Summary
Her beskriver vi en kvantitativ tilnærming til å fastslå fordelingen av et synaptic protein i forhold til en markør protein bruker immunofluorescence flekker, AC confocal mikroskopi og datamaskin analyse.
Abstract
Tilstedeværelse, fravær eller nivåer av bestemte synaptic proteinene kan alvorlig påvirke synaptic overføring. I tillegg til Klargjørende funksjonen av et protein, er det viktig å også bestemme distribusjon. Her beskriver vi en protokoll ansette immunofluorescence AC confocal mikroskopi og datamaskin analyse til fordelingen av synaptic protein Mover (også kalt TPRGL eller SVAP30). Vi sammenligne distribusjonen av Mover som i synaptic vesicle protein synaptophysin, dermed å finne fordelingen av Mover på en kvantitativ måte i forhold til overflod av synaptic blemmer. Spesielt kan denne metoden potensielt implementeres for å tillate sammenligning av fordelingen av proteiner med forskjellige antistoffer eller mikroskop eller på tvers av ulike studier. Vår metoden omgår iboende variasjon av immunofluorescent stainings av gir forholdet i stedet for absolutte fluorescens nivåer. I tillegg metoden vi beskrive gjør forskeren analysere fordelingen av et protein på ulike nivåer: fra hele hjernen sektorene til hjernen regioner til forskjellige delområder i én hjerne område, for eksempel de forskjellige lagene av hippocampus eller sensorisk halvdelene. Mover er et virveldyr-spesifikke protein som er forbundet med synaptic blemmer. Med denne metoden viser vi at Mover heterogeneously er distribuert over hjernen områder, med høy det ventrale pallidum septal kjerner og amygdala, og også innen enkelt hjernen, som forskjellige lag av hippocampus.
Introduction
Kommunikasjon mellom nerveceller skjer på spesialiserte kontakt områder kalt synapser. Synapser inneholder en rekke ulike proteiner som arrangerer synaptic overføring. Noen av disse proteinene viser en heterogen distribusjon over hele nervesystemet og finnes ikke i hver synapse1. Et eksempel for slik et protein er Munc13, som er involvert i grunning prosessen med synaptic blemmer. Det er ulike isoformene av Munc13, som heterogeneously distribueres gjennom hjernen2, og tilstedeværelse eller fravær av bestemte isoformene kan påvirke kortsiktige synaptiske plastisitet og synaptic vesicle dynamics3, 4 , 5. det er derfor av avgjørende betydning å kunne identifisere tilstedeværelsen av ulike synaptic proteiner over hjernen områder.
Metodene valgfrihet for kvantifisering av synaptic proteiner - så langt - er massespektrometri og Western blotting, snarere enn immunohistochemistry6,7,8,9. I noen tilfeller brukes flere metoder til å utfylle hverandre å vurdere både-antallet og lokalisering av spesifikke proteiner (dvs., Wilhelm et al. 10). metoden som beskrives her gjør at lokalisering og kvantifisering av proteiner rundt uten behov for å bruke noen biokjemiske metode, bare ansette immunofluorescent stainings. En annen fordel her er at kvantifiseringen kan gjøres over områder mye mindre, og derfor mer spesifikk, enn de oppnådd ved andre metoder. Imidlertid må man ta i betraktning at en pålitelig referanse protein er nødvendig å vurdere fordelingen av protein av interesse.
Fluorescerende farging av immunhistokjemi tillater oss å rutinemessig identifisere lokaliseringen av proteiner over hjernen områder og i ulike neuronal avdelinger. For å identifisere de ulike avdelinger, brukes bestemte markører. Vanligvis kan antistoffer mot synapsin og synaptophysin11 brukes til å merke synaptic vabler, mens antistoffer mot fagott etiketten aktive sonen for en presynaptic terminal12. Vesicula transportører, som vesicula glutamat transportører (vGluT) eller vesicula GABA transporter (vGAT), brukes til å merke eksitatoriske13 og hemmende14 presynaptic terminaler, henholdsvis. På postsynaptic side, kan antistoffer mot protein Homer brukes til å merke postsynaptic terminaler og antistoffer mot postsynaptic tetthet protein 95 (PSD95)15,16,17 eller gephyrin18 , 19 , 20 kan merke eksitatoriske eller hemmende postsynaptic terminaler, henholdsvis. Ved hjelp av antistoffer mot et protein av interesse og markører som de som er beskrevet ovenfor, kan en avgjøre lokaliseringen av slike protein. Mange studier hittil har gjort dette i en kvalitativ måte21. Imidlertid å pålitelig bestemme differensial fordelingen av en bestemt synaptic protein, må en ikke bare finne sin tilstedeværelse eller fravær, men også sin relative konsentrasjon. Heterogenitet størrelser og tetthet av synapser gjør det viktig å etablere et forhold mellom synaptic markøren og protein av interesse. Ellers viser synapse-rike regioner som ikke-pyramideformet lag av hippocampus og molekylære laget av lillehjernen en høy tetthet av synaptic proteiner, bare på grunn av høyere tettheten av synapser, men ikke på grunn av en sterk tilstedeværelse av dette proteinet i hver synapse (f.eks, Wallrafen og Dresbach1). På den annen side, viser proteiner i neuronal soma (f.eks, TGN3822) vanligvis sterk tilstedeværelse i hippocampus pyramideformet celle laget eller hippocampus eller lillehjernen granule celle lag på grunn av den høye konsentrasjonen av neuronal cellen legemer i disse områdene. Derfor denne ikke-homogene fordelingen av strukturer, i dette tilfellet synapser, kan føre til en falsk estimering av fordelingen av protein rundt seg. Videre er det en iboende variasjon i flekker intensiteter over prøvene i immunohistochemical stainings. Protokollen beskrevet her tar dette i betraktning, og unngår slike fordommer, samt andre advarsler som oppstår fra immunohistochemical metoder.
I vår siste studie, vi har brukt denne metoden for å beskrive differensial uttrykk for Mover (også kalt TPRGL23 eller SVAP3024) over 16 forskjellige hjernen områder1. Mover er en virveldyr-spesifikke synaptic protein som finnes i tilknytning til synaptic blemmer og påvirker nevrotransmitter utgivelsen25,26,27. Vi har knyttet Mover uttrykket til overflod av synaptic blemmer, av flekker for synaptophysin som en synaptic vesicle referanse markør. Vi fant høye nivåer av Mover spesielt i septal kjerner og det ventrale pallidum amygdala. I hippocampus fant vi en heterogen fordeling av Mover, med høy i lagene knyttet intra-hippocampus beregning og lave nivåer i inn- og utgang lag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen involverer ikke eksperimenter på levende dyr. Eksperimenter med euthanizing dyr å få hjernen prøver ble godkjent av lokale Dyrevern myndigheter (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) under Valideringsnummeret T 10/30.
Merk: For denne protokollen, 3 voksne mannlige C57BL/6 mus ble brukt.
1. sample forberedelse
- Forberede bindemiddel og 0.1 M fosfatbuffer (PB, se tabell 1).
- Fastsette dyret av transcardial perfusjon som beskrevet i Gage et al. 28. første bleke blodet med 0,9% NaCl-løsning, så perfuse med 30 mL av 4% paraformaldehyde (PFA).
- Åpne skallen med saks og forsiktig isolere hjernen ved hjelp av en skje med sløv kanter for å unngå å skade vevet.
- Fyll en 50 mL reaksjon tube med bindemiddel og postfix hjernen i 4% PFA på 4 ° C over natten.
- Fjerne bindemiddel og vask hjernen i 50 mL av 0.1 M PB på en shaker i 30 min.
- Etter vasking, ruge hjernen i en 50 mL reaksjon rør i 30% sukrose i 0.1 M PB i 48 timer eller til det synker i røret ved 4 ° C i cryoprotection.
- Trim cryoprotected hjernen med en skarp kniv, plasserer den i en cryomold og legge den optimale kutte temperaturen (OCT) sammensatte. Unngå bobler. Orientere hjernen og fryse cryomold i-80 ° C fryseren.
- Montere frossent snitting. Equilibrate vev til cryomicrotome temperatur i minst 15 min før snitting.
- Delen hjernen i 25 µm tykke koronale skiver. Trykk Tilpasningsverktøy for Office med et glass krok uten å berøre hjernevev. Samle 3 tilstøtende stykker per brønn i en 24 godt plate og lagre dem i 0.1 M PB 4 ° c til farging.
Merk: Protokollen kan pauses her to uker. Lengre lagringstider kan forstyrre vev kvaliteten og dermed påvirke utfallet av eksperimentet.
2. immunofluorescence
- Utarbeide løsninger inkludert blokkering buffer, antistoff buffer, vaske buffer 1, og vask buffer 2 (se tabell 1).
- Skyll skiver gang med PB fjerne overflødig OCT.
- Fjerne løsningen med en plastikk pipe uten suger i hjernen skiver. Legge til 250 µL av fersk PB med en 1000 µL pipette.
FORSIKTIG: Skiver bør ikke tørke ut, så fjerne og legge til væsker bra ved brønnen.
- Fjerne løsningen med en plastikk pipe uten suger i hjernen skiver. Legge til 250 µL av fersk PB med en 1000 µL pipette.
- Fjern PB med en plastikk pipe og legge 250 µL av blokkering buffer per godt med en 1000 µL pipette. Inkuber for 3t ved romtemperatur (RT) på shaker.
- Imens inkubering, fortynne primære antistoffer Antistoffer buffer i et reaksjon rør. Bruke 250 µL antistoff buffer per brønn og legge til riktig mengde antistoff (se tabell 2) av pipettering det direkte inn i løsningen med en 2 µL pipette. Bland løsningen ved forsiktig pipettering opp og ned flere ganger. Vortex kort tid etterpå for å sikre riktig blanding.
Merk: For å finne bakgrunnen fluorescens, stainings bør også utføres uten å legge primære antistoffer. For at ruge sektoren i antistoff løsning uten primære antistoffer i henhold til protokollen. - Etter inkubasjon tiden, Fjern blokkering buffer med en plastikk pipe og legge 250 µL av antistoff løsning som inneholder primære antistoffer per brønn. Inkuber skiver med primære antistoff overnatting på 4 ° C i en shaker.
- Neste dag, vaske skiver med å vaske bufferen 1 3 x i 10 min på RT på en shaker.
- Fjerne mediet med en plastikk pipe og legger 300 µL vaske bufferen 1 per brønn. Ruge på RT for 10 min. Gjenta 3 ganger.
- Fortynn fluorophore-kombinert sekundære antistoffer Antistoffer buffer i et reaksjon rør under vask trinnene. Bruke 250 µL antistoff buffer per brønn og legge til riktig mengde antistoff (se tabell 2) av pipettering det direkte inn i løsningen med en 2 µL pipette. Bland løsningen ved forsiktig pipettering opp og ned flere ganger. Vortex kort tid etterpå for å sikre riktig blanding.
Advarsel: Fordi antistoffer er lys-sensitive, alle trinnene fra dette punktet må utføres i mørket. - Etter vask trinnene, Fjern vask buffer med en plastikk pipe og legge til 250 µL av antistoff løsning som inneholder sekundære antistoffer per brønn. Inkuber skiver med sekundær antistoff for 90 min på RT i mørket.
- Vask skiver med vaske bufferen 2 3 x i 10 min på RT.
- Fortynne 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 0.1 M PB i en konsentrasjon av 1:2000 under punktene vask.
- Fjern vaske bufferen 2 med en plastikk pipe og legge 250 µL DAPI løsning per brønn. Inkuber i 5 min på RT på shaker.
- Fjern DAPI løsningen med en plastikk pipe og legge 500 µL av 0.1 M PB per godt med en 1000 µL pipette.
- Montere skiver på objektglass.
- Plass en microscope skyve under stereoscope. Legge til tre separate dråper 0.1 M PB på lysbildet med en fin pensel. Plass én sektor per slipp på mikroskopet lysbildet.
- Bruk fin pensel å flate og orientere skiver på mikroskopet lysbildet.
- Når alle sektorer er riktig plassert, fjerne overflødig PB med en vev og tørr lysbildet nøye.
FORSIKTIG: Unngå tørking hjernen skiver helt. - Legge til 80 µL embedding medium på lysbildet. Nøye lavere dekkglassvæske inn i lysbildet, og dermed bygge hjernen skiver.
- La lysbildene tørke i avtrekksvifte for 1-2 h (dekker dem for å unngå eksponering) og lagre dem i en mikroskop lysbildet boks 4 ° C.
Merk: Protokollen kan pauses her.
3. imaging
- Etter innebygging mediet er helt herdet, plassere microscope skyve under AC confocal mikroskop.
Merk: Epifluorescence mikroskopi kombinert med deconvolution programvare skal gi lignende bildekvalitet. - Justere laser ved å øke eller redusere laser intensiteten for hver stasjon slik at par piksler er overeksponert for å sikre maksimal distribusjonen av grå verdier.
- Kjøpe virtuelle vev på hele hjernen sektoren for forskjellige kanaler.
- I tenkelig programvare (se Tabell for materiale), Velg alternativet fliser og manuelt avgrense hjernen sektoren med Flis regionen oppsett.
- Distribuere poeng for støtte i hele regionen fliser og Juster fokus for ulike støtte poeng ved å trykke Kontroller flis regioner/stillinger...
- Justere Vinningen måte i henhold til ønsket oppløsning og størrelsen på den resulterende bildet og starte skandalen.
- Når skanningen er ferdig, kan du bruke funksjonen Stitching behandle virtuelle vevet. Eksportere filen som en TIF med funksjonen Bildet eksportere.
4. databasert analyse
- Laste inn alle enkelt kanaler for ett bilde i FIJI29 ved fil | Åpne.
- Med markeringsverktøyet Frihånd avgrense en halvkule i DAPI-kanalen. Opprette en maske av valget ved å klikke Rediger | Utvalg | Opprette maske.
- Bestemme mener fluorescens intensiteten for enkelt kanaler (Mover og synaptophysin) ved å klikke analyser | Tiltak.
Merk: Pass på å velge de ulike kanalene å bestemme mener fluorescens intensitetsverdiene for hver kanal. - Kopier mener fluorescens intensiteten for enkelt kanaler i et regneark.
- Bestemme mener fluorescens intensiteten for enkelt kanaler i et område av interesse ved å skildre området også med Frihånd markeringsverktøyet. Bruk en mus hjernen atlas som referanse.
- Gjenta trinn 4.1-4.5 for alle halvkuler og alle områder av interesse.
Merk: Bestemmer verdiene for hver halvkule separat for å senere sammenligne verdiene i et område av interesse som i halvkule (se trinn 5.2).
5. håndtering
- I tilfelle bakgrunn fluorescens er høy (se diskusjon), en bakgrunn subtraksjon kan være nødvendig. For at avgjøre mener fluorescens intensiteten for skive behandlet uten primære antistoff mot referanse protein (her: synaptophysin) og trekke verdien fra alle verdier hentet for hjernen regioner og halvkuler.
- Når mener fluorescens intensiteten for enkelt kanaler for hver halvkule og alle områder av interesse er definert (se tabell 3), beregne forholdet mellom Mover til synaptophysin ved å dele verdien for Mover verdien for synaptophysin ( gul i tabell 3). Utfør denne handlingen for hver halvkule og alle områder av interesse separat.
- Dele forholdet innhentet for ett område av interesse av forholdet innhentet for den tilsvarende halvkulen (oransje i tabell 3) for å bestemme forholdet mellom området av interesse for halvkulen.
- Oversette forholdet innhentet i 5.2 i en prosent ved å bestemme dens avvik fra 1 (rød i tabell 3) for å fastslå den relative Mover overfloden. En ratio på 1,25 ville derfor gi en relativ Mover overflod av 25% over gjennomsnittet, og en ratio på 0,75 ville gi en relativ Mover overflod av 25% under gjennomsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant flekker mønstre av forskjellige merkene kan ses i figur 1. Mønsteret varierer avhengig av distribusjon av protein. Eksempler på fem rostro-caudal nivåer vises i kolonnene (A)-(E). En representant DAPI flekker vises i første rad: DAPI overholder DNA av en celle og dermed kjerner er farget. Dette resulterer i et vises punctate mønster. Områder med en høyt tetthet er lysere enn områder med lav celle tettheter. Et eksempel på et heterogeneously distribuert protein kan sees i den andre raden. En flyttepeker flekker avslører en differensiell distribusjon gjennom til hjernen, med lyse hotspot områder og dimmer. I den tredje raden vises et eksempel for mer homogent distribuerte markør synaptophysin. En overlapping av to proteiner (fjerde rad) viser differensial fordelingen av Mover (rød) sammenlignet med markør protein synaptophysin (grønn).
Figur 2 viser kvantifiseringen beskrevet i trinn 4 i protokollen. Vises mener fluorescens intensitetsverdiene for de ulike kanalene på tvers av halvkuler (Mover, figur 2A; synaptophysin, figur 2B) og interesseområder (Mover, figur 2C; synaptophysin, figur 2D). For å bestemme Mover overflod i forhold til antall synaptic blemmer, er forholdet tatt av Mover fluorescens verdiene til synaptophysin fluorescens verdier. Disse forholdene for områder av interesse er vist i figur 2E, og gi en indikasjon på heterogene fordelingen av Mover, med områder med høy og lav Mover nivåer i forhold til synaptic blemmer. For å i tillegg kompensere for den iboende teknisk variasjonen, er forholdet i ett område av interesse (figur 2E) forhold over halvkulen (ikke vist) og oversatt til prosent. Dette relative Mover overflod (figur 2F) gir et mål på hvor mye Mover finnes i ett område av interesse i forhold til gjennomsnittet.
Som nevnt ovenfor, er en av de store fordelene med denne teknikken muligheten til å bestemme tettheten av protein rundt svært små områder, selv delområder og lag av interesseområder. Et eksempel på dette programmet vises i Figur 3, hvor den relative Mover overfloden er bestemt for de forskjellige lagene i underfelt av hippocampus. Kvantifisering i de forskjellige lag vises i Figur 3D, Figur 3Fog Figur 3H tilsvarer lagene vises i Figur 3C, Figur 3Eog Figur 3G, med tilsvarende farger. I hippocampus distribueres Mover heterogeneously, med høy Mover i forhold til synaptic blemmer i lag forbundet med intra-hippocampus beregning (dvs., det polymorph laget av dentate gyrus [DG], stratum radiatum, lucidum og oriens av Cornu Ammonis 3 [CA3], og stratum radiatum og oriens av Cornu Ammonis 1 [CA1]), og lave nivåer i inn- og utgang lag (indre og ytre molekylær laget av DG, pyramideformet celle lag av CA3 og CA1, og stratum lacunosum-moleculare av CA1).
Figur 1 : Representative immunofluorescence bilder av DAPI (1.p), Mover (andre rad), synaptophysin (tredje rad), og deres overlegg (fjerde rad, Mover i rødt, synaptophysin i grønt) på 5 rostro-caudal nivå (AE). Interesseområder, er skyggelagt med grått i den øverste raden i paneler. M1, primære motorisk cortex; IoC, øyene i Calleja; ACC, anterior cingulate cortex; SNu, septal kjerner; VPa, ventral pallidum; Road, nucleus accumbens; CP, caudate putamen; S1, primære somatosensory cortex; HC, hippocampus; Er, amygdala; MHa, mediale habenula; PAG, periaqueductal grå; SN, substantia nigra; VTA, ventral tegmental området. MLC, molekylær laget av lillehjernen; GLC, granulat laget av lillehjernen. Skala bar = 500 µm. Dette tallet er endret fra Wallrafen og Dresbach1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Kvantifisering av Mover distribusjon på tvers av 5 rostro-caudal nivåene. Mener fluorescens intensitet Mover signalet (A) og synaptophysin signalet (B) på ulike nivåer. Mener fluorescens intensitet Mover signalet (C) og synaptophysin signalet (D) på 16 manuelt kodedel hjernen regioner. (E) prosenter av Mover og synaptophysin i 16 hjernen områder av interesse. (F) kvantifisering av relativ Mover overflod, sammenligne Mover/synaptophysin forholdet på respektive regionen til forholdet mellom den tilsvarende halvkulen. M1, primære motorisk cortex; IoC, øyene i Calleja; ACC, anterior cingulate cortex; SNu, septal kjerner; VPa, ventral pallidum; Road, nucleus accumbens; CP, caudate putamen; S1, primære somatosensory cortex; HC, hippocampus; Er, amygdala; MHa, mediale habenula; PAG, periaqueductal grå; SN, substantia nigra; VTA, ventral tegmental området. MLC, molekylær laget av lillehjernen. Sorte prikker representerer ett datapunkt. Viser gjennomsnittlig ± standardfeil av gjsnitt (SEM). Dette tallet er endret fra Wallrafen og Dresbach1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Mover distribusjon i musen hippocampus. Immunofluorescence stainings av koronale skiver av musen hippocampus. Oversikt over hippocampus viser heterogene Mover uttrykk mønsteret (A) og den tilsvarende Synaptophysin flekker (B). De tre regionene rundt (DG, Figur 3C; CA3, Figur 3E; CA1, Figur 3G) er avgrenset med hvite stiplede linjer. (D,F,H) Kvantifisering sammenligner forholdet i de respektive lag til forholdet mellom den tilsvarende halvkulen. Fargene i søylediagrammer tilsvarer de respektive skyggeleggingen i paneler C, Eog G. Mover uttrykk er høy i nivåer knyttet intra-hippocampus beregning (dvs., det polymorph laget av DG, stratum radiatum, lucidum og oriens CA3, og stratum radiatum og oriens av CA1) og lav i viktigste input- og output lag (den indre og ytre molekylær lag av DG, pyramideformet celle lag av CA3 og CA1, og stratum lacunosum-moleculare av CA1). OML, ytre molekylær laget. IML, indre molekylær laget. GrL, granulat laget. PmL, polymorph lag/hilus; SÅ, stratum oriens; SPy, stratum pyramidale; SLu, stratum lucidum; SR, stratum radiatum; SLM, stratum lacunosum-moleculare. Skala bar = 500 µm. sorte prikker representerer ett datapunkt. Viser gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet er endret fra Wallrafen og Dresbach1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Løsninger brukes i denne protokollen.
Tabell 2: Antistoffer i denne protokollen.
Tabell 3: Eksempel på håndtering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteres her tar sikte på å kvantifisere distribusjon av et protein av interesse i forhold til overflod av en markør protein med en kjent distribusjon. Immunofluorescence flekker kan vise en høy variasjon av flekker intensiteter mellom forskjellige stykker. Kvantifisering tilnærming beskrevet her omgår dette problemet ved å bestemme forholdet mellom protein av interesse for gjennomsnittlige over halvkulen. Derfor ulike flekker intensiteter over skiver er kansellert og la en kvantitativ beskrivelse.
Som med alle immunofluorescence-protokollen, kvalitative og kvantitative, flere faktorer kan påvirke suksess og dermed forvirre analysen. Derfor bør spesiell oppmerksomhet vies til avgjørende skritt av protokollen. Først er en riktig fiksering av vev nødvendig. Denne fiksering kan vanligvis oppnås ved en vellykket transcardial perfusjon. Kvaliteten på perfusjon kan verifiseres ved å sjekke leveren etter vasker ut blodet. En første indikator for en vellykket perfusjon er clearing av leveren og ekstremiteter28. Tilstedeværelsen av blodpropp kan indikere at perfusjonen kan ha vært lav og skal utføres raskere neste gang. Noen proteiner krever ulike fiksering protokoller, som kjemisk fiksering med PFA kan forårsake epitope blokkering30. I dette tilfellet bør fryse fiksering eller fiksering med en annen kjemisk, som metanol, vurderes. Andre etter snitting er det kritisk stain hjernen skiver som raskt som mulig, fortrinnsvis samme eller neste si. Lengre lagring i PB kan føre til bakteriell infeksjon, og tilfører NaN3 kan forhindre dette til en viss grad, vev kvaliteten vanligvis forverres med lagringstid. Tredje under farging prosedyren er det viktig å utføre vask trinn godt-av-godt for å unngå tørking sektorene. Når skiver tørke ut, bakgrunn fluorescens mer og dermed føre til en skjevhet i analysen. Fjerde, etter sekundære antistoffer er det viktig å utføre alle følgende i mørket. Fluorophores er lys-sensitive, og lyseksponering kan alvorlig forvrenge fluorescens signalet.
Optimalisering av flekker prosedyren, inkludert valg av tilstrekkelig primære og sekundære antistoffer, optimal antistoff konsentrasjon og utredning tid, er en forutsetning for å oppnå det beste signal-til-støy-forholdet og å gjennomføre en pålitelig kvantitativ immunofluorescence analyse. Antistoffer bekreftet i slå ut vev skal foretrekkes, men ikke alltid tilgjengelig. Sørg alltid for å utføre riktig kontroll eksperimenter for å utelate crosstalk mellom forskjellige antistoffer. Hvor mye bakgrunnen fluorescens fremkommer fra autofluorescence og uspesifikke binding av sekundær antistoffer kan anslås av imaging skiver som det primære antistoffet ikke ble brukt. Det er ikke trivielt å etablere hvor mye høyere intensiteter av signalet må være sammenlignet med bakgrunnen å ha en akseptabel signal-til-støy-forhold. Imidlertid foreslår basert på empiriske observasjoner, forfatterne satsing for å ha et signal minst 2-fold sterkere enn bakgrunn for å anslå pålitelig protein fordelingen. I tilfelle bakgrunn fluorescens er høy i kontroll forhold (uten tilstedeværelse av primære antistoffer), skal gjennomsnittlig bakgrunn fluorescens trekkes fra eksperimentet bilder.
Den store fordelen med vår tilnærming er interne referansen: immunofluorescence intensiteten av målet protein (i.e.Mover) i et område av interesse er sammenlignet med et merke (dvs., synaptophysin) og til generelle intensiteten av disse proteinene over hele halvkule. Dermed fra beregningen vi utfører, en kan utvetydig konkludere med at overflod av målet protein x fold høyere/lavere i en bestemt region av interesse enn overflod av referanse protein i forhold til distribusjon av proteiner over den hele halvkule på dette nivået i forhold til Bregma31. Dette gir sammenligningen av resultater ved hjelp av ulike antistoffer, ulike mikroskoper, eller selv over forskjellige studier. Konsistens på tvers av forskjellige prøver kommer fra denne metoden sammenlignende natur: variasjon er kompensert av tar forholdet mellom fluorescens i området av interesse og som av halvkule. Derfor er ulikheter i absolutte verdier som følge av tekniske forskjellene nullified. En annen større fordel av denne teknikken er at områder av interesse kan være så liten som du vil de skal være, bare begrenset av oppløsningen av mikroskopet. Kvantifisere protein nivå biokjemiske metoder, krever for eksempel Western Blot eller massespektrometri6,7,8,9, en Disseksjon av vevet inn i området rundt. Dette disseksjon er vanskelig for regioner av hjernen, som primær somatosensory cortex, og blir nesten umulig når delområder, som forskjellige lag av cortex eller hippocampus.
En påminnelse av tilnærming er at de ulike nivåene i hjernen ikke direkte sammenlignes med hverandre. Halvkuler med mange regioner rik på protein av interesse vil ha en annen gjennomsnittlig verdi enn halvkuler med bare få proteinrik regioner. Verdiene for 20% over gjennomsnittet, for eksempel gjenspeiler derfor en annen absolutt mengde protein i ett nivå i forhold til Bregma sammenlignet med en andre ettall. Man må Husk også at denne metoden ikke tillater fastsetting av absolutt protein nivå, bare relativ overflod i forhold til det interne merket og gjennomsnittlig over halvkulen.
Denne metoden kan lett tilpasses fordelingen av protein av interesse i forhold til markører for ulike neuronal avdelinger, ikke bare presynaptic nettsteder. Det kan også være enkelt tilpasses for vev enn hjernen og - med egnet antistoffer - andre modellsystemer enn mus32,33. Bruk av AC confocal mikroskop er forfatternes metoden valgfrihet, bør en kombinasjon av epifluorescence mikroskopi og deconvolution gi samme datakvaliteten og dermed utvide brukbarheten av protokollen. I tillegg kan den samme stainings brukes til å fastsette subcellular distribusjon, for eksempel med super-oppløsning mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Irmgard Weiss for utmerket kundestøtte. Forfatterne bekrefter støtte av Hermes Pofantis og Andoniya Petkova. Forfatterne takker også europeiske nevrovitenskap Institutt for bruken av LSM800 og teknisk assistanse, spesielt av Dr. Nils Halbsgut. Dette arbeidet ble finansiert av University Medical Center Göttingen. JSV erkjenner støtte av Center for nanoskala mikroskopi og molekylære fysiologi av hjernen (CNMPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
