Summary
Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.
Abstract
De aanwezigheid, afwezigheid of niveaus van specifieke synaptic eiwitten kunnen ernstige synaptische transmissie beïnvloeden. Naast het ophelderen van de functie van een eiwit, is het belangrijk om ook de verdeling ervan. Hier beschrijven we een protocol met immunofluorescentie, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse om te bepalen van de verdeling van de synaptische proteïne verhuizer (ook wel TPRGL of SVAP30 genoemd). We vergelijken de verdeling van de Mover met die van de synaptische vesikel eiwit synaptophysin, waardoor het bepalen van de verdeling van de Mover op een kwantitatieve manier ten opzichte van de overvloed van synaptische vesikels. Deze methode kan met name mogelijk worden uitgevoerd als u wilt toestaan voor de vergelijking van de verdeling van eiwitten met verschillende antilichamen of microscopen of over verschillende studies. Onze methode omzeilt de inherente variabiliteit van immunefluorescentie technieken door de opbrengst van een verhouding in plaats van absolute fluorescentie niveaus. De methode die we beschrijven, kunnen bovendien de onderzoeker voor het analyseren van de verdeling van een eiwit op verschillende niveaus: van hele hersenen segmenten hersengebieden aan verschillende deelgebieden in één hersenen gebied, zoals de verschillende lagen van de hippocampus of sensorische cortices. Verhuizer is een gewerveld dier-specifieke eiwit dat is gekoppeld aan de synaptische vesikels. Met deze methode, laten we zien dat de Mover is ongelijkmatig verdeeld over de hersengebieden, met hoge niveaus in het ventrale pallidum, de septal kernen en de amygdala en ook binnen één hersengebieden, zoals de verschillende lagen van de hippocampus.
Introduction
Communicatie tussen de neuronen gebeurt op gespecialiseerde contact sites synapsen genaamd. Synapsen bevatten een groot aantal verschillende eiwitten die orkestreren van synaptische transmissie. Sommige van deze eiwitten Toon een heterogene distributie in het zenuwstelsel en zijn niet aanwezig in elke synapse1. Een voorbeeld van een dergelijke eiwitten is Munc13, die bij het proces van de priming van synaptische vesikels betrokken is. Er zijn verschillende isoforms van Munc13, die zijn ongelijkmatig verdeeld in de hersenen2, en de aanwezigheid of de afwezigheid van specifieke isoforms kunt beïnvloeden op korte termijn synaptische plasticiteit en synaptische vesikel dynamics3, 4 , 5. Daarom is het van vitaal belang voor zitten kundig voor de aanwezigheid van verschillende synaptic eiwitten over hersengebieden identificeren.
De methoden van keuze voor kwantificering van synaptic eiwitten - tot dusver - zijn massaspectrometrie en westelijke bevlekken, in plaats van immunohistochemistry6,,7,,8,9. In sommige gevallen zijn verschillende methoden gebruikt als aanvulling op elkaar om te beoordelen van zowel het aantal en de lokalisatie van specifieke proteïnen (d.w.z.Wilhelm, et al.. 10). de methode we hier beschrijven voorziet de lokalisatie en de kwantificering van proteïnen van belang zonder de noodzaak van het gebruik van elke biochemische methode, gewoon dienst immunefluorescentie technieken. Een ander voordeel hier is dat de kwantificering kan worden gedaan over gebieden veel kleiner, verwezenlijkt en derhalve, meer specifiek, dan die door andere methoden. Echter moet men rekening houden dat een betrouwbare referentie-eiwit nodig is om te beoordelen van de verdeling van de proteïne van belang.
Fluorescerende vlekken door immunohistochemistry stelt ons in staat om routinematig de lokalisatie van eiwitten over hersengebieden alsook binnen verschillende neuronale compartimenten. Ter identificatie van de verschillende compartimenten, worden specifieke markers gebruikt. Typisch, antilichamen tegen synapsin en synaptophysin11 kunnen worden gebruikt om te etiketteren van synaptische vesikels, terwijl antilichamen tegen fagot label de actieve zone van een presynaptische terminal12. Vesiculaire vervoerders, zoals de vesiculaire glutamaat vervoerders (vGluT) of vesiculaire GABA vervoerder (vGAT), worden gebruikt voor het label excitatory13 en remmende14 presynaptische terminals, respectievelijk. Aan de postsynaptisch kant, kunnen antistoffen tegen het eiwit Homer worden gebruikt om te markeren postsynaptisch terminals en antilichamen tegen postsynaptisch dichtheid eiwit 95 (PSD95)15,16,17 of gephyrin18 , 19 , 20 kan respectievelijk excitatory of remmende postsynaptisch terminals, label. Met behulp van antilichamen tegen een proteïne van belang en markeringen zoals degene hierboven beschreven, kan men de lokalisatie van dergelijke eiwitten bepalen. Veel studies tot nu toe hebben gedaan in een kwalitatieve wijze21. Echter om te bepalen op een betrouwbare manier de differentiële verdeling van een specifieke synaptic proteïne, moet een niet alleen bepalen de aanwezigheid of afwezigheid maar ook haar relatieve concentratie. De heterogeniteit van grootte en bevolkingsdichtheid van synapsen is het belangrijk om een verhouding tussen de synaptische markering en de proteïne van belang. Anders, synapse-rijke regio's zoals de niet-piramidale lagen van de hippocampus en de moleculaire laag van het cerebellum zal tonen een hoge dichtheid van synaptic eiwitten, alleen als gevolg van de hogere dichtheid van synapsen maar niet als gevolg van een sterke aanwezigheid van deze eiwitten in elke synapse (b.v., Wallrafen en Dresbach1). Aan de andere kant, zal eiwitten in de neuronale soma (b.v., TGN3822) meestal sterke aanwezigheid in de hippocampal piramidale cellaag of hippocampal of cerebellaire submodule cellaag vanwege de hoge concentratie van neuronale cel organen weergeven in die gebieden. Deze niet-homogene verdeling van structuren, synapses daarom in dit geval, kan leiden tot een valse raming van de verdeling van de proteïne van belang zelf. Bovendien is er een intrinsieke variabiliteit in intensiteiten in verschillende steekproeven in technieken immunohistochemische kleuring. Het protocol beschreven hier houdt dit rekening en vermijdt dergelijke vooroordelen, evenals andere beperkingen die voortvloeien uit de immunohistochemische methoden.
In onze recente studie, wij hebben gebruikte deze methode voor het beschrijven van de differentiële expressie van Mover (ook wel TPRGL23 SVAP3024) over 16 verschillende hersenen gebieden1. Verhuizer is een gewerveld dier-specifieke synaptic eiwit dat kan worden gevonden in associatie met synaptische vesikels en invloeden van de neurotransmitter release25,26,27. We hebben de Mover uitdrukking aan de overvloed van synaptische vesikels, gerelateerde door kleuring voor synaptophysin als merkstof referentie synaptic blaasje. We vonden de hoge niveaus van de Verhuizer van met name in de septal kernen, de ventrale pallidum en de amygdala. Binnen de hippocampus vonden we een heterogene verdeling van de Mover, met hoge niveaus in de lagen die zijn gekoppeld aan de intra-hippocampal berekening, en lage niveaus in de input- en output lagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol geen experimenten op levende dieren. Experimenten met euthanizing van dieren naar het verkrijgen van de hersenen monsters werden goedgekeurd door de bescherming van de dieren van de lokale autoriteiten (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) onder het goedkeuringsnummer T 10/30.
Opmerking: Voor dit protocol, 3 volwassen mannelijke C57BL/6 muizen werden gebruikt.
1. de monstervoorbereiding
- Bereiden fixeer en 0,1 M fosfaatbuffer (PB; Zie tabel 1).
- Monteren van het dier door transcardial perfusie, zoals beschreven in Gage et al. 28. eerst wassen het bloed met 0,9% NaCl-oplossing, dan perfuse met 30 mL 4% paraformaldehyde (PFA).
- Open de schedel met een schaar en zorgvuldig het isoleren van de hersenen met behulp van een lepel met stompe randen om te voorkomen beschadiging van het weefsel.
- Vullen van een tube van 50 mL reactie met fixeer en de hersenen in 4% postfix PFA bij 4 ° C's nachts.
- Verwijder de fixeer en wassen van de hersenen in 50 mL 0,1 M PB op een shaker voor 30 min.
- Na het wassen, Incubeer de hersenen in een 50 mL reactiebuis in 30% sacharose in 0,1 M PB gedurende 48 uur of totdat het zinkt in de buis bij 4 ° C voor cryoprotection.
- Versiering van de hersenen van cryoprotected met een scherp mes, plaatst u deze in een cryomold en insluiten met optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde. Vermijd bellen. Oriënteren van de hersenen en het bevriezen van de cryomold in de vriezer-80 ° C.
- Monteer het bevroren weefsel voor segmenteren. Equilibreer het weefsel aan de cryomicrotome temperatuur gedurende ten minste 15 minuten voordat het segmenteren.
- Het gedeelte van de hersenen in 25 µm dik coronale plakjes. Raak de LGO zorgvuldig met een glas haak zonder het aanraken van het hersenweefsel. 3 aangrenzende segmenten per putje in een 24 goed bord verzamelen en bewaren ze in 0,1 M PB bij 4 ° C tot vlekken.
Opmerking: Het protocol kan worden gepauzeerd hier voor maximaal twee weken. Langere opslag tijden kunnen interfereren met de kwaliteit van het weefsel en dus invloed op de uitkomst van het experiment.
2. immunofluorescentie
- Bereiden van oplossingen, waaronder de buffer met blokkerend, antilichaam buffer, wassen van de buffer 1 en wassen buffer 2 (Zie tabel 1).
- Spoel segmenten eenmaal met PB te verwijderen overtollige OCT.
- Verwijder de oplossing met een plastic pipet zonder zuigen in de segmenten van de hersenen. Voeg 250 µL van verse PB met een 1000 µL pipet.
Let op: Segmenten moeten niet uitdrogen, dus verwijderen en toevoegen van vloeistoffen goed door goed.
- Verwijder de oplossing met een plastic pipet zonder zuigen in de segmenten van de hersenen. Voeg 250 µL van verse PB met een 1000 µL pipet.
- Verwijder de PB met een plastic pipet en voeg 250 µL van buffer met blokkerend per putje met een 1000 µL pipet. Incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur (RT) op het schudapparaat.
- Tijdens de incubatietijd, Verdun de primaire antilichamen in antilichaam buffer in een reactiebuis. Gebruik van 250 µL antilichaam buffer per putje en voeg de juiste hoeveelheid antilichaam (Zie tabel 2) waarbij het direct in de oplossing met behulp van een precisiepipet 2 µL eveneens. Meng de oplossing door zachtjes op en neer meermaals pipetteren. Vortex kort daarna opgeven, zodat de juiste mengen.
Opmerking: Om te bepalen van de achtergrond fluorescentie, technieken moet ook worden uitgevoerd zonder toevoeging van het primaire antilichaam. Incubeer het segment in antilichaam oplossing zonder primaire antilichamen volgens het protocol daarvoor. - Nadat de incubatietijd, verwijdert u de buffer met blokkerend met een plastic pipet en voeg 250 µL van antilichaam oplossing met primaire antilichamen per putje. Incubeer segmenten met primair antilichaam 's nachts bij 4 ° C op een shaker.
- Volgende dag wassen de segmenten met het wassen van de buffer 1 3 x voor 10 min op RT op een shaker.
- Verwijder het medium met een plastic pipet en voeg 300 µL per putje buffer 1 te wassen. Incubeer bij RT gedurende 10 min. Herhaal 3 keer.
- Verdun de fluorophore-coupled secundaire antilichamen in antilichaam buffer in een reactiebuis tijdens de stappen wassen. Gebruik van 250 µL antilichaam buffer per putje en voeg de juiste hoeveelheid antilichaam (Zie tabel 2) waarbij het direct in de oplossing met behulp van een precisiepipet 2 µL eveneens. Meng de oplossing door zachtjes op en neer meermaals pipetteren. Vortex kort daarna opgeven, zodat de juiste mengen.
Let op: Omdat de antilichamen lichtgevoelig zijn, moeten alle stappen vanaf dit punt worden uitgevoerd in het donker. - Na het wassen stappen, verwijder het wassen met een plastic pipet buffer en voeg 250 µL van antilichaam oplossing met secundaire antilichamen per putje. Incubeer de plakjes met secundair antilichaam voor 90 min op de RT in het donker.
- Wassen van de segmenten met het wassen van buffer 2 3 x voor 10 min op RT.
- Tijdens de stappen wassen, Verdun 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in 0,1 M PB in een concentratie van 1:2000.
- Verwijder de wassen buffer 2 met een plastic pipet en voeg 250 µL van DAPI oplossing per putje. Incubeer gedurende 5 min op RT op het schudapparaat.
- Verwijder de DAPI-oplossing met een plastic pipet en voeg 500 µL van 0,1 M PB per putje met een 1000 µL pipet.
- Segmenten op Microscoop-dia's koppelen.
- Plaats een microscoopglaasje onder de stereoscoop. Met een fijne borstel, voeg drie afzonderlijke druppels van 0,1 M PB in de dia verschijnt. Plaats één segment per druppel op het microscoopglaasje.
- Gebruik de fijne borstel afvlakken en oriënteren van de segmenten op het microscoopglaasje.
- Als alle segmenten correct zijn geplaatst, verwijderen van overtollige PB met een tissue en droog de dia zorgvuldig.
Let op: Vermijd de segmenten van de hersenen volledig drogen. - Voeg 80 µL van het medium in de dia insluiten. Zorgvuldig lager het dekglaasje aan in de dia verschijnt, waardoor de hersenen segmenten te embedding.
- Laat de dia's in de zuurkast gedurende 1-2 uur drogen (behandelen hen Voorkom blootstelling aan licht) en bewaar ze in een Microscoop dia doos bij 4 ° C.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
3. beeldvorming
- Nadat het insluiten medium volledig gehard is, plaatst u het microscoopglaasje onder de confocal microscoop.
Opmerking: Epifluorescence microscopie in combinatie met deconvolutie software moet soortgelijke beeldkwaliteit opleveren. - De laser-instellingen aanpassen door vergroten of verkleinen van de intensiteit van de laser voor elk kanaal, zodat enkele pixels zijn overbelicht om ervoor te zorgen maximale verspreiding van grijze waarden.
- Verwerven van virtuele weefsels van het hele brein segment voor de verschillende kanalen.
- In de denkbaar software (Zie Tabel of Materials), selecteert u de optie van de tegels en het segment van de hersenen met de Tegel regio Setuphandmatig af te bakenen.
- Steunpunten in de hele regio tegel verspreiden en aanpassen van de focus voor de verschillende steunpunten door op te drukken Controleren of tegel regio's / posities...
- Pas de instellingen in de Acquisitie modus volgens de gewenste resolutie en bestandsgrootte van de resulterende afbeelding en de scan starten.
- Wanneer de scan is voltooid, de Stitching functie gebruiken voor het verwerken van het virtuele weefsel. Het bestand exporteren als een TIF met de functie Afbeelding exporteren.
4. computer-gebaseerde analyse
- Alle interne kanalen voor één afbeelding in FIJI29 door te klikken op bestand laden | Open.
- Met het gereedschap Freehand bakenen een halfrond in de DAPI-kanaal. Maak een masker van de selectie door te klikken op bewerken | Selectie | Masker maken.
- Bepalen van de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor de enkele kanalen (Mover en synaptophysin) door te klikken op analyseren | Maatregel.
Opmerking: Zorg ervoor dat de verschillende kanalen om te bepalen van de gemiddelde fluorescentie intensiteitswaarden voor elk kanaal te selecteren. - De intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor de enkele kanalen naar een werkblad kopiëren.
- Bepalen de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor de enkele kanalen in een gebied van belang door het gebied ook met het gereedschap Freehand selecteren uitgezet. Een muis hersenen atlas gebruiken als referentie.
- Herhaal stap 4.1-4.5 voor alle hemisferen en alle gebieden van belang.
Opmerking: De waarden voor elk halfrond afzonderlijk bepalen om later vergelijken de waarden in een gebied van belang dat in het halfrond (zie stap 5.2).
5. de gegevensverwerking
- In het geval dat de achtergrond fluorescentie is hoog (Zie discussie), een achtergrond aftrekken nodig zou zijn. Daarvoor, bepalen de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor het segment worden verwerkt zonder primair antilichaam tegen het referentie-eiwit (hier: synaptophysin) en die waarde van alle waarden die zijn verkregen voor de hersengebieden en halfrond aftrekken.
- Wanneer de gemiddelde fluorescentie intensiteiten voor de enkele kanalen voor elke halfrond en elk gebied van belang zijn vastgesteld (Zie tabel 3), de Mover in verhouding tot de synaptophysin door de waarde voor de Mover te delen door de waarde voor synaptophysin (berekenen geel in tabel 3). Deze actie uitvoeren voor elk halfrond en elk gebied van belang afzonderlijk.
- Verdeel de verhouding voor een interessegebied verkregen door de verhouding tussen de verkregen voor het overeenkomstige halfrond (oranje in tabel 3) om te bepalen van de verhouding van het gebied van belang zijn voor het halfrond.
- Om te bepalen van de relatieve Mover overvloed, vertalen de verhouding tussen de verkregen in 5.2 in een percentage door haar afwijking van 1 (rood in tabel 3). Een ratio van 1,25 zou daarom een relatieve Mover overvloed van 25% boven het gemiddelde, en een verhouding van 0,75 een relatieve Mover overvloed van 25% onder het gemiddelde zou opleveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vertegenwoordiger kleuring patronen van verschillende markers te zien in Figuur 1. Het patroon is afhankelijk van de verdeling van het eiwit. Voorbeelden van vijf rostro-caudal niveaus worden weergegeven in kolommen (A)-(E). Een representatieve DAPI kleuring wordt weergegeven in de eerste rij: DAPI houdt vast aan het DNA van een cel en dus kernen zijn gekleurd. Dit resulteert in een punctate patroon. Regio's met een hoge celdichtheid zijn helderder dan de regio's met lage cel dichtheden. Een voorbeeld van een ongelijkmatig verdeelde eiwit kan worden gezien in de tweede rij. De Verhuizer kleuring onthult een differentiële distributie in de hersenen, met heldere hotspot en dimmer gebieden. In de derde rij ziet u een voorbeeld voor de meer homogeen verdeelde referentie markering synaptophysin. Een overlay van de twee eiwitten (vierde rij) toont de differentiële verdeling van de Verhuizer (rood) in vergelijking met de marker eiwit synaptophysin (groen).
Figuur 2 toont de kwantificering beschreven in stap 4 van het protocol. Getoond worden de intensiteitswaarden van de gemiddelde fluorescentie voor de verschillende kanalen over de hemisferen (Mover Figuur 2A, synaptophysin, Figuur 2B) en over de gebieden van belang (Mover, Figuur 2C; synaptophysin, Figuur 2D). Om te bepalen van de Mover overvloed ten opzichte van het aantal synaptische vesikels, wordt een verhouding gehouden met de waarden van de fluorescentie Mover synaptophysin fluorescentie waarden. Deze ratio's voor de gebieden van belang worden weergegeven in Figuur 2E, en al een indicatie geven van de heterogene verdeling van de Mover, met gebieden met hoge en lage Mover niveaus ten opzichte van synaptische vesikels. Om te compenseren bovendien de inherente technische variabiliteit, is de verhouding in een gebied van belang (Figuur 2E) vergeleken met die in het halfrond (niet afgebeeld) en vertaald in een percentage. Deze relatieve Mover overvloed (Figuur 2F) geeft een maat voor hoeveel Mover is aanwezig in een gebied van belang ten opzichte van gemiddelde.
Zoals hierboven vermeld, is een van de grote voordelen van deze techniek de mogelijkheid om de overvloed van de proteïne van belang in zeer kleine gebieden, zelfs subregio's en lagen van de gebieden van belang. Een voorbeeld van deze toepassing is weergegeven in Figuur 3, waar de relatieve Mover overvloed werd vastgesteld voor de verschillende lagen in de deelgebieden van de hippocampus. De kwantificering in de verschillende lagen weergegeven in Figuur 3D, Figuur 3Fen Figuur 3H komt overeen met de lagen weergegeven in Figuur 3C, Figuur 3Een Figuur 3G, met de bijbehorende kleuren. Binnen de hippocampus, is Mover ongelijkmatig verdeeld zijn, met een Mover hoge ten opzichte van synaptische vesikels in lagen die zijn gekoppeld aan de intra-hippocampal berekening (dat wil zeggen, de polymorf laag getand gyrus [DG], stratum radiatum, Lucidum en oriens van Cornu Ammonis 3 [CA3], stratum radiatum en oriens van Cornu Ammonis 1 [CA1]), en lage niveaus in de input- en output lagen (de binnenste en buitenste moleculaire laag van DG, de piramidale cel lagen van CA3 en CA1, en de stratum lacunosum-moleculare van CA1).
Figuur 1 : Representatief immunofluorescentie beelden van de DAPI (eerste rij), verhuizer (tweede rij), synaptophysin (derde rij), en hun overlay (vierde rij, verhuizer in rood, synaptophysin in het groen) op de 5 rostro-caudal niveaus (A-E). Gebieden van belang zijn in grijs in de bovenste rij van panelen grijs weergegeven. M1, primaire motorische cortex; IoC, eilanden van Calleja; ACC, anterior cingularis cortex; SNu, septal kernen; VPa, ventrale pallidum; NuA, nucleus accumbens; CP, Spiegelse putamen; S1, primaire Somatosensorische cortex; HC, hippocampus; Ben, amygdala; MHa, mediale habenula; PAG, Periaqueductale grijs; SN, substantia nigra; VTA, ventrale tegmental gebied; MLC, moleculaire laag van het cerebellum; GLC, granulaire laag van het cerebellum. Schaal bar = 500 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Wallrafen en Dresbach1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Kwantificering van de Verhuizer van de verdeling over de 5 rostro-caudal niveaus. Betekent dat de intensiteit van de fluorescentie van het signaal van de Verhuizer (A) en het synaptophysin signaal (B) op de verschillende niveaus. Intensiteit van de fluorescentie van het signaal van de Verhuizer (C) en het synaptophysin signaal (D) betekenen op de 16 handmatig afgebakende hersengebieden. (E) ratio's voor de Mover en synaptophysin in de 16 hersengebieden van belang. (F) kwantificering van de relatieve Mover overvloed, verhuizer/synaptophysin verhouding op de respectieve regio aan de verhouding van de overeenkomstige halfrond te vergelijken. M1, primaire motorische cortex; IoC, eilanden van Calleja; ACC, anterior cingularis cortex; SNu, septal kernen; VPa, ventrale pallidum; NuA, nucleus accumbens; CP, Spiegelse putamen; S1, primaire Somatosensorische cortex; HC, hippocampus; Ben, amygdala; MHa, mediale habenula; PAG, Periaqueductale grijs; SN, substantia nigra; VTA, ventrale tegmental gebied; MLC, moleculaire laag van het cerebellum. Zwarte stippen vertegenwoordigen enkele gegevenspunten. Balken geven de gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Dit cijfer is gewijzigd van Wallrafen en Dresbach1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Mover distributie in de hippocampus muis. Immunofluorescentie technieken van coronale segmenten van de hippocampus muis. Overzicht van de hippocampus tonen de heterogene Mover-expressiepatroon (A) en de bijbehorende Synaptophysin kleuring (B). De drie gewesten van belang (DG, Figuur 3C; Ca3, Figuur 3E; Ca1, Figuur 3G) zijn met witte stippellijnen afgebakend. (D,F,H) Kwantificering vergelijken de verhouding in de respectieve lagen aan de verhouding van de overeenkomstige halfrond. De kleuren in de staafdiagrammen komen overeen met de respectieve arcering in panelen, C, Een G. Verhuizer expressie is hoog in verband met intra-hippocampal berekening (dat wil zeggen, de polymorf laag van DG, radiatum van stratum lucidum en oriens CA3, en stratum radiatum en oriens van CA1) en laag in de belangrijkste input- en output lagen (de niveaus binnenste en buitenste moleculaire laag van DG, de piramidale cel lagen van CA3 en CA1, en de stratum lacunosum-moleculare van CA1). OML, moleculaire buitenlaag; IML, moleculaire binnenlaag; GrL, granulaire laag; PmL, polymorf laag/hilus; Ja, stratum oriens; Spion, stratum pyramidale; SLu, stratum lucidum; SR, stratum radiatum; SLM, stratum lacunosum-moleculare. Schaal bar = 500 µm. zwarte stippen vormen enkele gegevenspunten. Balken geven de gemiddelde ± SEM. Dit cijfer is gewijzigd van Wallrafen en Dresbach1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: Oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
Tabel 2: Antilichamen die in dit protocol worden gebruikt.
Tabel 3: Voorbeeld van gegevensverwerking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode hier beoogt het kwantificeren van de distributie van een proteïne van belang ten opzichte van de overvloed van een marker eiwit met een bekende verdeling gepresenteerd. Immunofluorescentie kleuring prima overweg met een hoge variabiliteit van kleuring intensiteiten tussen verschillende segmenten. De hier beschreven aanpak van de kwantificering omzeilt dit probleem door het bepalen van de verhouding van de proteïne van belang zijn voor het gemiddelde over het halfrond. Daarom verschillende kleuring intensiteiten in segmenten zijn teniet gedaan en zorgen voor een kwantitatieve beschrijving.
Zoals met elke immunofluorescentie protocol, kwalitatieve of kwantitatieve, kunnen verschillende factoren invloed hebben op het succes en daarmee het verwarren van de analyse. Daarom moet bijzondere aandacht uitgaan naar kritische stappen van het protocol. Ten eerste is een goede vastlegging van het weefsel nodig. Deze fixatie kan meestal worden bereikt door een succesvolle transcardial perfusie. De kwaliteit van de perfusie kan worden geverifieerd door het controleren van de lever kort na het wassen uit het bloed. Een eerste indicator voor een succesvolle perfusie is het zuiveren van de lever en extremiteiten28. De aanwezigheid van bloedstolsels kunt aangeven dat de perfusie zou te traag zijn geweest en sneller volgende keer moet worden uitgevoerd. Sommige eiwitten vereisen verschillende fixatie protocollen, zoals chemische fixatie met PFA epitoop blokkade30kan veroorzaken. In dit geval moet bevriezen fixatie of fixatie met een verschillende chemische stof, zoals methanol, worden overwogen. Ten tweede, na afdelen is het essentieel om de segmenten van de hersenen als snel mogelijk, bij voorkeur op dezelfde of de volgende zeggen vlek. Langere opslag in PB kan leiden tot bacteriële infectie, en terwijl het toevoegen van NaN3 kunt voorkomen dat dit tot op zekere hoogte, de kwaliteit van het weefsel meestal verslechtert met opslagtijd. In de derde plaats tijdens de kleuring procedure is het belangrijk stappen wassen goed-door-goed om te voorkomen dat het drogen van de segmenten. Wanneer de plakjes uitdrogen, kunt achtergrond fluorescentie verhogen en zo een vooroordeel te veroorzaken in de analyse. Ten vierde, na toepassing van het secundaire antilichaam, het is essentieel voor het uitvoeren van alle volgende stappen uit in het donker. De fluorophores zijn lichtgevoelig, en blootstelling aan licht kan het signaal van de fluorescentie ernstig verstoren.
De optimalisatie van de kleuring procedure, waaronder de selectie van voldoende primaire en secundaire antilichamen, optimale antilichaam concentratie en de tijd van de expositie, is een eerste vereiste om de beste signaal-/ ruisverhouding en het verrichten van een betrouwbare analyse van de kwantitatieve immunofluorescentie. Antistoffen gecontroleerd in knock out weefsel moet de voorkeur, zij het niet altijd beschikbaar. Zorg er altijd voor het uitvoeren van de juiste controle experimenten om uit te sluiten van Overspraak tussen verschillende antilichamen. De hoeveelheid fluorescentie van de achtergrond die voortvloeien uit autofluorescence en aspecifieke binding van het secundaire antilichaam kan worden geschat door imaging de segmenten waarin het primaire antilichaam niet werd toegepast. Het is niet triviaal om vast te stellen hoeveel hoger de intensiteit van het signaal moeten in vergelijking met de achtergrond van een aanvaardbaar signal-to-noise verhouding hebben. Nochtans, op basis van empirische waarnemingen, de auteurs zou voorstellen gericht voor het feit dat een signaal op zijn minst 2-fold sterker dan achtergrond om de eiwit verdeling betrouwbaar te schatten. In het geval dat de achtergrond fluorescentie hoog (zonder de aanwezigheid van het primaire antilichaam) onder controle is, moet de gemiddelde achtergrond fluorescentie worden afgetrokken van de beelden van het experiment.
Het grote voordeel van onze aanpak is de interne verwijzing: de intensiteit van de immunofluorescentie van het target-eiwit (d.w.z., Mover) in een gebied van belang is ten opzichte van een referentie-marker (dat wil zeggen, synaptophysin) en de algemene intensiteit van deze proteïnen over het gehele halfrond. Dus, uit de berekening die we uitvoeren, kan ondubbelzinnig worden geconcludeerd dat de overvloed van het target-eiwit is x hogere/lagere vouwen in een bepaalde regio van belang dan de overvloed van het referentie-eiwit ten opzichte van de verdeling van de eiwitten in de gehele halfrond op dit niveau ten opzichte van Bregma31. Dit zorgt voor de vergelijking van resultaten met verschillende antilichamen, verschillende microscopen, of zelfs binnen verschillende studies. Deze samenhang tussen verschillende monsters komt uit de vergelijkende aard van deze methode: variabiliteit wordt gecompenseerd door het nemen van de verhouding tussen de fluorescentie op het gebied van belang en dat van het halfrond. Daarom zijn de verschillen in absolute waarden die voortvloeien uit technische verschillen tenietgedaan. Een ander groot voordeel van deze techniek is het feit dat de gebieden van belang zo klein zijn kunnen als u laten worden wilt, alleen beperkt door de resolutie van de Microscoop. Kwantificeren eiwitniveaus met biochemische methoden, vereist bijvoorbeeld Western Blot of massaspectrometrie6,7,8,9, een dissectie van het weefsel in het gebied van belang. Dit dissectie is moeilijk voor regio's van de hersenen, zoals de primaire Somatosensorische cortex, en vrijwel onmogelijk wordt bij het streven voor deelgebieden, zoals de verschillende lagen van de cortex of de hippocampus.
Een waarschuwing van de aanpak is dat de verschillende niveaus in de hersenen niet rechtstreeks met elkaar worden vergeleken. Halfrond met vele regio's rijk aan de proteïne van belang zal hebben een andere gemiddelde waarde dan hemisferen met slechts paar eiwitrijke regio's. Waarden van 20% boven het gemiddelde, bijvoorbeeld, zal daarom weerspiegelen een verschillende absolute hoeveelheid eiwit in één niveau ten opzichte van Bregma ten opzichte van een tweede. Men moet in gedachten houden zo goed dat deze methode niet mogelijk de gehaltebepaling absolute eiwit, alleen de relatieve overvloed ten opzichte van de interne referentie-markering en het gemiddelde over het halfrond.
Deze methode kan worden eenvoudig aangepast aan het bepalen van de verdeling van de proteïne van belang ten opzichte van de markers voor verschillende neuronale compartimenten, niet alleen presynaptische sites. Ook kan het gemakkelijk aan te passen voor weefsels dan de hersenen en - met geschikte antilichamen - andere modelsystemen dan muizen32,33. Terwijl het gebruik van een confocal microscoop de auteurs methode van keuze is, moet een combinatie van epifluorescence microscopie en deconvolutie software opleveren van de dezelfde kwaliteit van de gegevens en zo de bruikbaarheid van het protocol uit te breiden. Bovendien kan de dezelfde technieken worden gebruikt om te bepalen van de subcellular distributie, bijvoorbeeld met super resolutie microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Irmgard Weiss voor uitstekende technische bijstand. De auteurs erkennen ondersteuning via Hermes Pofantis en Andoniya Petkova. De auteurs bedanken ook het Europees Instituut voor Neurowetenschappen voor het gebruik van de LSM800 en de technische bijstand, met name door Dr. Nils Halbsgut. Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit medisch centrum Göttingen. JSV erkent ondersteuning door het centrum voor Nanoscale microscopie en moleculaire fysiologie van de hersenen (CNMPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
