En detaljert protokoll for rensing og påfølgende analyse av et monoklonale antistoff fra høstet cellekultur væske (HCCF) av automatiserte microbioreactors har blitt beskrevet. Bruk av analyser for å fastslå kritiske kvalitet attributter (CQAs) og maksimere begrenset sample volum å trekke ut viktig informasjon er også presentert.
Monoklonale antistoffer (mAbs) er en av de mest populære og godt preget biologiske produkter produseres i dag. De fleste vanligvis produsert ved hjelp av kinesiske hamster eggstokk (CHO) celler, kultur og prosessforhold må optimaliseres for å maksimere antistoff titers og oppnå mål kvalitet profiler. Denne optimaliseringen bruker vanligvis automatiserte Mikroskala bioreaktorer (15 mL) til å skjermen flere prosessbetingelser parallelt. Optimaliserings kriteriene omfatter kultur ytelse og de kritiske kvalitets attributtene (CQAs) til det monoklonale antistoff (mAb)-produktet, som kan påvirke effekten og sikkerheten. Kultur resultatberegninger omfatter cellevekst og nærings forbruk, mens CQAs inkluderer mAb N-glykosylering og aggregering profiler, lade varianter, og molekylvekt. Denne detaljerte protokollen beskriver hvordan du renser og senere analyserer HCCF-prøver produsert av et automatisert microbioreactor system for å få verdifulle resultatberegninger og-utganger. Først en automatisert protein en rask protein flytende kromatografi (FPLC) metoden brukes til å rense mAb fra høstet cellekultur prøver. Når konsentrert, er glycan profilene analysert ved masse massespektrometri ved hjelp av en bestemt plattform (se tabell over materialer). Antistoff molekyl vekter og aggregering profiler bestemmes ved hjelp av størrelses ekskludering kromatografi-flere vinkel lysspredning (SEC-MALS), mens lade varianter analyseres ved hjelp av microchip kapillær sone elektroforese (mCZE). I tillegg til kultur ytelse beregningene tatt under bioreactor prosessen (dvs. kultur levedyktighet, celle telling, og felles metabolitter inkludert glutamin, glukose, melkesyre, og ammoniakk), brukt Media er analysert for å identifisere begrensende næringsstoffer til for å forbedre fôrings strategiene og den helhetlige prosess designen. Derfor er en detaljert protokoll for den absolutte kvantifisering av aminosyrer av flytende kromatografi-Mass massespektrometri (LC-MS) av brukte medier også beskrevet. Metodene som brukes i denne protokollen, utnytter plattformer med høy gjennomstrømming som er kompatible for et stort antall små volum prøver.
Protein legemiddel er brukes til å behandle en voksende rekke medisinske tilstander inkludert vev transplantasjon komplikasjoner, autoimmune sykdommer, og kreft1. Siden 2004 har USA Food and Drug Administration (USFDA) dokumentert en økende andel av biologiske lisens søknader (BLAs) av alle godkjenninger regulert av Center for Drug evaluering og forskning (CDER), med BLAs regnskap for over 25% i 2014 og 20152.
Betenke denne ekspanderer marked, biofarmasøytisk fabrikanter er angripe med rask levere flere fabrikat med gjennomført kvalitet. Arbeidet med å øke produktet yield har fokusert på CHO Cell engineering og produksjon linje screening, men de viktigste forbedringene er på grunn av fremskritt i media/feed strategi optimalisering og cellekultur miljømessige kontroller1, 3 andre priser , 4 andre priser , 5 under produksjonsprosessen.
Siden mAbs produseres i et biologisk system, kan det være iboende protein variasjon. Antistoff sammensetning kan endres etter translationally, slik som glykosylering eller påvirket av degradering eller enzymatisk reaksjoner. Disse strukturelle variasjoner kan provosere farlige immunreaksjoner eller endre antistoff binding, som igjen kan redusere eller eliminere den tiltenkte terapeutiske funksjon5. Således er kritiske kvalitet attributter (CQAs) av monoklonale antistoffer-N-glycan profil, ladning variant distribusjon, og prosentandelen av antistoff i monomere form-regelmessig overvåkes og kontrolleres som en del av en Quality by design (QbD) tilnærming under produksjonsprosesser1,6. I et regulert produksjonsmiljø må terapeutiske proteiner oppfylle aksept kriteriene for å være lisensiert som et godkjent kommersielt legemiddel produkt7. Metodene som presenteres her vil vanligvis være en del av kvalitets karakterisering prosessen for et antistoff7,8, og eventuelle protein forsker vil bli kjent med deres bruk.
I tidligere arbeid9, programmet og drift av microbioreactors for høy gjennomstrømning screening av cellekultur forhold i oppstrøms bioprosessering har blitt beskrevet. Renset produktet innhentet fra varierende medie forhold er utsatt for N-glycan analyse ved hjelp av LC-MS. glykosylering mønstre av terapeutiske proteiner kan oppdages og karakteriseres ved hjelp av LC-MS teknikker10,11, og tilstedeværelsen av ulike glycan arter har vært knyttet til bioprosessen parametre som fôr strategi, pH og temperatur12. Effekten av de varierende medie forhold på produktkvalitet, indikert av prosentandelen av den resulterende IgG i monomere form, er også evaluert med størrelses ekskludering kromatografi-multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)13,14 , 15. lade variant profilen representerer en rekke modifikasjoner16 som kan påvirke funksjonen til et produkt. Microcapillary sone elektroforese (mCZE) er en teknikk som gir en betydelig raskere analyse tid sammenlignet med tradisjonelle (CEX) kromatografi og kapillær isoelectric fokusering (cIEF) metoder som brukes for å lade variant analyse17 ,18. Tilbrakte bioreactor Media ble analysert for å spore amino acid forbruk under protein produksjon som gjelder endringer i antistoff identifisere attributter19,20,21,22 , 23på.
Protein analyse tillater oss å identifisere kritiske prosessparametre (Annonseinnholdspartnere) basert på forholdet mellom prosess innganger og endringer i CQAs. Under bioprosessen utvikling, identifisere og måle Annonseinnholdspartnere fundamentalt demonstrerer prosesskontroll og sikrer at produktet ikke har endret seg, noe som er viktig i sterkt regulerte produksjonsmiljøer. I denne utredningen, analytiske teknikker for å måle noen av de biokjemiske egenskapene til proteinet mest relevante for produktet CQAs (N-glycan profil, lade varianter, og størrelse homogenitet) presenteres.
HCCF inneholder rusk og store partikler som kan tette og ødelegge kostbare instrumentering, og dermed kultur avklaring er nødvendig før videre nedstrøms behandling. Sentrifugering er vanligvis den første tilnærmingen til å skille celler og andre uløselig partikler fra proteiner etterfulgt av filtrering. Denne filtrerte HCCF blir deretter utsatt for fast protein Liquid kromatografi (FPLC) for rensing. Rensing av HCCF fra automatiserte microbioreactors for å få produktet er et viktig skritt i nedstrøms behandling. Her, en stasjonære FPLC system med et protein en kolonne brukes til å få monoklonale antistoffer fra HCCF. Analyse for oppstrøms prosesser kan gi nyttig innsikt i celle adferd og veilede bioprosessen design, noe som bidrar til å oppnå et konsistent og pålitelig kvalitetsprodukt. I Analytics kan vi også knytte kritiske kvalitetsegenskaper (CQAs) til oppstrøms og nedstrøms prosesser. Presenteres her er fire analyser som er ofte brukt i karakterisering av monoklonale antistoffer. Disse teknikkene er robuste, pålitelige og lett å kunne distribueres for prosess-og produkt analyse fra en rekke oppstrøms kilder som bare er delvis renset og kan fortsatt inneholde gjenværende nivåer av DNA og HCP.
Når du rydder opp prøver for analyse, må det treffes en viktig balanse mellom å lage en prøve som er tilstrekkelig ren for analyse og samtidig bevare variasjonen som finnes i bioreactor. De to vanligste forurensninger som påvirker produktet er DNA og HCP, som kan kontrolleres ved å måle forholdet absorbansen ved 260/280 NM og gjennom SDS-PAGE eller μCE-SDS. Analysene som presenteres her er ikke følsomme for lave nivåer av DNA-innhold. Renheten av produktet er > 95% ren, som bestemmes av μCE-SDS.
Microcapillary elektroforese system gir en høy gjennomstrømmings metode for å identifisere lade varianter, med sjetonger og reagenser som er relativt enkle å implementere. Arten av teknikken og kjemi av merkingen reagens er både følsomme for hjelpestoffer og andre primære aminer, og dermed krever en avsaltingsspisser overlegne sammenlignet trinn for de fleste sample matriser. Av erfaring, lave nivåer av DNA co-migrere med fri-Dye fra merking reaksjonen og ikke påvirke kvaliteten på resultatene. Mens variasjon av grunnleggende, viktigste og sure peak kvantifisering er vanligvis < 1%, høyere nivåer av DNA og andre forurensninger kan øke variasjonen av analysen. Det er svært viktig å være forenlig med protein merking og sikre rask bruk av DMF etter fjerning fra flasken og blandes med fargestoff. Lysin og/eller histidin standarder anbefales som merking kontroller. Over tid og avhengig av sample kvalitet, chips kan foul eller miste belegget på materialer kanaler, fører til større støy, tilstedeværelsen av spøkelse topper, og større sample-til-sample variasjon. For å identifisere denne forekomsten, blanks og et system egnethet standard (dvs. NISTmAb) ble samtidig analysert med prøvene med jevne mellomrom. Når chip problemer oppstår, kan brikkene vaskes med lagringsløsning eller erstattes.
Metodene som brukes for glycan analyse av terapeutisk glykoproteiner primært innebærer flytende kromatografi (LC) og/eller masse massespektrometri (MS), med Lektiner Microarray analyse popularitet som et tredje alternativ25. Metoden beskrevet i denne utredningen bruker både LC og MS, som har fordeler og ulemper. Mass spectrometric metoder har fordelen av masse verifisering av analysert glykaner, som ikke er mulig med LC-baserte metoder ved hjelp av en fluorescerende deteksjon utgang eller Lektiner Microarrays. Denne metoden bruker LC og fluorescens deteksjon å tildele glycan identiteter ved hjelp av oppbevaring tid sammenligning til en dextran stigen standard. Fluorescens avlytting innrømmer for forhøyet følsomheten og kvantifisering på grunn av det lette av dens oppdagelsen, der hvor MULTIPLE SCLEROSIS alene kunne ikke være i stand til kvantifisere lav overflod art på grunn av det fattig ionisering effektiviteten av oligosaccharides. Masse informasjonen fra MS brukes til å bekrefte glycan identiteter, men behandlingsprogramvaren bruker ikke masse informasjon som de primære tilordnings kriteriene. Derfor, uten reproduserbar kromatografi og lett kan løses topper, denne metoden kan lide om glycan oppgaver. Heldigvis kan masse informasjonen hjelpe med glycan oppgaver selv i situasjoner der kromatografi er subpar, for eksempel skift i oppbevaringstid som hindrer reproduserbar glycan tildelinger. Hvis denne metoden brukes uten MS, må kromatografi være på høyeste nivå, siden masse informasjon ikke kan brukes til å korrigere for oppholdstid drift.
Aminosyren analysemetoden beskrevet her benytter LC-MS for rask kvantifisering av underivatized aminosyrer i råolje cellekultur Media. Alternative aminosyre analysemetoder krever amino acid derivatization agenter for å aktivere UV deteksjon26. LC-MS metoden gir viktige fordeler i forhold til LC-UV-metoden: det gir mulighet for identifisering basert på både oppbevaring tid og Ion masse i motsetning til LC-UV-metoden, som er begrenset av mangel på masse karakterisering. I tillegg gir LC-MS-metoden tid og reproduserbarhet fordeler, ettersom LC-UV-metoden krever en tidkrevende derivatization reaksjon, som kan formidle utvalgs variasjon27. Imidlertid, det injeksjon av grov cellen kulturen Media inne det LC-MULTIPLE SCLEROSIS metoden kanne anledning ugunstig virkninger opp på MULTIPLE SCLEROSIS signal på grunn av ion skimmer forurensning. En kalibrerings stige injiseres ofte som et system egnethet sjekk, og prøven rekkefølge er randomisert til å hindre bias i dataene.
Cellekultur prosessen for antistoff produksjon ved hjelp av microbioreactors er tidligere beskrevet9. I denne studien er detaljerte protokoller for monoklonale antistoff karakterisering metoder som maksimerer data ervervet fra begrenset utvalg volumer veldefinerte. Begrensede mengder høstet cellekultur væske kan noen ganger begrense produktinformasjonen ervervet og valg av riktige analytiske prosedyrer for å oppnå produktkvalitet data er avgjørende. Analytics er viktig å knytte sammen oppstrøms prosessparametre til endringer i produktkvalitet. Her er en retningslinje gitt for brukere å karakterisere mAbs når du arbeider med microbioreactors.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Scott lutt for den analytiske støtten han ga. Delvis intern finansiering og støtte for dette arbeidet er gitt av CDER kritisk bane program (CA #1-13). Dette prosjektet er støttet delvis av en avtale til internship/forskning deltakelse program på Office of bioteknologi produkter, US Food and Drug Administration, administrert av Oak Ridge Institute for Science and Education gjennom en Interagency avtale mellom US Department of Energy og FDA.
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
Ammonium Formate Solution – Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit – 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |