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Neuroscience

Modèle d'injection de joues pour la mesure simultanée de la douleur et des comportements liés aux démangeaisons

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/58943
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 1,2,3,6
1Thermal Biology Group, Exploratory Research Center on Life and Living Systems (ExCELLS), 2Division of Cell Signaling, National Institute for Physiological Sciences, 3Department of Physiological Sciences, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI), 4Research Laboratory, Ikedamohando Co., Ltd., 5Department of Molecular Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, North Carolina State University, 6Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University

Summary

Typiquement, le modèle d'injection de cou de souris est employé pour évaluer des comportements pruritogen-induits d'éraflure. Cependant, le modèle fournit des informations uniquement sur les démangeaisons, pas la douleur. Ici, un modèle d'injection de joue est introduit chez les souris qui peut être employé pour mesurer simultanément la douleur et les comportements liés aux démangeaisons.

Abstract

Itch a été défini comme «une sensation cutanée désagréable qui provoque un désir de gratter» par Rothman en 1941. Dans les modèles de souris, les épisodes de rayures sont généralement comptés pour évaluer les démangeaisons induites par les pruritogènes. Cependant, les rapports précédents ont montré que les substances algiciques induisent également des comportements de grattage dans un modèle d'injection de cou de souris, qui est le test le plus commun utilisé pour les comportements de grattage. Cette découverte rend difficile l'étude des démangeaisons chez la souris.  En revanche, la capsaïcine, un algogène commun, a réduit les comportements de grattage dans certaines expériences d'injection de cou. Par conséquent, l'effet de la douleur sur les comportements de grattage reste incertain. Il est donc nécessaire de développer une méthode pour étudier simultanément les démangeaisons et la sensation de douleur à l'aide de tests comportementaux. Ici, un modèle d'injection de joue est introduit qui peut être employé pour mesurer simultanément des comportements douleur-et démangeaisons-connexes. Dans ce modèle, les pruritogènes induisent des comportements de grattage tandis que les substances algiciques induisent des comportements d'essuyage. Utilisant ce modèle, l'acide lysophosphatidique (LPA), un médiateur de démangeaison trouvé dans les patients cholestatic présentant la démangeaison, est montré pour induire exclusivement la démangeaison mais pas la douleur. Cependant, dans les modèles de souris, LPA a été rapporté pour être à la fois un pruritogen et un algogen. L'enquête sur les effets de l'APL dans un modèle d'injection de joue de souris a montré que l'APL n'a induit que des égratignures, mais pas des comportements d'essuyage. Ceci indique que l'APL agit comme un pruritogen de la même façon chez les souris et les humains, et démontre l'utilité d'un modèle d'injection de joues pour la recherche sur les démangeaisons.

Introduction

Démangeaisons a été caractérisée à l'origine comme une sensation qui induit des comportements de grattage pour enlever les matériaux nocifs de la surface de la peau. Cependant, les démangeaisons ont été au centre des thérapies pour les sensations désagréables provoquées par beaucoup de maladies telles que la dermatite atopique, les lésions neurogènes, et la cholestasis1. Dans ces cas, les démangeaisons sont une sensation désagréable grave semblable à la douleur. Par conséquent, les démangeaisons représentent une cible de recherche importante. Le comportement de grattage est le principal indicateur de démangeaisons dans les expériences animales, et les comportements de grattage peuvent être induits chez les souris en injectant des pruritogènes dans la peau sur leur cou2,3. Cependant, une étude précédente a montré que la capsaïcine, un algogène, induit également des comportements de grattage dans un modèle d'injection de cou4, ce qui rend difficile de distinguer les démangeaisons de la douleur dans ce modèle.  En revanche, il a été constaté que la capsaïcine réduit les comportements de grattage dans un modèle d'injection du cou, ce qui indique que l'effet de la douleur sur les comportements de grattage est compliqué et dépend des conditions expérimentales.  Par conséquent, des mesures simultanées de la douleur et des comportements liés aux démangeaisons permettraient l'analyse précise des pruritogènes et des algogènes. Steven G. Shimada et Robert H. LaMotte ont réussi à mesurer simultanément la douleur et les comportements liés aux démangeaisons en changeant le site d'injection du cou à la joue4. Dans le modèle d'injection de joue, la capsaïcine a induit l'essuyage, mais pas les comportements de grattage, alors que l'histamine, un pruritogen, a seulement induit des comportements de grattage. Par conséquent, ce modèle permet l'évaluation indépendante des démangeaisons et de la douleur, ce qui rend l'injection de la joue un modèle utile pour la recherche sur les démangeaisons. Lorsque vous essayez de déterminer si une substance d'essai est un pruritogène et/ ou un algogène, ce modèle fournit plus d'informations que le modèle d'injection du cou. Cet article décrit une méthode pratique pour effectuer l'injection de joue et compter les accès de grattage ou d'essuyage, et montre l'utilité de cette méthode pour évaluer des comportements de grattage induits par l'acide lysophosphatidique (LPA).

Protocol

Toutes les procédures relatives à l'entretien et à l'utilisation des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Institut national des sciences naturelles (16A074), et effectuées conformément aux directives de l'Institut national des Sciences physiologiques.

REMARQUE: Le protocole original a été rapporté par Steven G. Shimada et Robert H. LaMotte4, et le présent rapport décrit ces méthodes avec plusieurs modifications, y compris l'ajout d'un écran pour empêcher les animaux de se voir, l'absence d'un le miroir, le nombre de souris par enregistrement, la souche de souris, la taille de la cage et le temps d'enregistrement.

1. Modèle d'injection de joue

  1. Préparation de l'expérience
    1. cage
      1. Mettre quatre cages sous une caméra comme le montre la figure 1. Installez un écran pour empêcher les souris de se voir. Mettez chaque souris dans chaque cage et placez un couvercle en acrylique pour éviter l'évasion des souris. Notez que les enregistrements doivent être effectués dans un environnement où la température, l'humidité et le son sont contrôlés.
        REMARQUE: Les comportements peuvent également être enregistrés sans couvercle si la cage est suffisamment haute.
    2. Aiguille et seringue
      1. Utilisez une aiguille de 29 G ou 30 G fixée à une seringue de 0,5 ml pour l'injection de substances d'essai. Si la solution de substance d'essai est très visqueuse, de plus grandes aiguilles sont exigées. Cependant, s'il vous plaît noter que les grandes aiguilles posent des effets secondaires physiques supplémentaires.
        REMARQUE: Une aiguille reliée à une seringue avec un tube de polyéthylène peut être utilisée.
    3. caméra vidéo
      1. Utilisez une caméra vidéo ayant des taux d'images suffisamment élevés (30-60 images/s) avec une résolution relativement élevée pour la mesure des épisodes de rayures et des comportements d'essuyage.
    4. Logiciel pour l'analyse vidéo
      1. Utilisez un logiciel de montage vidéo pour la lecture et l'analyse vidéo. Notez qu'un mode avance rapide et un mode de lecture image par image sont nécessaires pour une analyse précise.

Figure 1
Figure 1: Caméra vidéo et mise en place de la cage. Quatre cages acryliques avec couvercles acryliques, pour empêcher l'évasion des souris, et un écran pour prévenir les démangeaisons contagieuses sont utilisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Injection et enregistrement
    1. Un jour avant l'expérience, raser la fourrure sur la joue de la souris avec des tondeuses à cheveux (Movie 1). Avant de vous raser, ne retenez pas les souris.
      REMARQUE: Les souris CD-1 ou C57BL/6 ont été principalement utilisées dans ce modèle4,5. Dans cet article, des souris mâles de 6-12 semaines de C57BL/6N ont été employées. Notez que la sensibilité aux produits chimiques pourrait être différente entre les différentes souches de souris3,6,7.
    2. Un jour après le rasage, déplacez la souris dans la cage d'enregistrement pendant 1 h pour l'acclimater aux conditions d'enregistrement. Si une application d'actualité est utilisée, appliquez-la pendant cette période d'acclimatation.
      REMARQUE: Dans ce rapport, 10 ll de 2 % (w/v) sel d'hydrochlorure de diphenhydramine dans la saline a été appliqué topiquement 30 min avant l'enregistrement.
    3. Installez une caméra vidéo au-dessus de la cage et commencez l'enregistrement vidéo avant l'injection de substance d'essai. Injecter une solution de 10 L de la substance d'essai intradertradermally dans la joue rasée dans des conditions éveillées (Film 2). Après l'injection, retourner la souris dans la cage d'enregistrement.
      REMARQUE: Dans ce rapport, 50 'g/10 'L'histamine, 40 'g/10 'L capsaïcine ou véhicule (7% tween 80 dans saline) ont été utilisés comme substances d'essai.
    4. Fermez le couvercle de la cage et continuez l'enregistrement vidéo pendant 30 min.
      REMARQUE: Le temps d'enregistrement total dépendra des conditions expérimentales.
  2. Analyse comportementale
    1. Comptez les épisodes de grattage et les comportements d'essuyage, respectivement. Les souris soulèvent une patte arrière vers la joue et se grattent plusieurs fois en une ou quelques secondes, puis baissent la jambe. Cette série d'actions est comptée comme un combat de rayures. Il ne faut pas compter les rayures d'autres zones. Les souris utilisent un seul avant-jambe pour l'essuyage et les deux pattes antérieures pour le toilettage. Ces actions doivent être distinguées. Seuls les comportements d'essuyage sont comptés comme des comportements liés à la douleur.
      REMARQUE: Chaque action est montrée dans La figure 2, Film 3, Film 4, et Le film 5.

Figure 2
Figure 2: Activité typique de la souris pendant l'enregistrement. Les panneaux A-C sont des illustrations représentant le comportement d'essuyage avec le droit avant-jambe (A), le comportement de grattage avec la jambe arrière droite (B) et le comportement de toilettage avec les deux pattes antérieures (C). Les souris soulèvent une patte arrière vers la joue et grattent plusieurs fois en une ou quelques secondes, puis la baissent la jambe. Cette série d'actions est comptée comme un combat de rayures. Il ne faut pas compter les rayures d'autres zones. Les souris utilisent un seul avant-jambe pour l'essuyage et les deux pattes antérieures pour le toilettage. Ces actions doivent être distinguées. Seuls les comportements d'essuyage sont comptés comme des comportements liés à la douleur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Modèle d'injection de cou

  1. Injection et enregistrement
    1. Un jour avant l'expérience, raser la fourrure sur la nuque de la souris avec des tondeuses à cheveux après environ 5% inhalation d'isoflurane pendant 2-3 min.
    2. Un jour après le rasage, déplacez la souris dans la cage d'enregistrement pendant 1 h pour l'acclimater aux conditions d'enregistrement.
    3. Installez une caméra vidéo au-dessus de la cage (Figure 1), et commencez l'enregistrement vidéo avant l'injection de substance d'essai. Injecter une solution de 10 L de la substance d'essai intradertradermally dans le cou rasé dans des conditions éveillées. Après l'injection, retourner la souris dans la cage d'enregistrement.
      REMARQUE: Dans cet article, 50 'g/10 'L histamine, 10 'g/10 'L ou 40 'g/10 'L 'Capsaicin, ou véhicule (7% tween 80 en saline) ont été utilisés comme substances d'essai.
    4. Fermez le couvercle de la cage et continuez l'enregistrement vidéo pendant 30 min.
      REMARQUE: Le temps d'enregistrement total dépendra des conditions expérimentales.
  2. Analyse comportementale
    1. Comptez les comportements de combat à gratter. Les souris soulèvent une patte arrière vers le cou et grattent plusieurs fois en une ou quelques secondes, puis la baissent la jambe. Cette série d'actions est comptée comme un combat de rayures. Il ne faut pas compter les rayures d'autres zones.
      REMARQUE: L'action de gratter est similaire à celle dans le modèle d'injection de joue, sauf que l'emplacement de la rayure est décalée vers le cou.

Representative Results

Dans le modèle d'injection de cou, l'histamine a induit de forts comportements de grattage (figure 3). Véhicule (7% entre 80 en saline) a également induit des comportements de grattage. Un rapport précédent a montré que la démangeaison induite de détergent par la production d'histamine des kératinocytes8. Tween 80 pourrait provoquer des démangeaisons par des mécanismes similaires, tandis que la capsaïcine réduit les comportements de grattage induits par le véhicule, contrairement à un rapport précédent4. Il est possible que les différences de souche de souris pourraient expliquer ces différents résultats. Ces résultats indiquent que l'effet de la douleur sur les comportements de grattage est compliqué. Par conséquent, la mesure simultanée de la douleur et des comportements liés aux démangeaisons peut permettre l'analyse précise des pruritogènes et des algogènes. Dans le modèle d'injection de joue, la capsaïcine n'a pas induit des comportements de grattage et seulement induit des comportements d'essuyage, qui sont pensés pour être liés à la douleur9,10,11 ( Figure4). L'injection de capsaïcine a également augmenté les comportements de toilettage (données non affichées). Après l'injection dans la joue, l'histamine a principalement induit des comportements de grattage avec des comportements d'essuyage faibles. L'application d'un réactif anti-histaminique, la dilanhydramine, a inhibé le grattage. Ce résultat suggère que les comportements de grattage induits par l'histamine sont causés par l'action de l'histamine sur les récepteurs de l'histamine. Ici, par exemple, les effets de l'APL dans le modèle d'injection des joues sont indiqués (figure 5). LPA est un médiateur de démangeaisontrouvé dans les patients cholestatic présentant la démangeaison. Cependant, dans les modèles de souris, LPA a été signalé à la fois comme un pruritogen et un algogène12,13,14,15. Par conséquent, les effets de l'APL ont été étudiés dans un modèle d'injection de joues et les résultats ont montré que l'APL induit rayures, mais pas l'essuyage des comportements. Cela indique que l'APL est un pruritogen, mais pas un algogène, chez la souris similaire à ses effets chez l'homme.

Figure 3
Figure 3: Effets de l'histamine et de lacapsaïcine dans le modèle d'injection du cou. (A) Comportements de grattage induits par l'injection du véhicule (7% d'entre-deux 80 en salin, carré ouvert), histamine (50 g/10 l par site, cercles remplis) ou capsaïcine ( 10 g/10 l par site, triangle ouvert; 40 'g/10 'L par emplacement, triangle rempli) dans le cou ont été évalués toutes les 5 min pour un total de 30 min. (B) Analyse quantitative des comportements de grattage au cours de la période de 30 min dans le panneau A. correction. Les données sont affichées sous la forme de la moyenne seM (n 6-8). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Effets d'un pruritogen et d'un algogène dans le modèle d'injection de joue. Essuyage (A) et rayures (B) comportements induits par l'injection du véhicule (7% entre 80 dans saline, carré ouvert), histamine (50 'g/10 'L par site, cercles remplis) ou capsaïcine (40 'g/10 'L par emplacement, triangle rempli) dans la joue droite des souris ont été évalué toutes les 5 min pour un total de 30 min. Le groupe présenté sous forme de cercles ouverts a été traité avec 10 oL de 2 % (w/v) sel d'hydrochlorure de diphenhydramine (DHHCL) percutanément 30 min avant l'injection d'histamine (50 g/10 l par site). DHHCl a été dissous dans saline. Analyse quantitative des comportements d'essuyage (C) et de grattage (D) au cours de la période de 30 min dans les panneaux A et B; n - 8 animaux par groupe. P et lt; 0,05,P et Lt; 0,01 par ANOVA suivi de la correction de Bonferroni. Les données sont affichées sous la forme d'une moyenne de SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: LPA induit des comportements degrattage, mais pas d'essuyage dans le modèle d'injection de joues. Les comportements de grattage (A) et d'essuyage (B) induits par l'injection de véhicules (salins, carrés ouverts) ou de LPA (100 nmol/10 l par site, cercles remplis) dans la joue droite des souris ont été évalués toutes les 5 min pour un total de 30 min. Analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative de l'analyse quantitative gratter (C) et essuyer (D) comportements au cours de la période de 30 min dans les panneaux A et B; n 17 pour le véhicule et n '20 pour l'APL. P et lt; 0,05,P et Lt; 0,01 par le test de Welch. Les données sont affichées sous la forme d'un SEM moyen. Ce chiffre a été modifié à partir de Kittaka et coll.5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Movie 1
Film 1: Film montrant comment raser une joue desouris. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 2
Film 2: Film démontrant l'injection dans une joue de souris. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 3
Film 3: Film démontrant le comportement typique d'essuyage. Ce film est montré à 25% de vitesse. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 4
Film 4: Film de comportement de grattage typique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 5
Film 5: Film de comportement de toilettage typique. Ce film est montré à 25% de vitesse. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Discussion

Dans cet article, un modèle d'injection de joue est présenté et montré pour être utile pour l'analyse de la douleur et des comportements liés aux démangeaisons.

Un rapport précédent a montré que les substances algiciques induisent des comportements de grattage dans un modèle d'injection de cou de souris4. En revanche, la capsaïcine a réduit les comportements de rayures dans d'autres expériences d'injection de cou (figure 3). Par conséquent, l'effet de la douleur sur le comportement de grattage reste incertain. Il est donc nécessaire de développer une méthode pour étudier simultanément la douleur et les démangeaisons par le biais de tests comportementaux. En utilisant un modèle d'injection de joue, l'effet d'une substance sur la douleur et la démangeaison peut être évalué.

Il a déjà été rapporté que l'APL intracellulaire active directement TRPV1 et TRPA1 comme un mécanisme de démangeaisons induites par l'APL5. En conséquence, la démangeaison LPA-induite pourrait être histamine indépendante. Une étude précédente a également montré qu'un modèle d'injection de joue peut être employé pour l'évaluation de la démangeaison histamine-indépendante16. Par conséquent, ce modèle peut être utilisé à la fois pour les démangeaisons dépendantes de l'histamine et -indépendantes.

L'une des étapes critiques de cette expérience est l'injection. Parce qu'il s'agit d'un test comportemental aigu, l'anesthésie ne peut pas être utilisée dans l'étape d'injection car elle pourrait affecter ces comportements. Par conséquent, la souris doit être tenue en toute sécurité afin d'effectuer une injection précise. Lorsque l'emprise sur l'animal n'est pas sécurisée, en particulier lors de l'injection d'algogènes forts, les souris peuvent lutter, conduisant à un volume d'injection inexacte et la profondeur, suivie de difficultés à interpréter les résultats. Lorsque vous manipulez une souris, tirez la peau sur la nuque entre le pouce et l'index pour inhiber le mouvement de la souris.

Une autre étape critique est l'analyse comportementale. Parce que le grattage est très rapide, la vidéo doit être regardée attentivement. En outre, l'essuyage peut être difficile à distinguer du toilettage. Par conséquent, l'utilisation de produits chimiques de contrôle positif tels que la capsaïcine est recommandée lors de la première expérience. Les conditions d'enregistrement et de relecture peuvent également affecter le comptage des deux comportements. S'il est difficile d'observer clairement les comportements, des miroirs peuvent être utilisés autour des cages pour améliorer les angles de vision4.

Il convient de noter que le modèle d'injection de jouepeut peut montrer la précision quantitative réduite pour les produits chimiques examinés que dans le modèle d'injection de cou. Comme le montre la figure 3 et la figure 4, la même quantité d'histamine induit plus de comportements de grattage dans le modèle de cou que dans le modèle de joue, et a montré de plus petites variations dans le modèle d'injection de cou. Une fois qu'une substance testée s'est avérée être un pruritogen avec de faibles effets algiciques avec le modèle d'injection de joue, le modèle d'injection de cou est recommandé pour l'analyse quantitative supplémentaire. Même avec ces limitations, le modèle d'injection de joue est utile pour l'évaluation précise des substances d'essai, particulièrement dans le domaine de la recherche de démangeaison.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants aux Drs Steven G. Shimada et Robert H. LaMotte (Yale University School of Medicine, Connecticut) dont les méthodes (référence 4) cette technique a été adaptée. Nous remercions également M. Kentaro Miyahara d'avoir créé les illustrations de souris. Cette étude a été soutenue par une subvention d'aide pour la recherche scientifique du Ministère de l'éducation, de la culture, des sports, des sciences et de la technologie au Japon (Nos 15H02501 et 15H05928 à M.T., et no 16K21691 à H.K.) et Uehara Memorial Foundation (à H.K.). Nous apprécions l'introduction de la méthode d'injection des joues par le professeur LaMotte à l'Université Yale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capsaicin Sigma M2028
Diphenhydramine hydrochloride Wako 044-19772
Histamine Sigma H7125
iMovie Apple
Lysophosphatidic acid Avanti Polar Lipids 325465-93-8
Myjector Terumo ss-05M2913
Tween-80 Sigma P4780
Video camera Panasonic VX985M

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