Summary
Normalmente, o modelo de injeção de pescoço do mouse é usado para avaliar comportamentos de risco induzida por pruritogen. No entanto, o modelo fornece informações apenas sobre coceira, não dor. Aqui, um modelo de injeção de bochecha é introduzido em camundongos que podem ser usados para medir simultaneamente a dor e comportamentos relacionados a coceira.
Abstract
Itch foi definido como "uma sensação cutânea desagradável que provoca um desejo de arranhar" por Rothman em 1941. Em modelos de mouse, lutas de arranhões são tipicamente contados para avaliar coceira induzida por pruritogens. No entanto, relatos anteriores mostraram que as substâncias algémicas também induzem comportamentos de arranhões em um modelo de injeção de pescoço do mouse, que é o teste mais comum usado para coçar comportamentos. Esse achado dificulta o estudo da coceira em camundongos. Em contraste, a capsaicina, um algogen comum, reduziu os comportamentos de arranhões em alguns experimentos de injeção de pescoço. Conseqüentemente, o efeito da dor em comportamentos de risco permanece obscuro. É assim necessário desenvolver um método para investigar simultaneamente a sensação da coceira e da dor usando testes comportáveis. Aqui, um modelo de injeção de bochecha é introduzido, que pode ser usado para medir simultaneamente os comportamentos relacionados à dor e coceira. Neste modelo, os pruritogens induzem comportamentos do risco quando as substâncias algesic induzem comportamentos de limpeza. Usando este modelo, o ácido lysophosphatidic (LPA), um mediador da coceira encontrado em pacientes colestática com coceira, é mostrado para induzir exclusivamente a coceira mas não a dor. Entretanto, em modelos do rato, LPA foi relatado para ser um pruritogen e um algogen. A investigação nos efeitos de LPA em um modelo da injeção do mordente do rato mostrou que o LPA induziu somente o risco, mas não limpando comportamentos. Isto indica que o LPA actua como um pruritogen similarmente nos ratos e nos seres humanos, e demonstra a utilidade de um modelo da injeção do mordente para a pesquisa do prurido.
Introduction
A coceira foi originalmente caracterizada como uma sensação que induz comportamentos de arranhões para remover materiais nocivos da superfície da pele. No entanto, a coceira tem sido o foco de terapias para sensações desagradáveis causadas por muitas doenças, como dermatite atópica, lesões neurogênicas e colestase1. Nestes casos, coceira é uma sensação desagradável grave semelhante à dor. Portanto, a coceira representa um importante alvo de pesquisa. Coçar o comportamento é o principal indicador de coceira em experimentos com animais, e coçar comportamentos podem ser induzidos em camundongos injetando pruritogens na pele em seu pescoço2,3. No entanto, um estudo anterior mostrou que a capsaicina, um algogen, também induz a coçar comportamentos em um modelo de injeção de pescoço4, dificultando a discriminação de coceira na dor neste modelo. Por outro lado, verificou-se que a capsaicina reduziu os comportamentos de coçar em um modelo de injeção cervical, indicando que o efeito da dor nos comportamentos de coçar é complicado e depende das condições experimentais. Conseqüentemente, as medidas simultâneas da dor e dos comportamentos coceira-relacionados permiti-lo-iam a análise precisa de pruritogens e de algogens. Steven G. Shimada e Robert H. LaMotte conseguiram medições simultâneas de dor e comportamentos relacionados ao prurido, alterando o local da injeção do pescoço para o rosto4. No modelo de injeção de bochecha, capsaicina induzida limpando, mas não arranhando comportamentos, enquanto a histamina, um pruritogen, apenas induzido coçar comportamentos. Conseqüentemente, este modelo permite a avaliação independente da coceira e da dor, fazendo a injeção do mordente um modelo útil para a pesquisa do prurido. Ao tentar determinar se uma substância de teste é um pruritogen e/ou um algogen, este modelo fornece mais informação do que o modelo de injeção do pescoço. Este artigo descreve um método prático para executar a injeção da bochecha e a contagem dos ataques de riscar ou de limpar, e mostra a utilidade deste método para avaliar os comportamentos de risco induzidos pelo ácido lysophosphatidic (LPA).
Protocol
Todos os procedimentos envolvendo o cuidado e uso de animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais do Instituto Nacional de ciências naturais (16A074), e realizados de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Ciências fisiológicas.
Nota: O protocolo original foi relatado por Steven G. Shimada e Robert H. LaMotte4, e o relatório atual descreve estes métodos com diversas modificações, incluindo a adição de uma tela para impedir que os animais vejam-se, a ausência de um espelho, o número de ratos por gravação, deformação do mouse, tamanho da gaiola e tempo de gravação.
1. modelo de injeção de bochecha
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Preparação da experiência
- Gaiola
- Defina quatro gaiolas uma câmera, como mostrado na Figura 1. Defina uma tela para evitar que os ratos se vejam. Põr em cada rato a cada gaiola e ajuste uma tampa acrílica para impedir o escape dos ratos. Note-se que as gravações devem ser realizadas em um ambiente em que a temperatura, umidade e som são controlados.
Nota: Os comportamentos podem igualmente ser gravados sem uma tampa se a gaiola é suficientemente elevada.
- Defina quatro gaiolas uma câmera, como mostrado na Figura 1. Defina uma tela para evitar que os ratos se vejam. Põr em cada rato a cada gaiola e ajuste uma tampa acrílica para impedir o escape dos ratos. Note-se que as gravações devem ser realizadas em um ambiente em que a temperatura, umidade e som são controlados.
- Agulha e seringa
- Use uma agulha de 29 G ou 30 G acoplada a uma seringa de 0,5 mL para a injeção de substâncias de teste. Se a solução de substância de teste for altamente viscosa, são necessárias agulhas maiores. Entretanto, anote por favor que as grandes agulhas levantam efeitos laterais físicos adicionais.
Nota: Uma agulha conectada a uma seringa com um tubo de polietileno pode ser usada.
- Use uma agulha de 29 G ou 30 G acoplada a uma seringa de 0,5 mL para a injeção de substâncias de teste. Se a solução de substância de teste for altamente viscosa, são necessárias agulhas maiores. Entretanto, anote por favor que as grandes agulhas levantam efeitos laterais físicos adicionais.
- Câmera de vídeo
- Use uma câmera de vídeo com taxas de quadros suficientemente grandes (30-60 frames/s) com resolução relativamente alta para a medição de lutas de arranhões e comportamentos de limpeza.
- Software para análise de vídeo
- Use um software de edição de vídeo para a reprodução e análise de vídeo. Observe que um modo de avanço rápido e um modo de reprodução quadro a quadro são necessários para uma análise precisa.
- Gaiola
Figura 1: câmera de vídeo e gaiola de set-up. Quatro gaiolas acrílicas com tampas acrílicas, para impedir o escape dos ratos, e uma tela para impedir a coceira contagiosa são usadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Injeção e gravação
- Um dia antes do experimento, depilar a pele na bochecha do rato com cortadores de cabelo (filme 1). Antes de raspar, não contenha os ratos.
Nota: Os camundongos CD-1 ou C57Bl/6 foram usados principalmente neste modelo4,5. Neste artigo, machos 6-12 semana-velho C57BL/6N camundongos foram usados. Note-se que a sensibilidade para os produtos químicos pode ser diferente entre as várias cepas de mouse3,6,7. - Um dia após o barbear, mova o mouse para a gaiola de gravação para 1 h para aclimatizá-lo para as condições de gravação. Se for utilizada uma aplicação tópica, aplique-a durante este período de aclimatação.
Nota: Neste relato, 10 μL de sal de cloridrato de diphenhydramina a 2% (p/v) em soro fisiológico foi aplicado topicamente 30 min antes da gravação. - Defina uma câmera de vídeo acima da gaiola e inicie a gravação de vídeo antes da injeção da substância de teste. Injete uma solução de 10 μL da substância de teste intradérmica na bochecha raspada condições acordadas (filme 2). Após a injeção, retorne o mouse para a gaiola de gravação.
Nota: Neste relato, 50 μg/10 μL de histamina, 40 μg/10 μL de capsaicina ou veículo (7% Tween 80 em soro fisiológico) foram utilizados como substâncias-teste. - Feche a tampa da gaiola e continuar a gravação de vídeo por 30 min.
Nota: O tempo total de gravação dependerá das condições experimentais.
- Um dia antes do experimento, depilar a pele na bochecha do rato com cortadores de cabelo (filme 1). Antes de raspar, não contenha os ratos.
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Análise comportamental
- Contagem zero ataques e limpando comportamentos, respectivamente. Os ratos levantam uma pata traseira para a bochecha e arranham várias vezes ao longo de um ou alguns segundos, em seguida, colocar a perna para baixo. Esta série de ações é contada como uma luta de arranhões. O risco de outras áreas não deve ser contado. Os ratos usam um único foreleg para limpar e ambos os patas dianteiras para grooming. Essas ações devem ser distinguidas. Somente os comportamentos de limpeza são contados como comportamentos relacionados à dor.
Nota: Cada ação é mostrada na Figura 2, filme 3, filme 4e filme 5.
- Contagem zero ataques e limpando comportamentos, respectivamente. Os ratos levantam uma pata traseira para a bochecha e arranham várias vezes ao longo de um ou alguns segundos, em seguida, colocar a perna para baixo. Esta série de ações é contada como uma luta de arranhões. O risco de outras áreas não deve ser contado. Os ratos usam um único foreleg para limpar e ambos os patas dianteiras para grooming. Essas ações devem ser distinguidas. Somente os comportamentos de limpeza são contados como comportamentos relacionados à dor.
Figura 2: atividade típica do mouse durante a gravação. Os painéis a-C são ilustrações que representam o comportamento de limpeza com o foreleg direito (a), riscando o comportamento com o pé traseiro direito (B) e o comportamento da preparação com ambos os patas dianteiras (C). Os ratos levantam uma pata traseira para a bochecha e arranham várias vezes ao longo de um ou alguns segundos, em seguida, colocar essa perna para baixo. Esta série de ações é contada como uma luta de arranhões. O risco de outras áreas não deve ser contado. Os ratos usam um único foreleg para limpar e ambos os patas dianteiras para grooming. Essas ações devem ser distinguidas. Somente os comportamentos de limpeza são contados como comportamentos relacionados à dor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. modelo de injeção de pescoço
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Injeção e gravação
- Um dia antes do experimento, raspar a pele na nuca do pescoço do rato com cortadores de cabelo após aproximadamente 5% de inalação de isoflurano por 2-3 min.
- Um dia após o barbear, mova o mouse para a gaiola de gravação para 1 h para aclimatizá-lo para as condições de gravação.
- Defina uma câmera de vídeo acima da gaiola (Figura 1) e inicie a gravação de vídeo antes da injeção da substância de teste. Injete uma solução de 10 μL da substância de teste intradérmica no pescoço raspado condições acordadas. Após a injeção, retorne o mouse para a gaiola de gravação.
Nota: Neste artigo, 50 μg/10 μL de histamina, 10 μg/10 μL ou 40 μg/10 μL de capsaicina, ou veículo (7% Tween 80 em soro fisiológico) foram utilizados como substâncias de teste. - Feche a tampa da gaiola e continuar a gravação de vídeo por 30 min.
Nota: O tempo total de gravação dependerá das condições experimentais.
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Análise comportamental
- Contagem de arranhões bout comportamentos. Os ratos levantam uma perna traseira em direção ao pescoço e arranham várias vezes ao longo de um ou alguns segundos, em seguida, colocar essa perna para baixo. Esta série de ações é contada como uma luta de arranhões. O risco de outras áreas não deve ser contado.
Nota: A ação de arranhar é semelhante à do modelo de injeção de bochecha, exceto que a localização do arranhão é deslocada para o pescoço.
- Contagem de arranhões bout comportamentos. Os ratos levantam uma perna traseira em direção ao pescoço e arranham várias vezes ao longo de um ou alguns segundos, em seguida, colocar essa perna para baixo. Esta série de ações é contada como uma luta de arranhões. O risco de outras áreas não deve ser contado.
Representative Results
No modelo de injeção cervical, a histamina induziu comportamentos de coçar forte (Figura 3). O veículo (7% Tween 80 em soro fisiológico) também induziu comportamentos de coçar. Um relatório precedente mostrou que o prurido induzido detergente pela produção do histamina dos queratinócitos8. Tween 80 poderia induzir a coceira por mecanismos similares, enquanto a capsaicina reduziu os comportamentos de arranhões induzidos por veículos, contrariamente a um relatório anterior4. É possível que as diferenças de deformação do mouse possam ser responsáveis por esses resultados diferentes. Estes resultados indicam que o efeito da dor em comportamentos de risco é complicado. Conseqüentemente, a medida simultânea da dor e dos comportamentos coceira-relacionados podem permitir a análise precisa de pruritogens e de algogens. No modelo de injeção de bochecha, a capsaicina não induziu comportamentos de coçar e somente comportamentos de limpeza induzidos, que se pensa estarem relacionados à dor9,10,11( Figura 4). A injeção de capsaicina também aumentou os comportamentos de grooming (dados não mostrados). Após a injeção na bochecha, a histamina induziu principalmente comportamentos de arranhões com comportamentos fracos de limpeza. A aplicação de um anti-histamina reagente, difphenhydramine, inibida coçar. Este resultado sugere que os comportamentos de risco histamina-induzidos são causados pela ação da histamina em receptores da histamina. Aqui, como exemplo, são mostrados os efeitos da LPA no modelo de injeção de bochecha (Figura 5). O LPA é um mediador da coceira encontrado em pacientes colestática com coceira. No entanto, em modelos de camundongo, o LPA foi relatado como um pruritogénio e um algogen12,13,14,15. Portanto, os efeitos da LPA foram investigados em um modelo de injeção de bochecha e os resultados mostraram que a LPA induziu arranhões, mas não limpando comportamentos. Isto indica que o LPA é um pruritogen, mas não um algogen, nos ratos similares a seus efeitos nos seres humanos.
Figura 3: efeitos da histamina e da capsaicina no modelo de injeção cervical. (a) coçar comportamentos induzidos pela injeção de veículo (7% Tween 80 em soro fisiológico, quadrado aberto), histamina (50 μg/10 μL por local, círculos preenchidos) ou capsaicina ( 10 μg/10 μL por local, triângulo aberto; 40 μg/10 μL por local, triângulo preenchido) no pescoço foram avaliados a cada 5 min para um total de 30 min. (B) análise quantitativa dos comportamentos de coçar durante o período de 30 min no painel a. * < 0, 1 por ANOVA seguida por Bonferroni Correção. Os dados são mostrados como a média ± SEM (n = 6-8). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: efeitos de um pruritogen e um algogen no modelo de injeção de bochecha. Limpando (A) e arranhando (B) comportamentos induzidos por injeção de veículo (7% Tween 80 em soro fisiológico, quadrado aberto), histamina (50 μg/10 μL por local, círculos preenchidos) ou capsaicina (40 μg/10 μL por local, triângulo preenchido) na bochecha direita de camundongos foram avaliados a cada 5 min para um total de 30 min. O grupo apresentado como círculos abertos foi tratado com 10 μL de sal de cloridrato de difenidramina de 2% (w/v) (dhhcl) percutaneamente 30 minutos antes da injeção de histamina (50 μg/10 μL por local). DHHCl foi dissolvido em soro fisiológico. Análise quantitativa dos comportamentos de limpeza (C) e coçar (D) durante o período de 30 min nos painéis a e B; n = 8 animais por grupo. P < 0, 5, < 0, 1 por ANOVA seguida de correção de Bonferroni. Os dados são mostrados como a média ± SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: LPA induz arranhões, mas não limpando comportamentos no modelo de injeção de bochecha. Coçar (A) e limpar (B) comportamentos induzidos por injeção de veículo (soro fisiológico, quadrados abertos) ou LpA (100 nmol/10 μL por local, círculos preenchidos) na bochecha direita dos camundongos foram avaliados a cada 5 min para um total de 30 min. análise quantitativa da coçar (C) e limpar (D) comportamentos durante o período de 30 min nos painéis a e B; n = 17 para o veículo e n = 20 para LPA. P < 0, 5, < 0, 1 pelo teste t de Welch. Os dados são mostrados como a média ± SEM. Este número foi modificado de Kittaka et al.5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: filme demonstrando como raspar uma bochecha do mouse. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Filme 2: filme demonstrando a injeção em uma bochecha do mouse. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Filme 3: filme demonstrando comportamento de limpeza típica. Este filme é mostrado a 25% de velocidade. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Filme 4: filme de comportamento coçar típico. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Filme 5: filme de comportamento típico de grooming. Este filme é mostrado a 25% de velocidade. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Discussion
Neste artigo, um modelo de injeção de bochecha é introduzido e mostrado para ser útil para a análise de dor e comportamentos relacionados a coceira.
Um relato prévio mostrou que as substâncias algémicas induzem comportamentos de risco em um modelo de injeção de pescoço do mouse4. Em contrapartida, a capsaicina reduziu os comportamentos de risco em outros experimentos de injeção de pescoço (Figura 3). Conseqüentemente, o efeito da dor no comportamento do risco permanece obscuro. É, portanto, necessário desenvolver um método para investigar simultaneamente a dor e coceira através de testes comportamentais. Usando um modelo da injeção do mordente, o efeito de uma substância na dor e na coceira pode ser avaliado.
Tem sido relatado previamente que o LPA intracelular ativa diretamente TRPV1 e TRPA1 como um mecanismo do prurido LPA-induzido5. Conformemente, o prurido LPA-induzido podia ser independente da histamina. Um estudo precedente igualmente mostrou que um modelo da injeção do mordente pode ser usado para a avaliação da coceira histamina-independente16. Conseqüentemente, este modelo pode ser usado para a coceira histamina-dependente e-independente.
Uma das etapas críticas neste experimento é a injeção. Porque este é um teste comportamental agudo, a anestesia não pode ser usada na etapa da injeção porque pôde afetar estes comportamentos. Consequentemente, o rato precisa de ser prendido firmemente a fim executar uma injeção precisa. Quando a preensão no animal não é segura, especial ao injetar algogens fortes, os ratos podem lutar, conduzindo a um volume e a uma profundidade imprecisos da injeção, seguidos pela dificuldade em interpretar os resultados. Ao manusear um rato, puxe a pele na nuca entre o polegar e o indicador para inibir o movimento do rato.
Outro passo crítico é a análise comportamental. Porque arranhando é muito rápido, o vídeo precisa ser observado com cuidado. Além disso, a limpeza pode ser difícil de distinguir de grooming. Portanto, o uso de produtos químicos de controle positivo, como a capsaicina, é recomendado durante o primeiro experimento. As condições de gravação e repetição também podem afetar a contagem de ambos os comportamentos. Se é difícil observar claramente os comportamentos, os espelhos podem ser usados em torno das gaiolas para realçar os ângulos de visão4.
Deve-se notar que o modelo de injeção de bochecha pode mostrar precisão quantitativa reduzida para os produtos químicos testados do que no modelo de injeção de pescoço. Como mostrado na Figura 3 e na Figura 4, a mesma quantidade de histamina induziu mais riscos no modelo cervical do que no modelo de bochecha, e apresentou menor variação no modelo de injeção cervical. Uma vez que uma substância testada foi mostrada para ser um pruritogen com baixos efeitos algesic com o modelo da injeção do mordente, o modelo da injeção da garganta é recomendado para a análise quantitativa adicional. Mesmo com essas limitações, o modelo de injeção de bochecha é útil para a avaliação precisa de substâncias de teste, especialmente no campo da pesquisa de coceira.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos Drs. Steven G. Shimada e Robert H. LaMotte (Yale University School of Medicine, Connecticut) de cujos métodos (referência 4) esta técnica foi adaptada. Também agradecemos ao Sr. Kentaro Miyahara por criar as ilustrações do mouse. Este estudo foi apoiado por um Grant-in-Aid para a pesquisa científica do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia no Japão (nos. 15H02501 e 15H05928 a MT, e n º 16K21691 para H.K.) e Uehara Memorial Foundation (para H.K.). Agradecemos a introdução do método de injeção de bochecha pelo Prof. LaMotte na Universidade de Yale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Wako | 044-19772 | |
| Histamine | Sigma | H7125 | |
| iMovie | Apple | ||
| Lysophosphatidic acid | Avanti Polar Lipids | 325465-93-8 | |
| Myjector | Terumo | ss-05M2913 | |
| Tween-80 | Sigma | P4780 | |
| Video camera | Panasonic | VX985M |
References
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