Summary
Een gedetailleerd protocol voor de zuivering en daaropvolgende analyse van een monoklonaal antilichaam uit geoogste celkweek vloeistof (HCCF) van geautomatiseerde microbioreactoren is beschreven. Het gebruik van analyses om kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te bepalen en beperkt sample volume te maximaliseren om vitale informatie te extraheren wordt ook gepresenteerd.
Abstract
Monoklonale antilichamen (mAbs) zijn een van de meest populaire en goed gekarakteriseerde biologische producten die vandaag worden geproduceerd. Meestal geproduceerd met behulp van Chinese Hamster ovarium (CHO) cellen, cultuur en procesomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd voor het maximaliseren van antilichamen Antilichaamtiters en bereiken van doel kwaliteit profielen. Deze optimalisatie maakt meestal gebruik van geautomatiseerde micro schaal bioreactoren (15 ml) om meerdere procescondities parallel te schermen. Optimalisatie criteria omvatten de cultuur prestaties en de kritische kwaliteitskenmerken (Cqa's) van het monoklonaal antilichaam (mAb) product, wat de werkzaamheid en veiligheid kan beïnvloeden. Cultuur prestatiestatistieken omvatten celgroei en nutriëntenconsumptie, terwijl de Cqa's de N-glycosylatie-en aggregatie profielen van mAb, de charge-varianten en het molecuulgewicht omvatten. Dit gedetailleerde protocol beschrijft hoe te zuiveren en vervolgens te analyseren HCCF monsters geproduceerd door een geautomatiseerde microbioreactor systeem om waardevolle prestaties metrische gegevens en outputs te krijgen. Eerst wordt een geautomatiseerde proteïne-A-methode voor snelle proteïne-vloeistofchromatografie (FPLC) gebruikt om de mAb te zuiveren van geoogste celkweek monsters. Eenmaal geconcentreerd, de ontwikkelen profielen worden geanalyseerd door massaspectrometrie met behulp van een specifiek platform (verwijzen naar de tabel van de materialen). Moleculaire gewichten en aggregatie profielen van antilichamen worden bepaald aan de hand van de grootte uitsluitings chromatografie-meervoudige hoek lichtverstrooiing (SEC-MALS), terwijl de charge varianten worden geanalyseerd met behulp van microchip capillaire zone elektroforese (mCZE). Naast de maatstaven voor cultuur prestaties die tijdens het bioreactor proces zijn vastgelegd (d.w.z. de levensvatbaarheid van de cultuur, het aantal cellen en de gemeenschappelijke metabolieten, waaronder glutamine, glucose, lactaat en ammoniak), worden verbruikte media geanalyseerd om de beperkende voedingsstoffen te identificeren Verbeter de voedingsstrategieën en het algehele procesontwerp. Daarom wordt ook een gedetailleerd protocol beschreven voor de absolute kwantificering van aminozuren door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) van verbruikte media. De methoden die worden gebruikt in dit protocol profiteren van platforms met hoge doorvoer die compatibel zijn voor grote aantallen kleine volumes.
Introduction
Eiwit therapeuten worden gebruikt voor de behandeling van een groeiende verscheidenheid aan medische aandoeningen, met inbegrip van weefsel transplantatie complicaties, auto-immune aandoeningen, en kanker1. Sinds 2004 heeft de Amerikaanse Food and Drug Administration (USFDA) een toenemend aantal biologische licentie toepassingen (BLAs) gedocumenteerd van alle goedkeuringen gereguleerd door het Center for Drug Evaluation and Research (CDER), met BLAs accounting voor meer dan 25% in 2014 en 20152.
Gezien deze groeiende markt, worden biofarmaceutische fabrikanten uitgedaagd om snel meer product met consistente kwaliteit te leveren. Inspanningen om de productopbrengst te vergroten hebben zich geconcentreerd op CHO Cell engineering en productielijn screening, hoewel de belangrijkste verbeteringen zijn te wijten aan vooruitgang in de media/feed strategie optimalisatie en celcultuur milieu-controls1, 3 , 4 , 5 tijdens het fabricageproces.
Omdat mAbs worden geproduceerd in een biologisch systeem, kan er inherente eiwit variabiliteit zijn. De samenstelling van het antilichaam kan post-translationeel worden gewijzigd, zoals glycosylatie of beïnvloed door afbraak of enzymatische reacties. Deze structurele variaties kunnen veroorzaken gevaarlijke immuunreacties of ALTER antilichaam binding, die op zijn beurt kan verminderen of elimineren van de beoogde therapeutische functie5. Zo worden kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) van monoklonale antilichamen-N-glycan-profiel, Charge-variant verdeling en het percentage van antilichamen in monomerische vorm-regelmatig bewaakt en gecontroleerd als onderdeel van een Quality by Design (QbD)-benadering tijdens productieprocessen1,6. In een gereguleerde productieomgeving moeten therapeutische eiwitten voldoen aan acceptatiecriteria om in licentie te worden gegeven als een goedgekeurd handels geneesmiddel7. De hierin gepresenteerde methoden zouden doorgaans deel uitmaken van het kwaliteits karakterisatie proces voor een antilichaam7,8, en elke eiwit wetenschapper zal bekend zijn met hun gebruik.
In eerdere werkzaamheden9werd de toepassing en werking van microbioreactoren voor een hoge doorvoer screening van celkweek condities in upstream bioprocessing beschreven. Het gezuiverde product verkregen uit de wisselende media condities wordt onderworpen aan N-glycan-analyse met LC-MS. Glycosylatie patronen van therapeutische eiwitten kunnen worden gedetecteerd en gekarakteriseerd met behulp van LC-MS-technieken10,11, en de aanwezigheid van verschillende ontwikkelen-soorten is gekoppeld aan Bioprocess-parameters zoals voeder strategie, pH en temperatuur12. Het effect van de wisselende media omstandigheden op de productkwaliteit, aangegeven door het percentage van de resulterende IgG in monomerische vorm, wordt ook geëvalueerd met de grootte uitsluitings chromatografie-multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS)13,14 , 15. het charge-variant profiel vertegenwoordigt een aantal wijzigingen van16 die van invloed kunnen zijn op de functie van een product. Microcapillaire zone elektroforese (mcze) is een techniek die een aanzienlijk snellere analysetijd biedt in vergelijking met traditionele Cation Exchange (Cex) chromatografie en capillaire ISO focus (CIEF) methoden die worden gebruikt voor de charge-variant analyse17 ,18. Verbruikte bioreactor media werd geanalyseerd om aminozuur consumptie tijdens de eiwitproductie te volgen, omdat het betrekking heeft op veranderingen in de identificerende attributen van het antilichaam19,20,21,22 , 23.
Met eiwitanalyse kunnen we kritieke procesparameters (Cpp's) identificeren op basis van de relaties tussen proces ingangen en veranderingen in Cqa's. Tijdens de ontwikkeling van Bioprocess demonstreert en meet Cpp's fundamenteel de procesbeheersing en zorgt ervoor dat het product niet is veranderd, wat essentieel is in sterk gereguleerde productieomgevingen. In dit document worden analytische technieken gepresenteerd om enkele van de biochemische kenmerken van het eiwit te meten die het meest relevant zijn voor product CQAs (N-glycan profiel, Charge varianten en grootte homogeniteit).
Protocol
1. zuivering van antilichamen
Opmerking: de evenwichts buffer voor het in-House antilichaam is 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. De gebruikte elutie buffer is 0,1 M azijnzuur. De buffers en hars (proteïne A) zijn afhankelijk van het specifieke antilichaam gezuiverd. Kolom volume is gelijk aan de Bedhoogte van de hars. De hoeveelheid mobiele fase wordt bepaald in termen van kolom volume.
- Het zuiveringssysteem initialiseren
- Open de software die aan het zuiveringssysteem is gekoppeld. Gebruik handmatige instructies om de kolom met de equilibratie buffer met een debiet van 2 mL/min voor 40 min. Stop de handmatige uitvoering na equilibratie.
- In de breuk Collector, plaats 15 mL conische buizen voor het verzamelen van gezuiverde antilichaam eluaat en 50 mL conische buizen om doorstroming te verzamelen tijdens hoge zout spoeling. Zorg ervoor dat de breuk collector wordt teruggezet naar de beginpositie door het openen en sluiten van de breuk Collector vóór het begin van de uitvoering. De breuk collector wordt op 7 °C gehouden.
Opmerking: de breuk Collector kan handmatig worden gereset onder de breuk Collector tab in instellingen, voor zowel 15 ml en 50 ml buizen.
- Monster injectie
Opmerking: de geoogste celkweek vloeistof die in de volgende procedures wordt gebruikt, is verkregen uit ovariumcellen van Chinese Hamster, gekweekt in geautomatiseerde micro-bioreactoren9.- Voeg de 0,22 μm gefilterde oogst celkweek vloeistof toe aan een lege injectiespuit van 12 mL waarvan het uiteinde van de nozzle is afgedekt.
- Houd de spuit met de nozzle naar beneden gericht en plaats de zuiger van de spuit tot een klein deel van de zuiger in. Om ervoor te zorgen dat de vloeistof niet lekt, draai de spuit met de nozzle naar boven gericht en verwijder de dop.
- Houd de spuit nog steeds met de nozzle naar boven gericht en duw de cilinder om lucht te verdrijven totdat de celkweek vloeistof zich aan de punt van het mondstuk bevindt. Plaats het mondstuk van de spuit in de handmatige injectie poort op het zuiveringssysteem en draai om vast te draaien.
- Duw de zuiger naar beneden totdat al het monster is geïnjecteerd en zichtbaar is in de bijgevoegde 10 mL grote volume monster lus.
- Open het bestand met de opgeslagen methode. Sla het resultaat bestand op de gewenste locatie op en geef de bestandsnaam op wanneer hierom wordt gevraagd. Hit Run nadat het monster is geïnjecteerd in de grote volume sample lus.
- Het uitvoeren van de zuiveringsmethode
- Selecteer de opgeslagen methode en klik op uitvoeren wanneer dit wordt gevraagd door instrument software (stap 1.2.5).
Opmerking: het systeem is ingesteld om de volgende stappen uit te voeren. De gebruiker hoeft niets te doen terwijl het instrument actief is. - De kolom met drie kolom volumes (CVs) van een evenwichts buffer met een debiet van 2 mL/min. Zodra de kolom is geëscaleerd, zal het systeem, met behulp van de grote volume-lus, het monster op de kolom injecteren met een debiet van 1 mL/min.
- Een daling van het UV-signaal bij 280 nm geeft aan dat het monster klaar is met laden. Was de kolom met een evenwichts buffer met een debiet van 2 mL/min tot het UV-signaal daalt tot beneden 25 mAU.
- Gebruik vier Cv's van 25 mM tris met 1 M NaCl bij pH 7,5 om een secundaire hoge zout spoeling uit te voeren met een debiet van 2 mL/min. De systeem breuk Collector verzamelt elk eiwit/DNA dat uit de kolom komt tijdens de zout spoeling in 50 mL buizen.
- Breng vijf Cv's van de elutie buffer aan met een debiet van 1 mL/min om het antilichaam van de kolom te elueren. Verzamel het eluaat in buizen van 15 mL op basis van UV-signaal; Wanneer het UV 280-signaal boven 35 mAU ligt, begint de collectie; de collectie eindigt wanneer het signaal daalt tot onder 50 mAU; Dit wordt Peak Cutting genoemd.
Opmerking: piek zagen zorgt voor normalisering van elutie profielen en om elutie pieken te voorkomen die eiwit aggregaten24kunnen bevatten. - Was de kolom met drie Cv's van de equilibratie buffer. De run eindigt na de Wash stap.
- Na het elutie onmiddellijk het gezuiverde eiwit neutraliseren met behulp van 1 M Tris-basis tot een pH van ~ 5,5. Meet de eiwitconcentratie met behulp van een microvolume UV-VIS spectrofotometer bij 280 nm en 260 nm en bewaar bij 4 °C.
- Concentreer het gezuiverde antilichaam met behulp van centrifugale eenheden (stap 2). Onderwerp vervolgens de gezuiverde antilichaam aan ontwikkelen analyse met behulp van LC-MS en na aggregatie profiel analyseren met behulp van SEC-MALS (stap 3 & 4).
Opmerking: het gezuiverde antilichaam mag niet worden bevroren zonder verdere buffer uitwisseling, aangezien frequente vries dooi cycli aggregatie en neerslag kunnen veroorzaken.
- Selecteer de opgeslagen methode en klik op uitvoeren wanneer dit wordt gevraagd door instrument software (stap 1.2.5).
2. concentratie van gezuiverd antilichaam
Opmerking: de Tris-acetaatbuffer is 0,1 M azijnzuur geneutraliseerd met 1 M Tris-basis tot een pH van ~ 5,5.
- Plaats 100 kDa-filters in centrifugebuizen.
- Was de filters met 500 μL dubbel gedestilleerd water. Centrifugeer 10 min bij 14.000 x g bij kamertemperatuur (RT). Herhaal deze stap twee keer. Gooi het filtraat weg.
- Breng de gesposeerde filters over naar verse centrifugebuizen en voeg aan elk filter 500 μL monster toe. Centrifugeer 10 min bij 14.000 x g.
- Keer het filter om in een nieuwe spin Tube. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 x g om het geconcentreerde monster te verzamelen.
- Bepaal de monsterconcentraties met een UV/VIS-spectrofotometer. Leeg de spectrofotometer met behulp van een oplossing van tris-acetaatbuffer. Gebruik een eiwit extinctiecoëfficiënt van 1,37 mL • (mg • cm)-1 bij 280 nm voor een 1% (% m/v) IgG oplossing.
- Gebruik het geconcentreerde monster om 12,5 μL van 2 mg/ml werkoplossing voor ontwikkelen-analyse en 30 μL 3,5 mg/ml werkoplossing voor SEC-MALS te bereiden.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. De monsters moeten worden gekoeld bij 4 °C. Bij een concentratie van 2 mg/mL moeten deze monsters gedurende ten minste drie maanden stabiel zijn bij 4 °C, terwijl hogere concentraties kunnen neerslaan.
3. analyse van N-glycans met behulp van massa spectroscopie
- N-Glycan labeling en isolatie
- Begin met antilichaamconcentraties van 2 mg/mL in een geschikte buffer, zoals neutraal natriumfosfaat, citraat of HEPES-buffer. Bereid een intacte mAb-standaard (zoals NIST mAb) op 2 mg/mL samen om de experimentele monsters te verwerken om als een positieve controle te dienen.
Opmerking: de antilichamen moeten in een uiteindelijke buffer staan met geen SDS en minder dan 0,1 mM nucleofielen (zoals Tris, DTT, glycine of histidine). SDS in de monster buffer moet worden verwijderd. Als nucleofielen zich in de buffer bevinden, verdunnen ze dan of voeren ze een buffer uitwisseling uit, omdat ze de kit zullen verstoren. Het algemene protocol is voorzien van de ontwikkelen Kit. - Verdun 7,5 μL van de antilichamen met 15,3 μL LC-MS-kwaliteit water in buizen van 1 mL die met de kit worden meegeleverd en breng vervolgens denatureren met 6 μL 5%-oplossing van een enzym vriendelijke en MS-vriendelijke oppervlakteactieve stof bij 90 °C gedurende 3 minuten.
- Laat de monsters 3 minuten afkoelen tot kamertemperatuur (RT). Voeg vervolgens 1,2 μL PNGase F toe en inincuberen gedurende 5 min bij 50 °C.
- Na het koelen van 3 min naar RT, label de gecleaved N-glycans door het toevoegen van 12 μL fluorescerende tagging reagens opgelost in watervrij dimethylformamide (DMF) en wacht 5 min. Verdun het gelabelde N-glycan mengsel met 358 μL acetonitril (ACN).
- Plaats een hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) plaat in een vacuüm spruitstuk met shims en afvalbak. Gebruik een multikanaalspipet voor grote aantallen samples.
- Conditioner de putten met 200 μL water, waar het vacuüm wordt afgesteld, zodat de vloeistof 15-30 s zal nemen om door de HILIC hars te gaan. Met 200 μl van 85% ACN voorafgaand aan het laden van het met ACN verdunde gelabelde ontwikkelen-mengsel (400 μl), waarbij het vacuüm wordt toegepast nadat elke nieuwe vloeistof aan de putjes is toegevoegd. Was de hars met 600 μL van 1% mierenzuur (FA)/90% ACN tweemaal.
- Vervang de afvalbak met 600 μL opvang buizen. Elute de gelabelde N-glycans met SPE elutie buffer (3 eluties van 30 μL per stuk) in de opvang buizen. Verdun de samengevoegde eluties met 310 μL DMF/ACN-monster verdunningsmiddel. Pipetteer de monsters in autosampler flesjes om klaar te zijn voor de fluorescentie (FLR)-MS analyse.
Opmerking: deze monsters zijn stabiel wanneer ze gedurende ten minste 1 maand bij-80 °C worden bewaard. Bewaar de HILIC plaat in de originele verpakking, dichtgeplakt en in een exsiccator voor toekomstig gebruik.
- Begin met antilichaamconcentraties van 2 mg/mL in een geschikte buffer, zoals neutraal natriumfosfaat, citraat of HEPES-buffer. Bereid een intacte mAb-standaard (zoals NIST mAb) op 2 mg/mL samen om de experimentele monsters te verwerken om als een positieve controle te dienen.
- LC-MS-analyse van gelabelde N-glycans
- Analyseer de gelabelde N-glycan elutie samples op een Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) systeem gekoppeld aan een fluorescentiedetector en quadrupool time-of-Flight (Q-ToF) massaspectrometer. Gebruik een kolom die is goedgekeurd voor chromatografische scheiding van de gelabelde glycanen en verwarm tot 60 °c tijdens scheidingen.
Opmerking: de kolom moet worden gespoeld met 60% acetonitril en 40% H2O vóór gebruik: 50 cv's vóór het eerste gebruik of 20 cv's als de kolom eerder is gebruikt.- Gebruik 50 mm ammonium formiaat (AMF) (gemaakt met mobiel fase concentraat) en 100% LC-MS-grade ACN voor de mobiele fasen. De AmF is gevoelig voor pH-veranderingen en is bruikbaar gedurende 1 maand na het mengen. Stel de initiële stroomsnelheid in op 0,4 mL/min, met de LC-gradiënt die tijdens de elutie fase een toenemende AmF biedt.
- Stel de FLR-detector in op EX 265/EM 425 nm met een bemonsteringsfrequentie van 2 Hz. Stel de Q-ToF in op de modus voor positieve Ion-gevoeligheid van de vraag, met een massa bereik van 100-2000 Daltons (da), een scantijd van 0,25 seconden en Continuum-gegevensverzameling. Gebruik Leucine enkephalin (2 ng/μL in 50% ACN/0.1% FA) voor de interne massa referentie, in de modus "niet toepassen correctie".
Opmerking: de interne massa referentie correctie wordt later toegepast tijdens de gegevensverwerking. - Onderbreek de dextran-ladder opeenvolgend in 22,5 μL van H2O, 25 ΜL DMF en 52,5 μL ACN. Bereid 10 μL aliquots voor opslag bij-80 °C, aangezien de ladder niet meer dan 24 uur stabiel is bij hogere temperaturen (kamertemperatuur, 4 °C). De dextran-ladder degradeert na meer dan één vries-dooi cyclus.
- Plaats de samples in de autosampler ingesteld op 10 °C. Laad een injectieflacon met dextran-ladder samen met monsters, omdat de retentietijd-informatie van de ladder wordt gebruikt voor opdrachten, terwijl de massa-informatie die wordt gebruikt om identificaties te valideren. Gebruik 10 μL injecties voor de monsters en 7,5 μL injecties voor de ladder. Injecteer monsters in drievlaat. Voer de geladen methode uit.
- Analyseer de gelabelde N-glycan elutie samples op een Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) systeem gekoppeld aan een fluorescentiedetector en quadrupool time-of-Flight (Q-ToF) massaspectrometer. Gebruik een kolom die is goedgekeurd voor chromatografische scheiding van de gelabelde glycanen en verwarm tot 60 °c tijdens scheidingen.
- N-Glycan-identificatie voor LC-MS-gegevens
- Voer gegevensverwerking uit met een programma dat is geoptimaliseerd voor hydrofiele interactie chromatografie fluorescentie Mass spectrometrie (HILIC-FLR-MS) gegevens.
- Interne massa referentie correcties binnen het programma toepassen. Wijs de dextran ladder injecties aan als "standaard" in de voorbeeld informatie. In de analysemethode, stel de scheiding samengestelde retentietijden aan die van de ladder verbindingen die werden gedetecteerd tijdens de run.
- Om ervoor te zorgen dat Area% wordt geretourneerd voor geïdentificeerde glycans, wijzigt u de analysemethode: Klik onder het tabblad processing op Kwantatie-instellingen -Kalibreer en stel "kalibratiecurve passend type" in op "relatieve respons (%)".
4. analyse van antilichaam aggregatie met SEC-MALS
- Monstervoorbereiding
- Breng de 3,5 mg/mL (stap 2) verdunde eiwitten over in een injectieflacon met een glazen wisselplaat van 150 μL. Gebruik een gel loading tip om te pipet in de onderste Bel van de INSERT om te voorkomen dat de invoering van bubbels.
- Dop de injectieflacon met een septa dop en analyseer onmiddellijk. Bewaren bij 4 °C als u later analyseert.
- Configuratie van SEC-MALS en equilibratie
Opmerking: Analyseer aggregatie op SEC-MALS die is geconfigureerd met een ultra hogedrukvloeistofchromatografie (UHPLC) met een MALS-detector en een brekings index-detector die wordt aangestuurd door de MALS-software.- Configureer een methode bestand in de UHPLC-software voor de besturing van het UHPLC-systeem, waarbij de stroomsnelheid wordt ingesteld op 0,4 mL/min met een mobiele fase van 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (verdund van 10x), het injectievolume tot 5 μL, de kolomtemperatuur tot 25 °C en de diode array detector (DAD) om 280 nm te bewaken. Stel de uitvoeringstijd in op 20 min. het systeem wordt gedurende ten minste 4 uur op een bepaald moment vóór de analyse van het monster ingesteld.
- De interface tussen UHPLC en multi angle lichtverstrooiing-refractive index (MALS-RI) detectoren vereist het gebruik van de analoge uitgang op de vader. Stel de DAD demping in op 1.000 mAU in het DAD Method bestand en AU/UV-instelling op 1 (UV-instrument ≫ kanalen ≫ kanaal 1).
- Zet de DAD lamp 30 min vóór aanvang van de analyse aan en stel de golflengte in op 280 nm. Op hetzelfde moment, de refractive index (RI) referentiecel verwijderen voor 15 min of totdat de basislijn stabiel is en sluit vervolgens de referentiecel.
- Configureer de reeks SEC-MALS software, stel de afhaaltijd in op 12 minuten, het injectievolume tot 5 μL, de DN/DC tot 0,185 mL/g, A280 extinctiecoëfficiënt indien eerder experimenteel bepaald of tot 1,37 mL * (mg * cm)-1, en de concentratie van de Monster. Klik op uitvoeren en wacht tot het dialoogvenster ' wachten om te injecteren ' op het scherm wordt weergegeven.
Opmerking: de A280 extinctiecoëfficiënt is specifiek voor het eiwit van belang en moet experimenteel worden bepaald. - Configureer een voorbeeld lijst in de UHPLC-software in dezelfde volgorde als in de MALS-RI-software en dien deze in.
Opmerking: het is belangrijk om een systeem geschiktheidscontrole voor en na een run uit te voeren. Boviene serumalbumine wordt meestal gebruikt om te controleren op piek verbreding, een teken dat de SEC-kolom moet worden gereinigd of vervangen. Dezelfde BSA standaard injectie kan worden gebruikt om de signaal uitlijning, piek verbreding en detector normalisatie op te geven.
-
Statistische analyse met MALS-software
- Klik op het tabblad gemarkeerde procedures. Specificeer het minimumniveau van ontspiking vereist; geen van beide is meestal voldoende.
- Controleer of de basislijnen op de juiste wijze zijn getekend en stel deze zo nodig in voor LS1-, LS2-, LS3-, RI-en UV-kanalen. Stel het piek gebied in.
- Controleer de moleculaire massaverdeling om te bevestigen dat de opgeroepen pieken deeltjes van vergelijkbare grootte bevatten.
5. charge-variant analyse
- Monstervoorbereiding en etikettering
- Begin met 80 μL van een oplossing van 3,5 mg/mL antilichamen. Ontzout het monster met een ontzilting kolom van 0,5 mL (7k MWCO). Bereid de kolom voor door het eerst van de onderste stop te snappen, vervolgens de bovenste stop los te maken en deze in een micro centrifugebuis van 1,7 mL te plaatsen. Centrifugeer de ontdesalting kolom gedurende 1 minuut bij 1.500 x g.
Opmerking: Markeer de buitenkant van de kolom met een punt zodat deze in de oorspronkelijke richting voor de volgende stappen kan worden geplaatst. - Breng de kolom over naar een nieuwe micro centrifugebuis. Voeg de 80 μL verdund eiwit toe aan de bovenzijde van de kolom. De kolom uitlijnen met de oorspronkelijke afdrukstand. Centrifugeer 2 min bij 1.500 x g. Verwijder het monster uit de centrifuge, gooi de ontdesalting kolom weg en meng het monster goed.
Opmerking: Desalting is alleen vereist als de monstermatrix primaire aminen bevat, hulpstoffen die de monster elektroforese of andere onverenigbare stoffen zullen pertureren. - Verdun het monster tot een eindconcentratie van 2 mg/mL in een volume van 25 μL en voeg 5 μL van de etiketterings buffer toe (Zie tabel met materialen: Charge variant reagens Kit) in de 96-well plate. Bereid het etiketterings reagens door de benodigde hoeveelheid etiketteer reagens te verdunen (Zie tabel met materialen: Charge variant reagens Kit) 1:30 in dimethylformamide. Incuberen het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, weg van het licht.
Opmerking: het is belangrijk om dit reagens te ontdooien en vervolgens onmiddellijk te gebruiken en het binnen 10 minuten na menging met DMF te gebruiken. - Voeg na incuberen 60 μL reagens kwaliteit water toe en meng goed door pipetten. Bedek de plaat met een plaat afdichting en centrifugeer de plaat bij 1.000 x g gedurende 1 minuut.
- Begin met 80 μL van een oplossing van 3,5 mg/mL antilichamen. Ontzout het monster met een ontzilting kolom van 0,5 mL (7k MWCO). Bereid de kolom voor door het eerst van de onderste stop te snappen, vervolgens de bovenste stop los te maken en deze in een micro centrifugebuis van 1,7 mL te plaatsen. Centrifugeer de ontdesalting kolom gedurende 1 minuut bij 1.500 x g.
- De charge-variant chip voorbereiden
- Bereid de charge-variant chip voor door de opslagoplossing te verwijderen en Wells 1, 3, 4, 7, 8 en 10 met water te wassen. Vervang dan het water met pH 7,2 lopende buffer (Zie tabel met materialen: Charge variant reagens Kit).
- Voeg 750 μL pH 7,2 lopende buffer toe aan de buffer buis en plaats de buffer buis op de aangegeven plaats in de linkerbovenhoek van de monsterhouder. Verwijder nu de plaat afdichting van de 96-goed plaat, druk op de ontlaad plaat op de gebruikersinterface van het instrument en steek de plaat in de gxii-monsterhouder.
Opmerking: voor deze analyse werden pH 7,2-buffers gebruikt. afhankelijk van de proteïne-pI kunnen pH 5.6-7.2 buffers worden gebruikt. Bij het gebruik van lagere pH-buffers kan het voorkomen dat er langere looptijden nodig zijn. - Druk op de knop ontlaad chip op de gebruikersinterface. Zorg ervoor dat de elektroden vrij zijn van eventuele deeltjes, en zo niet, reinig met een pluisvrij wattenstaafje. Bij het inbrengen van de chip zorg ervoor dat het venster in het midden van de chip vrij is van deeltjes of vlekken. Reinig indien nodig met een pluisvrije, zachte doek.
Opmerking: wanneer u werkt met capillaire elektroforese chips, verwijder buffer door vacuüm aspiratie, gevolgd door de onmiddellijke toevoeging van de volgende oplossing om te voorkomen dat putten uitdrogen. Om de introductie van bubbels te minimaliseren, oefen omgekeerde pipetteertechniek. Let bij het hanteren van de chip op het fragiele capillair dat zich uitstrekt van de bodem van de chip, en zorg ervoor dat het niet uitdroogt en niet doorbreekt met ruwe behandeling. - Sluit de deksel naar de spaan kamer en selecteer de HT eiwit charge variant assay. Klik op de knop uitvoeren . Volg de aanwijzingen om de monster putten, het plaat type, de testtijd (68, 90 of 100 s) en de bestandsnaam te selecteren. Klik op Start aan het einde van de prompts.
- Spaan opruiming vereist het wassen van elk goed 2x met water, gevolgd door de toevoeging van opslag buffer (Zie tabel met materialen: Charge variant reagens Kit). Eenmaal in opslag buffer, vervang de chip in het instrument en, wanneer u hierom wordt gevraagd, selecteert u de HT proteïne charge assay. Selecteer op het hoofdscherm wassen op de gebruikersinterface. Eenmaal voltooid, verwijder de chip, veeg de elektroden met water en een pluisvrij wattenstaafje, en bewaar de chip bij 4 °C.
- Analyse van charge-variant
- Open de instrumentanalyse software. Importeer de uitvoeren door te gaan naar bestand ≫ gegevensbestand te importeren... en op het gewenste *. gxd-bestand te klikken. Alleen de naam wordt overgedragen naar software, dus het hernoemen van de Wells is voordelig (Tools ≫ sample name editor). Selecteer de bestanden die u wilt exporteren door SHIFT ingedrukt te houden terwijl u de bestanden selecteert. Klik op bestand ≫ exporteren... en selecteer de onbewerkte gegevens vak en vervolgens de Aia-indeling vak.
- Open het tabblad Browse projecten in de analyse software. Klik op database ≫ gegevens importeren... en selecteer de geëxporteerde *. CDF-bestanden.
- Eenmaal geïmporteerd, navigeer naar de injecties tab, selecteer de bestanden worden geanalyseerd, klik met de rechtermuisknop en ga naar proces... Schakel in het venster dat verschijnt het selectievakje naast verwerken in en selecteer het keuzevakje ' gespecificeerde verwerkingsmethode gebruiken ' en de gewenste verwerkingsmethode in de vervolgkeuzelijst. In de vervolgkeuzelijst direct onder gelabeld "How:" Selecteer kalibreren en Quantitate. Na verwerking navigeert u naar het tabblad resultaten en controleert u de integratie van de chromatogrammen.
Opmerking: de verwerkingsmethode moet voor elke methode worden geverifieerd. Als uitgangspunt worden de parameters die worden gebruikt voor de huidige verwerkingsmethode opgenomen in het aanvullende bestand.
Opmerking: het exporteren van de gegevens kan worden gedaan in de vorm van een rapport of alleen de piek kwantificering kan worden geëxporteerd. Deze kunnen worden uitgevoerd op dezelfde tijd als de verwerking of in het resultatenvenster.
6. aminozuuranalyse
- De standaard curve instellen voor absolute aminozuur kwantificering door LC-MS
- Bereid het verlengde aminozuur mengsel (EAA) door het oplossen van 59,45 mg ASN, 59,00 mg HYP, 65,77 mg GLN en 91,95 mg TRP in 25 mL 0,1 N HCl. De uiteindelijke concentratie van elk aminozuur in het EAA-mengsel is 18 nmol/μL.
- Bereid de interne standaard (ISTD) stockoplossing voor door het oplossen van 58,58 mg NVA en 44,54 mg SAR in 50 mL HCl.
- Bereid de volledige aminozuur normen door de aminozuur voorraadoplossing te combineren met Ala, ASP, ARG, CYS, Glu, gly, his, Ile, Leu, met, PHE, Pro, ser, thr, TRP, Tyr, val bij 1 nmol/μL, elk met het EAA mengsel voor de uiteindelijke aminozuur concentraties van 900 , 225, 90, 22,5 en 9 pmol/μL. Voeg de bereide ISTD-kolf toe aan de aminozuur normen voor een uiteindelijke concentratie van ofwel 90 pmol/μL of 900 pmol/μL om "lage" en "hoge" interne normen te creëren die als positieve controles voor de methode moeten worden gebruikt.
- Plaats de aminozuur concentraties in monster flesjes in de autosampler van de UPLC. Genereer een ijkcurve (9 tot 900 pmol/μL) in de instrument software op basis van de aminozuur standaardconcentraties aan de hand van de volgende instructies.
- Gebruik de Q-ToF in de positieve gevoeligheids modus voor elektro spray ionisatie (ESI) gekoppeld aan een UPLC voor intacte aminozuuranalyse. Gebruik voor chromatografische scheiding een normale fase kolom die is gemaakt voor aminozuur separaties. Bereid de volgende buffers met massaspectrometrie kwaliteit reagentia: A = acetonitril + 0,1% mierenzuur en B = 100 mM ammonium formaat. Stel de LC-stroomsnelheid in op 0,6 mL/min en kolomtemperatuur tot 40 °C.
- Gebruik de volgende verloop condities van 15 minuten voor aminozuur separaties: 14% B (0-3 min), 14-100% B (3-10 min), 100% B (10-13 min), 100-8% B (13-14 min), 8% B (14-15 min).
- Gebruik de kolom vermeldingen ' sample type ' en ' conc A ' in het MS Acquisition-programma om een kalibratiecurve te maken voor toekomstige analyse van ruwe bioreactor media in het quantitatie programma. Als u wilt dat deze kolommen worden weergegeven in het verwervings programma, gebruikt u de opdracht scherm aanpassen... wanneer u met de rechtermuisknop op de bovenste menubalk klikt.
- Het type monster voor de aminozuur normen zal "standaard" zijn, terwijl de media samples "analyt" zullen zijn. Vul de kolom "conc A" in met de numerieke concentraties van de normen in de vereiste eenheden (bijv.: pmol/μL).
- Voer de voorbereide aminozuur standaardconcentraties ten minste tweemaal uit. Valideer dat het UPLC-instrument en de massaspectrometer goed werken door de ISTD-pieken te controleren.
- Gebruik de optie methode bewerken in de kwantatie toepassing om de kwantatie methode (*. mdb-bestand) te maken. Definieer alle aminozuren van belang in de kwantitatie toepassing, zoals de samengestelde naam, de m/z-waarde en de verwachte retentietijd. Wijzig de integratieparameters voor de methode hier.
- Gebruik de gemaakte aminozuur methode op de standaard samples om de kalibratiecurve te maken. Deze curve kan worden geëxporteerd naar een *. cdb-bestand voor gebruik met de mediavoorbeelden met de opdracht Export ≫ Calibration...
- Sla in de toepassing quantitatie de gewenste indeling op in een *. QLT-bestand om toe te passen op toekomstige gegevenssets met "Save layout as...". Naam (injectie naam), gebied en conc zijn de belangrijkste uitvoerkolommen.
- Aminozuuranalyse van ruwe bioreactor media door LC-MS
- Centrifugeer ruwe bioreactor-media bij 1.962 x g gedurende 5 minuten en door een 0,22 μm-filter.
- Follow-up met perchloorzuur opruimen om eiwitten en fijnstof te verwijderen: Meng de gefilterde bioreactor-media met 0,4 N HClO4 bij een 1:1-verhouding en centrifugeer bij 14.700 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verzamel de geklaarde media in injectieflacons met autosampler.
Opmerking: pas het injectievolume zo nodig aan om de aminozuur concentraties binnen het kalibratie bereik te laten vallen. Afhankelijk van het instrument kan het injectievolume worden afgesteld tussen 0,1 μL en 10 μL. - Voer mediavoorbeelden uit in drievoud door LC-MS. gebruik "Process samples" onder het quantitatie programma samen met de methode (*. mdb) en het kalibratie bestand (*. cdb). De methode en kalibratiecurve zullen automatisch worden toegepast op de ruwe media monsters door de kwantitatie toepassing zodra alle injecties zijn voltooid.
- Als u gegevens wilt exporteren voor analyse in een ander programma (zoals een werkblad), gebruikt u de opdracht 'afdrukken' en maakt u een *. XPS-of *. PDF-bestand.
Representative Results
De geoogste celkweek vloeistof uit de geautomatiseerde micro schaal bioreactor wordt gezuiverd met behulp van snelle eiwit vloeistofchromatografie (FPLC), zoals te zien in Figuur 1 en de kritische kwaliteitskenmerken van de gezuiverde eiwitten (CQAs) werden gekenmerkt door verschillende downstream analytische methoden. Dit is een belangrijk voordeel van het geautomatiseerde microbioreactor systeem; verschillen in CQAs kunnen snel worden beoordeeld in een breed scala aan voorwaarden. N-glycan-gegevens van met CHO geproduceerde mAbs die door massaspectrometrie worden verwerkt, moeten worden weergegeven als de chromatogrammen in Figuur 2. De figuur toont een vergelijking tussen twee chromatogrammen waaruit blijkt dat de mannose 5 piek (M5) uit één monster aanzienlijk lager is. Als er slechts een lawaaierige basislijn wordt waargenomen in plaats van pieken, kan dit betekenen dat de chromatografie-instelling defect is of dat de procedure niet lukt. Met behulp van besturingselementen, kan het oplossen van problemen worden vereenvoudigd. Beoordeel eerst de FLR toppen van de dextran ladder; Deze pieken geven aan dat het chromatografische systeem correct functioneert. Vergelijk vervolgens de experimenteel verkregen pieken met die verkregen uit een verwerkte intact mAb-standaard. Als pieken van de standaard zichtbaar zijn, maar er geen monster pieken worden geïdentificeerd, zijn de mAb-monsters niet correct verwerkt. Dit kan het gevolg zijn van SDS of nucleofiele aanwezigheid in de buffer die interfereert met N-glycan-labeling en-zuivering.
SEC-MALS kan worden gebruikt om twee Cqa's te beoordelen: het aggregatie profiel en het molecuulgewicht van het antilichaam. Een representatief SEC-MALS chromatogram is vergelijkbaar met dat van Figuur 3. De moleculaire massaverdeling en het absolute molecuulgewicht werden bepaald met behulp van de vereiste software met een extinctiecoëfficiënt van 1,37 mL * (mg * cm)-1 en een DN/dc van 0,185 ml/g. Als piek bellen en het instellen van de basislijn in de software handmatig wordt uitgevoerd, resultaten kunnen enigszins afwijken van gebruiker tot gebruiker. Het absolute molecuulgewicht van monomerische IgG1 uit Figuur 3 is 1,504 x 105 da ± 0,38% (blauw) en het hogere order complex is 7,799 x 105 da ± 3,0% (rood). De polydispersiteit van de aggregaten is veel groter dan die van het monomeer, zoals aangegeven door de rode molaire massaverdeling van piek 1 (Figuur 3). De kleine hoeveelheid van het monster en het belang van aggregatie als een CQA maken deze techniek een zeer waardevol aanvullend analytisch instrument voor het geautomatiseerde microbioreactor systeem.
Het resultaat van mCZE is een electropherogram, zoals in Figuur 4, dat het charge-variant profiel voor een monoklonaal antilichaam toont. Het profiel is een unieke handtekening voor het onderzochte eiwit en is zeer gevoelig voor de pH van het bedrijf. Ook zichtbaar is een vrije-kleurstof piek links van het charge-variant profiel. Bij het vaststellen van een bedrijfs pH is er enige discretionaire bevoegdheid voor de machinist om de resolutie en het signaal te balanceren; Bovendien moet de exploitant zorgen voor een goede scheiding van de vrije-kleurstof piek die op ~ 30 s wordt gemigreerd. Het monster kan na de etikettering worden ontleden om deze piek te verwijderen, hoewel dit leidt tot een significant verlies aan signaal. Zodra een operationele pH is vastgesteld, kunnen de monster profielen worden vergeleken. Hoewel het over het algemeen consistent is, kunnen veranderingen in de etiketterings efficiëntie of verschillen in hulpstoffen leiden tot kleine verschillen in de migratie van een monster en het charge-variant profiel waardoor electropherogrammen moeilijk te vergelijken zijn. In plaats daarvan is de vergelijkingsmethode meestal gebaseerd op de percentages basis-, hoofd-en zure soorten. In dit geval kunnen relatieve verschillen zo klein als 1-2% worden geïdentificeerd met behulp van mCZE.
Aminozuur verbruik kan worden gecontroleerd om te bepalen of uitputting veranderingen in CQAs veroorzaakt. Chromatogram uitlezingen van de massaspectrometer kunnen worden gebruikt voor het evalueren van de succesvolle aanmaak van een ijkcurve voor de absolute kwantificering van aminozuren in ruwe bioreactor media monsters. Figuur 5 toont twee totaal ionen CHROMATOGRAMMEN (TIC) en één geëxtraheerd ionen chromatogram (xic) als representatieve resultaten tijdens dit proces. In Figuur 5Atoont de getoonde tic het achtergrond signaal van het buffersysteem omdat er slechts een water Blank werd geïnjecteerd. Figuur 5 B toont een representatieve tic van de aminozuur standaard waar, in vergelijking met het water blank, kleine pieken die overeenkomen met de individuele aminozuur soorten kunnen worden waargenomen (zoals lysine op 7,96 minuten). Om de piek te integreren en de kwantificering van het piek gebied (en dus de concentratie) te vergemakkelijken, wordt de XIC gebruikt waarbij alleen het signaal van een gedefinieerd "chromatogram Mass Window" wordt weergegeven. Afhankelijk van de gevoeligheid van het instrument en de kwaliteit van de chromatografische scheiding, zal het optimale massa venster door de gebruiker moeten worden bepaald. In dit voorbeeld (Figuur 5C) wordt de xic van lysine (m/z = 147,1144) met een massa venster van 10 ppm weergegeven waar lysine in het aminozuur standaard uit de kolom op 8,03 minuten afgaat.
Figuur 1 . Representatief chromatogram van het zuiverings schema met behulp van de snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC)-techniek. De fasen van de zuiveringsmethode die overeenkomen met volume (mL) worden gelabeld langs de x-as. De UV-extinctie bij 280 nm (mAU y-as, ononderbroken lijn) wordt gedurende de zuiveringscyclus bewaakt. Niet-specifiek gebonden onzuiverheden worden verplaatst door het verhogen van de geleidbaarheid (mS/cm y-as, onderbroken lijn) tijdens de hoge zout wassing. het antilichaam wordt van proteïne een kolom voorzien met de introductie van elutie buffer (conc B, gestippelde lijn) wanneer de pH daalt tot 4 (niet weergegeven). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Een representatief fluorescentie chromatogram dat is verkregen van gelabelde glycanen die massa zijn geverifieerd. De x-as is retentietijd (minuten), terwijl de y-as de signaalintensiteit is. De piek op 14,94 min vertegenwoordigt de mannose 5 (M5) glycan, waar een groot verschil tussen de sterkte van de M5 signaal kan worden waargenomen tussen de twee monsters die worden overgelegd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Moleculaire gewichtsverdeling van IgG1 monoklonaal antilichaam. Chromatogram van een intact IgG1 monoklonaal antilichaam, gescheiden door de grootte van de uitsluitings chromatografie in 1x PBS (pH 7.4). De extinctie wordt gecontroleerd bij 280 nm (zwart; linker as) en lichtverstrooiing en brekingsindex detectoren werden gebruikt om het absolute molecuulgewicht van elke piek (rood en blauw; rechter as) te berekenen. Hoog moleculair gewicht soorten worden aangeduid met de piek met het label "HMW". Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 . Charge-variant Profiel van een IgG1 monoklonaal antilichaam. Dit elektroferogram wordt gegenereerd op een mcze-platform. Een Free-Dye piek migreert op ~ 30 s en is goed gescheiden van de IgG1. Voor kwantificering werden pieken opgesplitst in basis-, hoofd-en zure soorten met behulp van instrument data analysis software. De rode lijn schetst de geïntegreerde piek gebieden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. Representatieve resultaten van de ionchromatogrammen voor op massaspectrometrie gebaseerde aminozuuranalyse van ruwe bioreactor media. De x-as is tijd (minuten), terwijl de y-as signaalintensiteit (a) een water blank dient als de negatieve controle en onthult het achtergrond signaal waargenomen in de loop van de vloeistofchromatografie gradiënt (B) het aminozuur 225 pmol/μL Standaard wordt hier gebruikt als een positieve controle, aangezien de individuele pieken die in dit totale ionen chromatogram worden waargenomen de verschillende aminozuren vertegenwoordigen van de standaard mix die chromatografisch wordt opgelost (C) een representatief geëxtraheerd ionen chromatogram voor m /z 147,1144, dat is lysine. De 7,96 min piek in B komt overeen met de 8,03 piek in C van lysine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
HCCF bevat puin en grote deeltjes die kostbare instrumentatie kunnen verstoppen en vernietigen, dus cultuur verduidelijking is nodig voor verdere downstream-verwerking. Centrifugeren is over het algemeen de eerste benadering van het scheiden van cellen en andere onoplosbare deeltjes uit eiwitten gevolgd door filtratie. Deze gefilterde HCCF wordt vervolgens onderworpen aan snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) voor zuivering. Zuivering van HCCF van geautomatiseerde microbioreactoren om het product te verkrijgen is een belangrijke stap in de downstream-verwerking. Hier wordt een tafel fplc-systeem met een eiwit kolom gebruikt om monoklonale antilichamen van de hccf te verkrijgen. Analyses voor upstream-processen kunnen nuttig inzicht bieden in Celgedrag en het ontwerp van Bioprocess begeleiden, waardoor een consistent en betrouwbaar kwaliteitsproduct wordt verkregen. Analytics stelt ons ook in staat kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te koppelen aan upstream-en downstream-processen. Hier zijn vier assays die vaak worden gebruikt bij de karakterisering van monoklonale antilichamen. Deze technieken zijn robuust, betrouwbaar en gemakkelijk inzetbaar voor proces-en productanalyse uit verschillende upstream bronnen die slechts gedeeltelijk gezuiverd zijn en nog steeds restniveaus van DNA en HCP kunnen bevatten.
Bij het opschonen van monsters voor analyse moet een belangrijk evenwicht worden gevonden tussen het creëren van een voldoende schoon te maken sample, waarbij de variabiliteit in de bioreactor behouden blijft. De twee meest voorkomende verontreinigingen die van invloed zijn op het product zijn DNA en HCP, die kunnen worden gecontroleerd door meting van de absorptie ratio bij 260/280 nm en via SDS-PAGE of μCE-SDS. De hier gepresenteerde assays zijn niet gevoelig voor lage niveaus van DNA-inhoud. De zuiverheid van het product is > 95% zuiver, zoals bepaald door μCE-SDS.
De charge-variant analyse met een microcapillair elektroforese systeem biedt een hoge doorvoer methode om Laad varianten te identificeren, met chips en reagentia die relatief eenvoudig te implementeren zijn. De aard van de techniek en de chemie van het etiketteer reagens zijn zowel gevoelig voor hulpstoffen als andere primaire aminen, waardoor voor de meeste monster matrixen een ontziltings-stap nodig is. Uit ervaring, lage niveaus van DNA co-migreren met de Free-Dye van de labeling reactie en hebben geen invloed op de kwaliteit van de resultaten. Hoewel de variabiliteit van basis-, hoofd-en zure piek kwantificering typisch < 1% is, kunnen hogere niveaus van DNA en andere verontreinigingen de variabiliteit van de assay verhogen. Het is uitermate belangrijk om consistent te zijn met de eiwit etikettering en ervoor te zorgen dat DMF snel wordt gebruikt na verwijdering uit de fles en vermengd met de kleurstof. Lysine en/of histidine normen worden aanbevolen als labeling besturingselementen. Na verloop van tijd en afhankelijk van de kwaliteit van het monster kunnen chips de coating op de microfluïdica-kanalen overtreding of verliezen, wat leidt tot meer ruis, de aanwezigheid van spook pieken en een grotere variatie in monster-to-sample. Om dit voorval te identificeren, werden blanco's en een standaard voor systeem geschiktheid (d.w.z. NISTmAb) gelijktijdig met de monsters geanalyseerd met regelmatige intervallen. Wanneer chip problemen ontstaan, kunnen de chips worden gewassen met de opslagoplossing of vervangen.
De methoden die worden gebruikt voor ontwikkelen-analyse van therapeutische glycoproteïnen betreft voornamelijk vloeistofchromatografie (LC) en/of massaspectrometrie (MS), waarbij lectine microarray-analyse aan populariteit wint als derde optie25. De in dit artikel beschreven methode maakt gebruik van zowel LC als MS, wat voordelen en nadelen heeft. Massaspectrometrische methoden hebben het voordeel van massale verificatie van de geanalyseerde glycans, wat niet mogelijk is met LC-gebaseerde methoden met behulp van een fluorescerende detectie-uitgang of lectine micro arrays. Deze methode gebruikt LC-en fluorescentiedetectie om ontwikkelen-identiteiten toe te wijzen met behulp van retentietijd vergelijking met een dextran-ladder standaard. Fluorescentie bewaking zorgt voor een verhoogde gevoeligheid en kwantificering door het gemak van de detectie, waarbij MS alleen niet in staat zijn om lage abundantie soorten te kwantificeren als gevolg van de slechte ionisatie-efficiëntie van oligosacchariden. De massa-informatie van MS wordt gebruikt om ontwikkelen-identiteiten te bevestigen, maar de verwerkingssoftware gebruikt geen massa-informatie als de primaire toewijzingscriteria. Vandaar, zonder reproduceerbare chromatografie en gemakkelijk te afwikkelen pieken, deze methode kan lijden met betrekking tot ontwikkelen toewijzingen. Gelukkig kan de massa-informatie helpen bij ontwikkelen-toewijzingen, zelfs in situaties waarin de chromatografie subpar is, zoals verschuivingen in de retentietijd die reproduceerbare ontwikkelen-toewijzingen belemmeren. Als deze methode zonder MS wordt gebruikt, moet de chromatografie zich op het hoogste niveau bevinden, aangezien massa-informatie niet kan worden gebruikt om te corrigeren voor tijd drift van verblijf.
De hier beschreven aminozuuranalyse methode gebruikt LC-MS voor snelle kwantificering van underivatized aminozuren in ruwe celkweek media. Alternatieve aminozuuranalyse methoden vereisen aminozuur bewerking agenten om UV-detectie in te schakelen26. De LC-MS-methode biedt belangrijke voordelen ten opzichte van de LC-UV-methode: het maakt identificatie mogelijk op basis van zowel de retentietijd als de ionen massa in tegenstelling tot de LC-UV-methode, die wordt beperkt door een gebrek aan massa karakterisering. Bovendien biedt de LC-MS-methode tijd-en reproduceer baarheids voordelen, aangezien de LC-UV-methode een tijdrovende Derivatiserings reactie vereist, die sample variabiliteit27kan veroorzaken. De injectie van ruwe celkweek media in de LC-MS-methode kan echter nadelige effecten op het MS-signaal veroorzaken als gevolg van het fouling van Ion skimmer. Een kalibratie ladder wordt regelmatig geïnjecteerd als een systeem geschiktheidscontrole, en sample order wordt gerandomiseerd om bias in de gegevens te voorkomen.
Het celkweek proces voor de productie van antilichamen met behulp van microbioreactoren wordt eerder beschreven9. In deze studie zijn gedetailleerde protocollen voor monoklonaal antilichaam karakterisatie methoden die de gegevens van beperkte monstervolumes maximaliseren, goed gedefinieerd. Beperkte hoeveelheden geoogste celkweek vloeistof kunnen soms de verkregen productinformatie beperken en de selectie van de juiste analytische procedures om productkwaliteits gegevens te verkrijgen is essentieel. Analytics zijn belangrijk om upstream-procesparameters te koppelen aan de wijzigingen in de productkwaliteit. Hier wordt een richtlijn gegeven voor gebruikers om mAbs te karakteriseren bij het werken met microbioreactoren.
Disclosures
Deze publicatie weerspiegelt de standpunten van de auteur en mag niet worden geïnterpreteerd om de FDA-weergaven of-beleid weer te geven.
Acknowledgments
De auteurs willen Scott Lute bedanken voor de analytische ondersteuning die hij heeft verstrekt. Gedeeltelijke interne financiering en ondersteuning voor dit werk wordt geleverd door de CDER Critical Path Program (CA #1-13). Dit project wordt deels ondersteund door een aanstelling in het stage/Research participatie programma op het kantoor van biotechnologie producten, U.S. Food and Drug Administration, beheerd door het Oak Ridge Institute for Science and education via een interagentuur overeenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van energie en FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
| Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
| Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
| µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
| 0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
| 10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
| 1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
| 1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
| 1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
| 1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
| 15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
| 150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
| 96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
| ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
| ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
| ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
| Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
| Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
| Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
| Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
| Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
| Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
| Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
| Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
| Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
| GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
| GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
| GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
| GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
| GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
| Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
| Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
| Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
| Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
| Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
| RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
| Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
| TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
| UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
| Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
| Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
| Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
| Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |
References
- Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).
- New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA. , Available from: https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm (2015).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127, 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).
- Rathore, A. S. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).
- International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH. , ed specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Q6B (1999).
- Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level. Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).
- Yang, J. -M., et al. Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).
- Agarabi, C. D., et al. Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
- Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).
- Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).
- Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
- Han, H., Livingston, E., Chen, X. High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis. Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).
- Wheeler, T. D., et al. Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants. Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).
- Carrillo-Cocom, L., et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).
- Chen, P., Harcum, S. W. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells. Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).
- Xing, Z., et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).
- Fan, Y., et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation. Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).
- Read, E. K., et al. Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture. Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).
- Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).
- Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
- Wahl, O., Holzgrabe, U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 154, 150-163 (2016).
- Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).
