica e mentre l'aggiunta di NaN3 può impedire questo in una certa misura, la qualità del tessuto solitamente si deteriora con il tempo di conservazione. In terzo luogo, durante la procedura di colorazione, è importante eseguire lavaggi bene-di-bene per evitare l'essiccazione delle fette. Quando le fette si asciugano, fluorescenza di fondo possa aumentare e quindi causare una distorsione nell'analisi. In quarto luogo, dopo l'applicazione dell'anticorpo secondario, è fondamentale per eseguire tutti i passaggi seguenti nel buio. I fluorofori sono sensibili alla luce, e l'esposizione alla luce può gravemente distorcere il segnale di fluorescenza.
L'ottimizzazione della procedura di colorazione, compresa la selezione di adeguati anticorpi primari e secondari, concentrazione ottimale e tempi di esposizione, è un prerequisito per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore e di effettuare un affidabile analisi quantitativa di immunofluorescenza. Gli anticorpi verificati a knock out tessuto dovrebbero essere la scelta preferita, anche se non sempre disponibile. Assicurarsi sempre di eseguire esperimenti di controllo adeguati per escludere la sovrapposizione di diversi anticorpi. La quantità di fluorescenza di fondo derivanti dall'autofluorescenza e legame non specifico dell'anticorpo secondario può essere stimata da imaging le fette in cui non è stato applicato l'anticorpo primario. Non è banale per stabilire quanto più in alto le intensità del segnale devono essere rispetto allo sfondo di avere un accettabile rapporto segnale-rumore. Tuttavia, basato su osservazioni empiriche, gli autori suggerirebbe che mira per avere un segnale almeno 2 volte più forte di sfondo al fine di stimare in modo affidabile la distribuzione della proteina. Nel caso in cui la fluorescenza di fondo è elevata in condizioni di controllo (senza la presenza dell'anticorpo primario), la fluorescenza di fondo media dovrebbe essere sottratto le immagini di esperimento.
Il vantaggio principale del nostro approccio è suo riferimento interno: l'intensità di immunofluorescenza della proteina target (cioè, Mover) in una regione di interesse è paragonato a un marcatore di riferimento (cioè, lo synaptophysin) e per l'intensità complessiva di Queste proteine attraverso l'intero emisfero. Quindi, dal calcolo eseguiamo, uno può inequivocabilmente concludere che l'abbondanza della proteina dell'obiettivo è x piega superiore/inferiore in una certa regione di interesse che l'abbondanza della proteina di riferimento riguardante la distribuzione delle proteine attraverso la tutto l'emisfero a questo livello rispetto al Bregma31. Questo consente il confronto dei risultati utilizzando anticorpi differenti, differenti microscopi, o perfino in diversi studi. Questa coerenza tra diversi campioni deriva dalla natura comparativa di questo metodo: variabilità è compensata per prendendo il rapporto tra la fluorescenza nella zona di interesse e quella dell'emisfero. Pertanto, differenze in termini assoluti, derivanti da differenze tecniche sono annullati. Un altro grande vantaggio di questa tecnica è il fatto che le aree di interesse possono essere piccole come si desidera essere, limitata solo dalla risoluzione del microscopio. Quantificare i livelli della proteina con metodi biochimici, ad esempio Western Blot o spettrometria di massa6,7,8,9, richiede una dissezione del tessuto nell'area di interesse. Questa dissezione è difficile per le regioni del cervello, come la corteccia somatosensoriale primaria e diventa praticamente impossibile quando si mira per sottoregioni, quali i diversi strati della corteccia o l'ippocampo.
Un avvertimento dell'approccio è che i diversi livelli nel cervello non possono essere paragonati direttamente con a vicenda. Emisferi con molte regioni ricche in proteina di interesse avrà un valore medio diverso da emisferi con solo poche regioni ricche in proteine. Valori del 20% sopra la media, ad esempio, rifletteranno quindi una diversa quantità assoluta di proteine in un livello relativo Bregma rispetto ad una seconda. Bisogna tenere a mente anche che questo metodo non consente la determinazione dei livelli di proteina assoluto, solo l'abbondanza relativa rispetto al marcatore di riferimento interno e la media in tutto l'emisfero.
Questo metodo può essere facilmente adattato per determinare la distribuzione della proteina di interesse rispetto al marker per diversi compartimenti neuronali, non solo siti presinaptici. Può anche essere facilmente adattato per tessuti diversi da cervello e - con gli anticorpi adatti - altri sistemi di modello di topi32,33. Mentre l'uso di un microscopio confocale è metodo il authors' di scelta, una combinazione di software di microscopia e deconvoluzione epifluorescenza dovrebbe cedere la stessa qualità di dati e quindi espandere l'usabilità del protocollo. Inoltre, lo stesso stainings può essere utilizzato per determinare la distribuzione subcellulare, ad esempio con microscopia di Super-risoluzione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Irmgard Weiss per l'eccellente assistenza tecnica. Gli autori riconoscono supporto da Hermes Pofantis e Andoniya Petkova. Gli autori ringraziano anche l'Istituto europeo di Neuroscienze per l'utilizzo del LSM800 e assistenza tecnica, soprattutto da Dr. Nils Halbsgut. Questo lavoro è stato finanziato all'University Medical Center Gottinga. JSV riconosce sostegno dal centro per microscopia su scala nanometrica e fisiologia molecolare del cervello (CNMPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
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