Summary
전형적으로, 마우스 넥 주사 모델은 pruritogen 유도된 스크래치 거동을 평가하기 위해 사용된다. 그러나 모델은 통증이 아닌 가려움에 대한 정보만 제공합니다. 여기에서, 뺨 주입 모형은 동시에 고통과 가려움 관련 행동을 측정하기 위하여 이용될 수 있는 마우스에서 소개됩니다.
Abstract
가려움증은 1941년 로스만이 "긁으려는 욕망을 불러일으키는 불쾌한 상처 감각"으로 정의되었습니다. 마우스 모델에서 스크래치 시합은 일반적으로 pruritogens에 의해 유도 된 가려움을 평가 하기 위해 계산 됩니다. 그러나, 이전 보고서는 알지 물질또한 마우스 목 주입 모델에서 긁힘 행동을 유도 하는 것으로 나타났습니다., 스크래킹 행동에 사용 되는 가장 일반적인 테스트는. 이 발견은 마우스에 있는 가려움을 공부하는 것을 어렵게 만듭니다. 대조적으로, capsaicin, 일반적인 algogen, 일부 목 주입 실험에서 긁힘 행동을 감소. 따라서 긁힘 행동에 대한 통증의 영향은 불분명합니다. 따라서 행동 테스트를 사용하여 가려움증과 통증 감각을 동시에 조사하는 방법을 개발할 필요가 있습니다. 여기에서, 뺨 주입 모형은 동시에 고통 및 가려움 관련 행동을 측정하기 위하여 이용될 수 있는 소개됩니다. 이 모델에서, 소양제는 긁힘 행동을 유도하고, 알지 물질은 와이핑 동작을 유도한다. 이 모형을 사용하여, 리소포스파티딕산 (LPA), 가려움증을 가진 담낭 환자에서 찾아낸 가려움중간제는, 독점적으로 가려움을 유도하기 위하여 보이지만 고통이 아닙니다. 그러나, 마우스 모델에서, LPA는 pruritogen 및 algogen 둘 다 보고 되었습니다. 마우스 뺨 주입 모델에서 LPA의 효과에 대 한 조사 는 LPA만 긁힘을 유도 하는 것으로 나타났습니다., 하지만 동작을 닦아. 이것은 LPA가 마우스와 인간에서 유사하게 pruritogen 역할을 한다는 것을 나타내고, 가려움 연구를 위한 뺨 주입 모형의 유용성을 보여줍니다.
Introduction
가려움은 원래 피부 표면에서 유해한 물질을 제거하는 긁힘 행동을 유도하는 감각으로 특징지어졌습니다. 그러나, 가려움증은 아토피성 피부염, 신경성 병변 및 담즙정체1과같은 많은 질병에 의한 불쾌한 감각에 대한 치료법의 초점이었다. 이러한 경우 가려움증은 통증과 유사한 심각한 불쾌한 감각입니다. 따라서, 가려움은 중요한 연구 대상을 나타낸다. 긁힘 행동은 동물 실험에서 가려움증의 주요 지표이며, 스크래칭 행동은 목에 피부에 pruritogens를 주입하여 마우스에서 유도 될 수있다2,3. 그러나, 이전 연구는 capsaicin, algogen, 또한 목 주입 모델4에긁힘 행동을 유도, 어려운이 모델에 통증에서 가려움을 구별 하는 만들기. 대조적으로, capsaicin는 목 주입 모형에 있는 긁는 행동을 감소시켰습니다, 긁는 행동에 고통의 효력이 복잡하고 실험 조건에 달려 있다는 것을 나타내는. 따라서 통증과 가려움 관련 행동을 동시에 측정하면 프리리토겐과 유발 물질의 정확한 분석을 가능하게 할 수 있습니다. 스티븐 G. 시마다와 로버트 H. 라모트는 목에서 뺨으로 주사 부위를 변경하여 통증과 가려움관련 행동을 동시에 측정하는 데성공했습니다 4. 뺨 주입 모델에서, capsaicin 유도 닦아, 하지만 스크래핑 행동, 히스타민 동안, pruritogen, 만 긁는 행동을 유도. 따라서이 모델은 가려움과 통증의 독립적 인 평가를 가능하게하여 뺨 주입을 가려움 연구에 유용한 모델로 만듭니다. 시험 물질이 pruritogen 및/또는 algogen인지 확인하려고 할 때, 이 모형은 목 주입 모형 보다는 더 많은 정보를 제공합니다. 이 문서에서는 뺨 주입을 수행하고 긁힘 또는 닦음의 시합을 계산하기위한 실용적인 방법을 설명하고, 리소포스파티산 (LPA)에 의해 유도 된 긁힘 행동을 평가하기위한이 방법의 유용성을 보여줍니다.
Protocol
동물의 관리 및 사용과 관련된 모든 절차는 국립 자연 과학 연구소 (16A074)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 국립 연구소의 지침에 따라 수행되었습니다. 생리 과학.
참고: 원래 프로토콜은 스티븐 G. 시마다와 로버트 H. LaMotte4에의해보고되었다, 본 보고서는 동물이 서로를 보고에서 동물을 방지하기 위해 화면의 추가를 포함하여 여러 가지 수정과 이러한 방법을 설명, 의 부재 거울, 기록당 마우스 수, 마우스 변형, 케이지 크기 및 기록 시간.
1. 뺨 주입 모델
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실험 준비
- 케이지
- 그림 1과 같이 카메라 아래에 4개의 케이지를 설정합니다. 마우스가 서로를 볼 수 없도록 화면을 설정합니다. 각 케이지에 각 마우스를 넣고 마우스의 탈출을 방지하기 위해 아크릴 뚜껑을 설정합니다. 녹음은 온도, 습도 및 사운드를 제어하는 환경에서 수행되어야 합니다.
참고: 케이지가 충분히 높은 경우 뚜껑 없이 동작을 기록할 수도 있습니다.
- 그림 1과 같이 카메라 아래에 4개의 케이지를 설정합니다. 마우스가 서로를 볼 수 없도록 화면을 설정합니다. 각 케이지에 각 마우스를 넣고 마우스의 탈출을 방지하기 위해 아크릴 뚜껑을 설정합니다. 녹음은 온도, 습도 및 사운드를 제어하는 환경에서 수행되어야 합니다.
- 바늘과 주사기
- 시험 물질의 주입을 위해 0.5 mL 주사기에 부착 된 29G 또는 30G 바늘을 사용하십시오. 시험 물질 용액이 점성이 높은 경우 더 큰 바늘이 필요합니다. 그러나, 큰 바늘 추가 물리적 부작용 을 제기 note 하시기 바랍니다.
참고: 폴리에틸렌 튜브가있는 주사기에 연결된 바늘을 사용할 수 있습니다.
- 시험 물질의 주입을 위해 0.5 mL 주사기에 부착 된 29G 또는 30G 바늘을 사용하십시오. 시험 물질 용액이 점성이 높은 경우 더 큰 바늘이 필요합니다. 그러나, 큰 바늘 추가 물리적 부작용 을 제기 note 하시기 바랍니다.
- 비디오 카메라
- 스크래치 시합 및 지우기 동작을 측정하기 위해 비교적 높은 해상도의 프레임 속도(30-60프레임/s)를 가진 비디오 카메라를 사용합니다.
- 비디오 분석을 위한 소프트웨어
- 비디오 재생 및 분석을 위해 비디오 편집 소프트웨어를 사용합니다. 정확한 분석을 위해서는 빨리 감기 모드와 프레임별 재생 모드가 필요합니다.
- 케이지
그림 1: 비디오 카메라 및 케이지 설정. 아크릴 뚜껑이있는 4 개의 아크릴 케이지가 마우스의 탈출을 방지하고 전염성 가려움을 예방하기위한 스크린이 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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사출 및 기록
- 실험 하루 전에, 머리 깎기로 마우스의 뺨에 모피를 면도(영화 1). 면도하기 전에 마우스를 제지하지 마십시오.
참고: CD-1 또는 C57BL/6 마우스는 주로 이 모델4,5에사용되었다. 이 문서에서는, 남성 6-12 주 오래 된 C57BL/6N 마우스 를 사용 했다. 화학 물질에 대한 민감도는 다양한 마우스 균주3,6,7사이에 다를 수 있습니다. - 면도 후 하루, 기록 조건에 적응하기 위해 1 시간 동안 기록 케이지로 마우스를 이동합니다. 국소 응용 프로그램을 사용하는 경우 이 적응 기간 동안 적용하십시오.
참고: 이 보고서에서, 식염수에 있는 디펜히드라민 염산염 염2%의 10 μL(w/v)을 기록하기 30분 전에 국소적으로 적용하였다. - 케이지 위에 비디오 카메라를 설정하고 시험 물질 주입 전에 비디오 녹화를 시작합니다. 시험 물질의 10 μL 용액을 깨어있는 조건하에서 면도 뺨에 intradermally 주입하십시오(영화 2). 주입 후 마우스를 기록 케이지로 되돌린다.
참고: 이 보고서에서, 50 μg/10 μL 히스타민, 40 μg/10 μL capsaicin 또는 비히클 (7% 트웬티 80 식염수)을 시험 물질로 사용하였다. - 케이지 뚜껑을 닫고 30분 동안 비디오 녹화를 계속합니다.
참고: 총 기록 시간은 실험 조건에 따라 달라집니다.
- 실험 하루 전에, 머리 깎기로 마우스의 뺨에 모피를 면도(영화 1). 면도하기 전에 마우스를 제지하지 마십시오.
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행동 분석
- 스크래치 시합 및 지우기 동작을 각각 계산합니다. 마우스는 뺨을 향해 뒷다리를 올리고 1 초 또는 몇 초에 걸쳐 여러 번 긁힌 다음 다리를 내려 놓습니다. 이 일련의 작업은 하나의 스크래치 시합으로 계산됩니다. 다른 영역의 긁힘은 계산되어서는 안됩니다. 마우스는 닦기 위해 단일 앞다리를 사용하고 그루밍을 위해 두 앞다리를 사용합니다. 이러한 작업은 구별되어야 합니다. 지우기 동작만 통증 관련 동작으로 계산됩니다.
참고: 각 작업은 그림 2, 무비 3, 무비 4및 동영상 5에표시됩니다.
- 스크래치 시합 및 지우기 동작을 각각 계산합니다. 마우스는 뺨을 향해 뒷다리를 올리고 1 초 또는 몇 초에 걸쳐 여러 번 긁힌 다음 다리를 내려 놓습니다. 이 일련의 작업은 하나의 스크래치 시합으로 계산됩니다. 다른 영역의 긁힘은 계산되어서는 안됩니다. 마우스는 닦기 위해 단일 앞다리를 사용하고 그루밍을 위해 두 앞다리를 사용합니다. 이러한 작업은 구별되어야 합니다. 지우기 동작만 통증 관련 동작으로 계산됩니다.
그림 2: 레코딩 하는 동안 일반적인 마우스 활동. 패널 A-C는 오른쪽앞다리(A)를가진 지우기 동작, 오른쪽 뒷다리(B)를 가진 긁힘 동작 및 두 앞다리(C)를 가진 그루밍 동작을 나타내는 그림입니다. 마우스는 뺨을 향해 뒷다리를 올리고 1 초 또는 몇 초에 걸쳐 여러 번 긁힌 다음 다리를 내려 놓습니다. 이 일련의 작업은 하나의 스크래치 시합으로 계산됩니다. 다른 영역의 긁힘은 계산되어서는 안됩니다. 마우스는 닦기 위해 단일 앞다리를 사용하고 그루밍을 위해 두 앞다리를 사용합니다. 이러한 작업은 구별되어야 합니다. 지우기 동작만 통증 관련 동작으로 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 목 주입 모델
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사출 및 기록
- 실험 전날, 약 5% 이소플루란 흡입 후 2-3분 동안 마우스 목덜미의 목덜미에 털을 면도하십시오.
- 면도 후 하루, 기록 조건에 적응하기 위해 1 시간 동안 기록 케이지로 마우스를 이동합니다.
- 케이지 위에 비디오 카메라를설정하고(그림 1)시험 물질 주입 전에 비디오 녹화를 시작합니다. 깨어 있는 조건에서 면도목에 시험 물질의 10 μL 용액을 intradermally 주입하십시오. 주입 후 마우스를 기록 케이지로 되돌린다.
참고: 이 기사에서는 50 μg/10 μL 히스타민, 10 μg/10 μL 또는 40 μg/10 μL 캡사이신 또는 비히클(식염수 7% 트웬트 80)을 시험 물질로 사용하였다. - 케이지 뚜껑을 닫고 30분 동안 비디오 녹화를 계속합니다.
참고: 총 기록 시간은 실험 조건에 따라 달라집니다.
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행동 분석
- 스크래치 시합 동작을 계산합니다. 마우스는 목쪽으로 뒷다리를 올리고 1 초 또는 몇 초에 걸쳐 여러 번 긁힌 다음 다리를 내려 놓습니다. 이 일련의 작업은 하나의 스크래치 시합으로 계산됩니다. 다른 영역의 긁힘은 계산되어서는 안됩니다.
참고: 긁힘의 동작은 긁힘의 위치가 목으로 이동한다는 점을 제외하고는 뺨 주입 모델과 유사합니다.
- 스크래치 시합 동작을 계산합니다. 마우스는 목쪽으로 뒷다리를 올리고 1 초 또는 몇 초에 걸쳐 여러 번 긁힌 다음 다리를 내려 놓습니다. 이 일련의 작업은 하나의 스크래치 시합으로 계산됩니다. 다른 영역의 긁힘은 계산되어서는 안됩니다.
Representative Results
목 주사 모델에서, 히스타민은 강한 긁힘 행동을 유도하였다(그림3). 차량(식염수의 7% 트웬트 80)도 긁힘 동작을 유발했습니다. 이전 보고서는 케라틴세포에서히스타민 생산에 의해 세제 가시를 유도 하는 것을 보여 주었다 8 . Tween 80은 유사한 메커니즘에 의해 가려움증을 유발할 수 있는 반면, 캡사이신은 이전 보고서4와는 반대로 차량 유발 긁힘 동작을 감소시이어. 마우스 변형률 차이는 이러한 다양한 결과를 고려할 수 있습니다. 이 사실 인정은 긁는 행동에 고통의 효력이 복잡하다는 것을 표시합니다. 따라서 통증과 가려움 관련 행동을 동시에 측정하면 프리리토겐과 유발 물질의 정확한 분석이 가능할 수 있습니다. 뺨 주입 모델에서, capsaicin 긁힘 행동을 유도 하지 않았다 만 유도 된 닦아 행동, 통증에 관련 된 것으로 생각 되는9,10, 11 (그림 4). Capsaicin 주입 또한 그루밍 행동을 증가 (데이터가 표시 되지 않음). 뺨에 주입 후, 히스타민은 주로 약한 닦아 행동으로 긁힘 행동을 유도. 항 히스타민 시약, 디펜 히드라민의 적용, 긁힘을 억제. 이 결과는 히스타민 유발 긁힘 행동이 히스타민 수용체에 히스타민의 작용에 의해 발생한다는 것을 시사한다. 여기서, 일례로, 뺨 주입 모델에서 LPA의 효과는 도시된다(도5). LPA는 가려움증을 가진 담대환자에서 찾아낸 가려움 중간자입니다. 그러나, 마우스 모델에서, LPA는 소리토겐 및12,13,14,15모두로 보고되었다. 따라서, LPA의 효과는 뺨 주입 모델에서 조사되었고 결과는 LPA가 긁힘을 유도하지만, 동작을 닦지 않는 것으로 나타났다. 이것은 LPA는 pruritogen 나타냅니다., 하지만 algogen, 인간에서 그것의 효과 비슷한 쥐에서.
그림 3: 목 주입 모델에서 히스타민과 캡사이신의 효과. (A)차량의 주입에 의해 유도 된 긁힘 행동 (7 % 트웬티 80 식염수, 오픈 스퀘어), 히스타민 (사이트 당 50 μg / 10 μL, 채워진 원) 또는 캡사이신 ( 사이트 당 10 μg/10 μL, 열린 삼각형; 40 μg/10 μL/채워진 삼각형) 목에 총 5 분마다 평가 되었다 30 분.(B)패널에서 30 분 기간 동안 긁힘 행동의 정량 분석 A. 수정. 데이터는 평균 ± SEM(n= 6-8)으로 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 뺨 주입 모델에서 소양원 및 유발 물질의 효과. 와이핑(A)및 스크래치(B)비히클 (7% 트웬티 80 식염수, 오픈 스퀘어), 히스타민 (사이트 당 50 μg / 10 μL, 채워진 원) 또는 캡사이신 (부위당 40 μg / 10 μL, 채워진 삼각형)을 마우스의 오른쪽 뺨에 주입하여 유도된 행동이었다. 총 30분 동안 5분마다 평가됩니다. 열린 원으로 나타난 그룹은 히스타민 주사 30분 전에 경피적으로 2% (w/v) 디펜히드라민 염산염(DHHCL)으로 처리하였다(부위당 50 μg/10 μL). DHHCl을 식염수로 용해시켰습니다. 패널 A 및 B에서 30분 동안의와이핑(C)및 스크래치(D) 동작의 정량적 분석; n = 그룹당 8마리. -P < 0.05, &P < 0.01 에 의해 ANOVA 다음 본페로니 보정. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다.
그림 5: LPA는 긁힘을 유발하지만 뺨 주입 모델에서 동작을 닦지 않습니다. 스크래칭(A)및 닦기(B)비히클 (식염수, 오픈 스퀘어) 또는 LPA (부위당 100 nmol / 10 μL, 채워진 원)를 마우스의 오른쪽 뺨에 주입하여 유도 한 행동은 총 30 분 동안 5 분마다 평가되었습니다. 스크래치(C)및 닦기(D)패널 A 및 B에서 30 분 기간 동안 동작; n = 차량의 경우 17, LPA의 경우 n = 20입니다. -P < 0.05, &P < 0.01 웰치의 t 테스트에 의해. 데이터는 평균 ± SEM으로 도시됩니다. 이 그림은 키타카 외5에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: 마우스 뺨을 면도하는 방법을 보여주는 영화. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
동영상 2: 마우스 뺨에 주입을 보여주는 영화. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
동영상 3: 일반적인 지우기 동작을 보여 주는 동영상입니다. 이 영화는 25 %의 속도로 표시됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
동영상 4: 일반적인 긁힘 동작의 동영상. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
동영상 5: 일반적인 그루밍 동작의 동영상. 이 영화는 25 %의 속도로 표시됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
Discussion
이 기사에서는 뺨 주입 모델이 도입되어 통증 및 가려움관련 행동을 분석하는 데 유용한 것으로 나타났습니다.
이전 보고서는 알지 물질이 마우스 목 주입 모델4에서긁힘 행동을 유도하는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, capsaicin는 그밖 목 주입 실험에 있는 스크래치 행동을 감소시냈습니다(그림 3). 따라서 긁힘 행동에 대한 통증의 영향은 불분명합니다. 따라서 행동 테스트를 통해 통증과 가려움증을 동시에 조사하는 방법을 개발할 필요가 있습니다. 뺨 주입 모델을 사용하여 통증과 가려움증에 대한 물질의 효과를 평가 할 수 있습니다.
이전에는 세포내 LPA가 LPA 유도 가려움의 기전으로서 TRPV1 및 TRPA1을 직접 활성화한다고 보고되었다5. 따라서, LPA-유도 가려움은 히스타민 독립적일 수 있었다. 이전 연구는 또한 뺨 주입 모델이 히스타민 독립적 인 가려움의 평가에 사용될 수 있음을 보여주었다16. 따라서,이 모델은 히스타민 의존성 및 -독립적 인 가려움모두에 사용할 수 있습니다.
이 실험에서 중요한 단계 중 하나는 주사입니다. 이것은 심각한 행동 시험이기 때문에, 마취는 이 행동에 영향을 미칠 수 있기 때문에 주입 단계에서 사용될 수 없습니다. 따라서 정확한 주입을 수행하기 위해서는 마우스를 안전하게 고정해야 합니다. 동물에 보류가 안전하지 않은 경우, 특히 강한 알고겐을 주입 할 때, 마우스는 부정확한 주입 볼륨과 깊이로 이어지는 투쟁 할 수 있습니다, 결과를 해석하는 데 어려움이 뒤따랐다. 마우스를 다룰 때 엄지와 집게 손가락 사이의 목덜미에 피부를 당겨 마우스의 움직임을 억제합니다.
또 다른 중요한 단계는 행동 분석입니다. 긁힘은 매우 빠르기 때문에 비디오를 주의 깊게 시청해야합니다. 또한, 닦는 손질과 구별하기 어려울 수 있습니다. 따라서 첫 번째 실험 에서 capsaicin과 같은 긍정적 인 제어 화학 물질을 사용하는 것이 좋습니다. 기록 및 재생 조건은 두 동작의 계산에도 영향을 줄 수 있습니다. 동작을 명확하게 관찰하기 어려운 경우 케이지 주변에 거울을 사용하여 시야각을 향상시킬 수 있습니다4.
뺨 주입 모델은 목 주입 모델보다 시험 된 화학 물질에 대한 감소 된 정량적 정확도를 나타낼 수 있음을 주목해야한다. 도 3 및 도 4에도시된 바와 같이, 동일한 양의 히스타민은 뺨 모델에서보다 목 모델에서 더 많은 긁힘 거동을 유도하고, 목 주사 모델에서 더 작은 편차를 보였다. 일단 시험된 물질이 뺨 주입 모형을 가진 낮은 algesic 효력을 가진 pruritogen인 것을 보여주면, 목 주입 모형은 추가 정량 분석을 위해 추천됩니다. 이러한 한계에도 불구하고 뺨 주입 모델은 특히 가려움증 연구 분야에서 시험 물질의 정확한 평가에 유용합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 박사 스티븐 G. 시마다와 로버트 H. LaMotte (의학의 예일 대학 대학, 코네티컷) 누구의 방법 (참조 4) 이 기술이 적응된 에 감사드립니다. 또한 마우스 일러스트를 만들어 주신 미야하라 켄타로 씨에게도 감사드립니다. 이 연구는 일본 문부과학성(15H02501 및 15H05928~M.T.), 16K21691 호, 우에하라 기념재단(H.K.)의 과학연구 보조금 지원으로 지원되었습니다. 우리는 예일 대학에서 교수 라모테에 의해 뺨 주입 방법의 도입을 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Wako | 044-19772 | |
| Histamine | Sigma | H7125 | |
| iMovie | Apple | ||
| Lysophosphatidic acid | Avanti Polar Lipids | 325465-93-8 | |
| Myjector | Terumo | ss-05M2913 | |
| Tween-80 | Sigma | P4780 | |
| Video camera | Panasonic | VX985M |
References
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