Summary
ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。
Abstract
有無または特定のシナプス蛋白質のレベル、重度なシナプス伝達に影響を与えます。蛋白質の機能を解明、に加えてまたその分布を決定することが重要です。ここでは、蛍光抗体法、共焦点顕微鏡、シナプス蛋白質 (TPRGL または SVAP30 とも呼ばれます) の発動機の分布を決定するためのコンピュータ ベース解析を用いたプロトコルについて述べる.我々 はシナプス小胞の豊かさに対する定量的方法で発動機の分布の決定によりシナプス小胞タンパク質シナプトフィジンの発動機の分布を比較します。特に、このメソッドは、異なる研究内または異なる抗体または顕微鏡を用いたタンパク質の分布の比較を許可する実装潜在的可能性があります。本手法は、絶対蛍光レベルではなく、比率を生成することによって蛍光染色の固有の変動を回避できます。また、述べるメソッドにより、さまざまなレベルでのタンパク質の分布を分析する研究者: 海馬のまたは感覚の異なるレイヤーなどの一つの脳領域で異なるサブ領域に脳を全脳スライスから野。Mover は、シナプス小胞に関連付けられている脊椎動物に固有のタンパク質です。この方法では、頭脳区域、扁桃体、中隔核、腹側フトゲツツガムシとまた海馬の異なる層などの単一の脳領域内で高レベルの分散不均一の発動機を紹介します。
Introduction
ニューロン間の通信は、シナプスと呼ばれる特殊な接触部位で発生します。シナプスには、無数組み合わせによって、シナプス伝達の異なった蛋白質にはが含まれています。それらの蛋白質のいくつかは神経系全体の不均質分布を示しシナプス1には存在しません。そのような蛋白質のための 1 つの例は Munc13 は、シナプス小胞のプライミング プロセスに関与しています。2脳全体に分散不均一、Munc13 の異なるアイソ フォームがあるし、特定のアイソ フォームの存在の有無に影響を与える短期シナプスとシナプス小胞ダイナミクス3,4,5します。 したがって、極めて重要な脳の領域間で異なるシナプス蛋白質の存在を識別することができるためです。
シナプス蛋白質の - 今のところ - 定量化のための選択の方法は、質量分析法とウエスタンブロットというよりも、免疫組織化学6,7,8,9。量と (すなわち、ヴィルヘルムら特定の蛋白質の局在化の両方を評価するためにお互いを補完するためにいくつかのケースでいくつかのメソッドを使用します。10). ここで述べる手法によりローカリゼーションと単に蛍光染色を用いて、生化学的方法を使用を必要とせず興味の蛋白質の定量。ここでもう一つの利点は小さい領域上の定量化を行うことができ、したがって、それらよりも、具体的、他の方法で達成します。ただし、信頼性の高いリファレンス タンパク質が興味の蛋白質の分布を評価するために必要なことを考慮する必要があります。
免疫組織化学的蛍光染色異なる神経細胞コンパートメント内にあるだけでなく、脳の領域にわたって日常的にタンパク質の局在を識別することができます。別のコンパートメントを識別するために特定のマーカーが使用されます。通常、synapsin、シナプトフィジン11に対する抗体はファゴット抗体ラベル シナプス前ターミナル12のアクティブ ゾーン間シナプス小胞のラベルに使用できます。小胞性の GABA トランスポーター vgat (ノックアウト)、小胞グルタミン酸トランスポーター (vGluT) などの小胞輸送は、それぞれ興奮13と14抑制シナプス前ターミナルをラベルに使用されます。シナプス後側、シナプス ターミナルとシナプス後密度タンパク質 95 (PSD95)15,16,17または gephyrin18に対する抗体をマークするホーマー タンパク質に対する抗体を用いることができます。,19,興奮性、抑制性シナプス ターミナルにそれぞれラベル20を使用できます。関心と上述のものなどのマーカー蛋白質に対する抗体を使用して、このようなタンパク質の局在を決定できます。これまで多くの研究は、質的方法21でこれを行っています。ただし、特定のシナプス蛋白質の特異的分布を確実に判断するには、いずれかの必要がありますのみ決定その存在または不在だけでなく、その相対濃度。サイズの不均一性と密度シナプスのシナプス マーカーと興味の蛋白質の比率を確立することが重要になります。海馬の非錐体層、小脳分子層などのシナプスの豊富な地域がシナプス蛋白質、その蛋白の強い存在のためにないが、シナプスの密度が高いためだけの高密度が表示されますそれ以外の場合、それぞれのシナプスは (例えば、Wallrafen および Dresbach の1)。(例えば、TGN3822) 神経細胞体でタンパク質、海馬錐体細胞層や神経細胞の細胞体の高濃度のため海馬や小脳顆粒細胞層で強力なプレゼンスを通常表示する一方、それらの領域。したがって、構造、この非均一に分布はこの場合、シナプス、自体興味の蛋白質の分布の偽の推定につながることができます。さらに、免疫組織化学的染色のサンプル間で強度を染色に本質的な可変性があります。ここで説明されているプロトコルはこれを考慮し、免疫組織化学的方法から生じるその他の注意事項と同様に、そのようなバイアスを回避できます。
私たちの最近の研究は、我々 は 16 異なる脳領域1にわたって Mover (TPRGL23または SVAP3024とも呼ばれます) の差分式を記述するこのメソッドを使用しています。発動機は脊椎動物に固有のシナプス蛋白質シナプス小胞との関連で見つけることができますし、神経伝達物質のリリース25,26,27に影響を与えます。シナプス小胞の豊かさに発動機式シナプス小胞参照マーカーとしてシナプトフィジンの染色関連ている。特に中隔核, 腹側フトゲツツガムシと扁桃体に発動機の高レベルを見つけた。海馬はわかった海馬内計算と入力と出力層の低レベルに関連付けられているレイヤーのレベルが高い、Mover の不均質分布
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Protocol
このプロトコルは、生きている動物実験を行いません。脳サンプルを入手するために動物の安楽死させる実験は、承認番号 T 10/30 の下でローカル動物保護当局 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin ゲッティンゲン) によって承認されました。
注: このプロトコルの 3 の成人男性 c57bl/6 マウスが使用されました。
1. サンプル準備
- 定着剤および 0.1 M のリン酸バッファー (PB;テーブル 1を参照) を準備します。
- ゲージらで説明されているように transcardial 潅流によって動物を修正します。28。 最初 0.9 と血を洗い流す %、食塩を、30 ml の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の灌流。
- ハサミで頭蓋骨を開き、慎重に組織を損傷しないように鈍端のスプーンを使用して脳を分離します。
- 定着剤を 50 mL の反応管を記入し、4% で脳を後置 4 ° c 一晩 PFA。
- 定着剤を取り外して 30 分間シェーカーで 0.1 M PB の 50 mL の脳を洗います。
- 洗浄後、0.1 M PB 48 h またはそれに対する凍害保護作用のための 4 ° C でチューブに沈むまでに 30% ショ糖で 50 mL の反応管で脳をインキュベートします。
- 鋭い刃を持つ cryoprotected 脳をトリム、cryomold に配置し、最適な切削温度 (OCT) 化合物を埋め込みます。泡を避けるため。脳の向きし、-80 ° C のフリーザーで cryomold をフリーズします。
- 区分のための凍結するティッシュをマウントします。区分する前に少なくとも 15 分 cryomicrotome 温度に組織を平衡します。
- 25 μ m の厚切りコロナに脳をセクションします。脳の組織に触れることがなくガラスのフックで慎重に 10 月をタップします。24 well プレートのウェルあたりの 3 つの隣接するスライスを収集し、染色まで 4 ° C で 0.1 M の鉛にそれらを保管します。
注: プロトコルは、2 週間ここで休止できます。長い保存期間は、組織の品質を妨げるでき、従って実験の結果に影響を与えます。
2. 蛍光抗体法
- ブロック バッファー、抗体バッファー、バッファー 1、および洗浄液 2 (表 1参照) を洗浄を含むソリューションを準備します。
- 一度余分な 10 月を削除する PB とスライスをすすいでください。
- 脳スライスの吸引せずプラスチック ピペットとソリューションを削除します。1000 μ L ピペットと新鮮な PB の 250 μ L を追加します。
注意: スライス乾燥しない、だから削除し、水分もを追加します。
- 脳スライスの吸引せずプラスチック ピペットとソリューションを削除します。1000 μ L ピペットと新鮮な PB の 250 μ L を追加します。
- プラスチック ピペットで PB を削除し、250 μ L 1000 μ L ピペットで井戸あたりのブロック バッファーを追加します。シェーカーに室温 (RT) で 3 時間孵化させなさい。
- 培養時間の間に抗体の反応管内のバッファーに一次抗体を希釈します。ウェルあたり 250 μ L 抗体バッファーを使用し、抗体の適切な量を追加 (表 2参照) で 2 μ L ピペットを使用してソリューションに直接ピペッティングします。上下に数回軽くピペッティングして混合します。適切な混合を確実にその後まもなく渦。
注: 背景の蛍光性を決定するには、染色も対象となる一次抗体を追加せず。そのため、プロトコルに従って一次抗体に抗体溶液でスライスをインキュベートします。 - 培養時間後プラスチック ピペットのブロック バッファーを削除し、250 μ L/ウェル一次抗体を含む抗体溶液を追加します。シェーカーで 4 ° C で一晩一次抗体とスライスを孵化させなさい。
- 次の日、洗浄バッファー 1 3 ウォッシュ スライス シェーカーで RT で 10 分の x。
- プラスチック ピペットで培地を取り除き、洗浄液 1 ウェルあたりの 300 μ L を追加します。10 分を繰り返して 3 回 RT で孵化させなさい。
- 洗浄のステップの間に抗体の反応管内のバッファーに fluorophore 共役二次抗体を希釈します。ウェルあたり 250 μ L 抗体バッファーを使用し、抗体の適切な量を追加 (表 2参照) で 2 μ L ピペットを使用してソリューションに直接ピペッティングします。上下に数回軽くピペッティングして混合します。適切な混合を確実にその後まもなく渦。
注意: 抗体光に敏感なので、この時点からのすべてのステップを暗闇の中で実行する必要があります。 - 洗浄ステップの取り外し洗浄バッファー プラスチック ピペットを 250 μ L/ウェル二次抗体を含む抗体溶液を追加後。暗闇の中で RT で 90 分の二次抗体とスライスを孵化させなさい。
- 洗浄液 2 3 とスライスを洗って室温 10 分 x
- 洗浄のステップ中 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 配分の濃度 0.1 M pb を希釈します。
- プラスチック ピペットの洗浄バッファー 2 を削除し、250 μ L/ウェル DAPI 溶液を追加します。シェーカーの RT で 5 分間インキュベートします。
- プラスチック ピペットの DAPI ソリューションを削除し、500 μ L 1000 μ L ピペットとウェルあたり 0.1 M PB を追加します。
- 顕微鏡のスライドには、スライスをマウントします。
- 株分け業顕微鏡スライドを配置します。細かいブラシでスライドに 0.1 M PB の別 3 が値下がりしましたを追加します。顕微鏡スライド ドロップあたり 1 つのスライスを配置します。
- 細かいブラシを使用して、平らにし、顕微鏡のスライド上のスライスを方向づけます。
- すべてのスライスが正しく配置、ティッシュで余分な鉛を削除し、スライドを慎重に乾燥します。
注意: は、脳スライスを完全に乾燥を避けます。 - 埋め込みスライドに媒体の 80 μ L を追加します。脳スライスのそれによって埋め込みスライドに coverslip へ慎重に置きます。
- 発煙のフードに 1-2 時間で乾燥するスライドを残す (光の露出を避けるためにそれらをカバー)、4 ° C で顕微鏡スライドのボックスに保管
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
3. イメージング
- 埋め込みメディアを完全に硬化した後は、共焦点顕微鏡顕微鏡スライドを配置します。
注: デコンボリューション ソフトウェアと落射蛍光顕微鏡は、同様の画像品質を得られるはず。 - グレー値の最大分布を確保するためにいくつかのピクセルが露出するようにすべてのチャネルのレーザー強度を強めたり弱めたりレーザーの設定を調整します。
- 別のチャネルの全脳スライスの仮想組織を取得します。
- イメージング ソフトウェアで (材料の表を参照)、タイルオプションを選択し、手動でタイル領域セットアップと脳スライスを描きます。
- タイル地域全体のサポート ポイントを配布し、確認タイル領域/位置.を押すことによってさまざまなサポート ポイントのフォーカスを調整
- 結果として得られる画像の解像度とファイル サイズによるとアクイジション ・ モードの設定を調整し、スキャンを開始します。
- スキャンが完了したら、仮想組織を処理するのに合成関数を使用します。画像エクスポート機能付き .tif としてファイルをエクスポートします。
4. コンピューター ベースの分析
- フィジー29にファイルをクリックして 1 つのイメージのすべての単一チャネルを読み込む |オープン。
- フリーハンド選択ツール、DAPI チャネルで 1 つの半球を描きます。編集をクリックすると、選択範囲のマスクを作成 |選択 |マスクを作成する。
- 分析をクリックして単一のチャネル (発動機およびシナプトフィジン) の平均蛍光強度を決定 |メジャー。
注: 各チャンネルの平均蛍光強度値を決定する別のチャネルを選択するを確認します。 - 単一チャネルの平均蛍光強度をスプレッドシートにコピーします。
- 関心のある領域の単一チャネルの平均蛍光強度を確認するには、フリーハンド選択ツールでも領域の輪郭を描きます。マウスの脳アトラスを参照として使用します。
- すべての半球および興味のすべての領域に対して、手順 4.1 4.5.
注: 後で半球の関心の領域の値を比較するために、各半球の値を個別に確認 (5.2 を参照)。
5 データ処理
- 蛍光バック グラウンドが高い場合 (ディスカッションを参照)、背景差分が必要になる場合があります。そのためプライマリ参照蛋白抗体なしで処理されるスライスの平均蛍光強度を決定する (ここで: シナプトフィジン) と脳領域と半球で得られたすべての値から値を減算します。
- すべての半球におよび興味のすべての領域の単一チャネルの平均蛍光強度が決定されているとき (表 3を参照)、シナプトフィジン (値 Mover の値で割ってシナプトフィジンに発動機の比率を計算します。表 3では黄色)。別に興味のすべての半球とすべてのこの操作を実行します。
- 半球に関心のある分野の比率を決定する対応する半球 (表3 オレンジ) の比率の関心の 1 つの領域の取得比率に分割します。
- Mover 個体を決定するには、(表 3に赤) 1 からの偏差を決定することによってパーセンテージに 5.2 で得られた比を変換します。1.25 の比率は上記の平均 25% の相対的な発動機の豊かさを与えるだろうしたがってと 0.75 の比率が平均以下 25% の相対 Mover の豊かさをもたらすでしょう。
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Representative Results
染色パターンの別のマーカーの代表は、図 1に見ることができます。パターンは、タンパク質の分布に応じて異なります。5 つの吻尾側レベルの例の列 (A)-(E)。最初の行に示すように、代表的な DAPI 染色: DAPI は細胞の DNA に付着し、従って核が染色します。点状のパターンでこの結果します。高細胞密度の領域は、低細胞密度の領域よりも明るい。不均一分散蛋白質の例は、2 番目の行で見ることができます。染色 Mover は、明るいホット スポット領域と調光器の分野で、脳全体の差分分布を明らかにします。3 番目の行でより均一分散参照マーカー シナプトフィジンの例を示します。2 つの蛋白質のオーバーレイ (4 行目)、差分の分布を示す Mover (赤) マーカー タンパク質シナプトフィジン (緑) と比較して。
図 2は、プロトコルの手順 4 に記載されている数量を示しています。(発動機、図 2A; シナプトフィジン、図 2B) 半球と関心 (発動機、図 2Cの領域全体で別のチャネルの平均蛍光強度の値は、示されています。図 2Dシナプトフィジン)。シナプス小胞の数に比べて Mover 豊かさを判断するには、比率はシナプトフィジン蛍光値 Mover 蛍光値の取られます。関心のある分野のこれらの比率図 2Eで表示され、既に Mover の不均質分布の目安、地域とシナプス小胞を基準にして高低 Mover レベルします。固有の技術的な可変性を補うためにさらに関心 (図 2E) の 1 つの領域の比率は (図示せず) 半球全体と比較して、割合に翻訳します。この相対 Mover 豊富 (図 2F) がどのくらいの発動機のメジャーは平均を基準に関心のある領域に存在。
前述のように、この技術の主な利点の 1 つは非常に小さな領域もサブ領域、関心のある分野の層の興味の蛋白質の豊富なを決定する機能です。このアプリケーションの一例を図 3海馬のサブフィールドの別の層の相対的な発動機の豊かさを求めたに示します。、図 3E、C図 3に示すようにレイヤーに対応する図 3H 図 3F、D図 3に示すように異なるレイヤーの定量化図 3Gで対応する色。海馬内 Mover は不均一分散、海馬内計算 (すなわち、海馬歯状回 [DG] 地層結腸寄生虫の多形のレイヤーに関連付けられているレイヤーのシナプス小胞に対する Mover レベルが高いタペタム オリエンス・ コルニュ Ammonis 3 の [CA3] と地層結腸寄生虫とコルニュ Ammonis 1 [CA1] のオリエンス)、および入力と出力層で低レベル (DG、CA3, CA1 の錐体細胞層の内側と外側の分子層と地層 lacunosum-moleculare CA1 の)。
図 1: DAPI の代表的な蛍光画像 (最初の行)、発動機 (2 番目の行)、シナプトフィジン (3 番目の行) とその 5 つの吻尾レベル (A ・ E) で (4 行目に緑で赤、シナプトフィジンの発動機) をオーバーレイします。関心のある分野はパネルの上段の灰色の網掛け。M1、一次運動皮質;IoC、Calleja; の島々ACC、前帯状皮質;ソウル大学、中隔核;バルプロ酸、腹フトゲツツガムシ;ヌア、側坐核;CP、尾状被殻;S1、一次体性感覚野。Hc、海馬。午前、扁桃体;MHa、内側 habenula;パグ、中脳の灰色;SN、中脳;VTA、腹側被蓋野。MLC; 小脳の分子層GLC、小脳の顆粒層。スケール バー = 500 μ m。この図は、Wallrafen と Dresbach1から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 5 吻尾側レベルにわたって Mover 分布の定量化します。発動機信号 (A) とさまざまなレベルでシナプトフィジン信号 (B) の蛍光強度を意味します。16 手動で線引き脳領域を発動機信号 (C) と (D) シナプトフィジン信号の蛍光強度を意味します。(E) Mover 比と対象 16 脳領域におけるシナプトフィジン。対応する半球の比率をそれぞれの地域で発動機/シナプトフィジン比を比較する相対 Mover 豊かさの定量化を (F)。M1、一次運動皮質;IoC、Calleja; の島々ACC、前帯状皮質;ソウル大学、中隔核;バルプロ酸、腹フトゲツツガムシ;ヌア、側坐核;CP、尾状被殻;S1、一次体性感覚野。Hc、海馬。午前、扁桃体;MHa、内側 habenula;パグ、中脳の灰色;SN、中脳;VTA、腹側被蓋野。MLC、小脳の分子層。黒い点は、単一のデータ ポイントを表します。バーは、平均 (SEM) の平均 ± 標準誤差を表示します。この図は、Wallrafen と Dresbach1から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: マウスの海馬において mover 配布します。マウス海馬スライスをコロナの蛍光染色。異種 Mover 表現パターン (A) と (B) を染色対応するシナプトフィジンを示す海馬の概要です。興味 (DG、図 3Cの 3 つの領域CA3、図 3E;CA1、図 3G) は、白点線で区切られます。(D,F,H)数量は対応する半球の比率をそれぞれの層の比率を比較します。バー グラフの色は、 C E、およびGのパネルにそれぞれの網かけに対応しています。発動機式が関連付けられている (すなわちDG、地層結腸寄生虫、タペタムと、CA3 と地層結腸寄生虫のオリエンスと CA1 のオリエンスの多形層)、海馬内の計算と主な入力 - と出力層 (低レベルの高DG、CA3, CA1 の錐体細胞層の内側と外側の分子層と CA1 の地層 lacunosum moleculare)。OML、外部分子層;IML、内部分子層;GrL、顆粒層;PmL、多形層/門部;従って、地層オリエンス。スパイ、地層属三角骨;SLu、透明層の直下。SR、地層の結腸寄生虫;SLM、地層 lacunosum moleculare。スケール バー 500 μ m の黒いドットを表す単一のデータ ポイントを =。バー表示平均 ± SEM.この図は、Wallrafen と Dresbach1から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1: ソリューションをこのプロトコルで使用されます。
表 2: 抗体はこのプロトコルで使われます。
表 3: データ処理の例。
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Discussion
メソッドは、既知の分布とマーカー蛋白質の豊かさに対する興味の蛋白質の分布の定量化を目指すを紹介しました。免疫蛍光染色染色強度の異なるスライスの間の高い可変性を示すことができます。ここで説明した定量化手法半球間なかに興味の蛋白質の比率を決定することによってこの問題を回避できます。したがって、スライス全体染色強度の違いキャンセルされ、定量的な説明を可能にします。
すべての蛍光抗体のプロトコルと同様質的または量的、いくつかの要因が成功に影響を与える、それにより分析を混同します。したがって、特別な注意はプロトコルの重要なステップに支払われる必要があります。まず、組織の適切な固定が必要です。この固定は、成功 transcardial 潅流によって通常達成できます。灌流の品質は、血を洗った後まもなく肝臓をチェックすることによって確認できます。正常な血流のため最初のインジケーターは肝臓と四肢の28のクリアです。灌流が遅すぎるかもしれないが、次回より高速に実行する必要があります血栓の存在を示したりできます。いくつかのタンパク質は、PFA で化学固定はエピトープ閉塞30を引き起こすことができます異なる固定のプロトコルを必要とします。この場合、凍結固定またはメタノールなど、別の化学物質で固定を考慮する必要があります。第二に、断面後、できるだけ早く、できれば同じまたは次の言うとして脳切片を染色するが重要です。PB での長期保管は、細菌感染してナン3はある程度これを防ぐことができます、組織の品質が通常蓄積時間とともに劣化を追加するときにつながることができます。第三に、汚損プロシージャの中には、スライスの乾燥を避けるために、洗浄手順も重要です。スライス乾燥、背景の蛍光性は増加し、こうして分析にバイアスを引き起こすできます。第四に、二次抗体のアプリケーション後、暗闇の中ですべての次の手順を実行することが重要です。Fluorophores が付いている感光性と光照射蛍光信号を歪めることができる深刻な。
博覧会の時、最適な抗体濃度、適切な第一次および二次抗体の選定など、染色の手順の最適化は、最高の信号対雑音比を達成し、信頼性の高い遂行の前提条件定量的免疫染色解析。とはいえ常に利用できない、抗体が組織をノックアウトで検証は好ましい選択をする必要があります。常に異なる抗体間のクロストークを除外するのには適切な制御実験を行うことを確認してください。一次抗体がかからないスライスをイメージングによる蛍光・二次抗体の非特異的結合から生じる背景の蛍光性の量を推定できます。それはどれだけ高く信号の強度は、許容可能な信号対雑音比を持っているバック グラウンドと比較した場合をする必要があります確立する簡単ではありません。しかし、経験的な観察に基づいて、著者お勧め確実にタンパク質の分布を推定するために、少なくとも倍の背景より強い信号を持っていることを目指してします。背景の蛍光性は制御条件 (一次抗体の有無) で高い、場合平均背景の蛍光性は実験画像から減算する必要があります。
我々 のアプローチの主な利点は、その内部の参照: 参照のマーカー (すなわちシナプトフィジン) との全体的な強度に (すなわちMover) 関心領域のターゲット蛋白質の蛍光強度を比較全体の半球間でこれらの蛋白質。したがって、計算を行いから 1 つはっきりと結論付けることが標的タンパク質の豊かなの x は全体蛋白質の分布を基準にして参照タンパク質の豊富さよりも関心の特定の領域で上位/下位を折り、前31を基準にしてこのレベルで全体の半球。これにより、異なる抗体を用いた結果の比較のため別の顕微鏡、さらにさまざまな研究。このメソッドの比較自然由来の異なるサンプル間で一貫性: 関心のある領域の蛍光と半球の間の比率で変動は補償されます。したがって、技術的な違いから生じる絶対値には無効化します。この手法のもう一つの主な利点は、関心のある分野は顕微鏡の解像度によって制限される、のみたく小さくできるという事実です。生化学的方法で蛋白質のレベルを定量化、たとえば西部のしみまたは質量6,7,8,9, 必要があります興味の領域に組織の郭清。この解剖は一次体性感覚野などの脳の領域のハード、大脳皮質や海馬の異なる層などのサブ領域を目指すときに事実上不可能になります。
アプローチの注意点は、脳のさまざまなレベルを相互に直接比較できないことです。興味の蛋白質の豊富の多くの地域で半球でお越しの際にもいくつかのタンパク質が豊富な領域のみで半球とは異なる平均値。上記の平均 20% の値たとえば、したがって 2 つと比較して前を基準にして 1 つのレベルでのタンパク質の異なる絶対数量が反映されます。このメソッドは、絶対蛋白の定量、半球間で内部参照のマーカーとの平均と比較して相対的な豊かさのみを許可しない注意ください必要があります。
このメソッドは、シナプス前サイトだけではなく別の神経細胞コンパートメントのためのマーカーを基準にして興味の蛋白質の分布を決定するために容易に適応することができます。適切な抗体 - マウス32,33よりも他のモデル システムと - 脳以外の組織のために容易に適応することができます。共焦点顕微鏡の使用は好みの著者のメソッドが、落射蛍光顕微鏡とデコンボリューション ソフトウェアの組み合わせが同じデータの品質をもたらすし、プロトコルのユーザビリティの拡張します。さらに、同じ染色は、超解像顕微鏡法で、例えば、細胞内の分布を決定する使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
私たちは優れたテクニカル サポート サポート ヴァイスシュヴァルツを感謝します。著者は、エルメスの Pofantis と Andoniya Petkova によるサポートを認めます。著者は、LSM800 と技術援助、特に博士ニルス Halbsgut の使用のための欧州の神経科学研究所もありがとうございました。この仕事は大学医療センター ゲッティンゲンで賄われていた。JSV は、顕微鏡によるナノスケールの分子生理学の脳 (CNMPB) センターでサポートを認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
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