Summary
Un protocole détaillé pour la purification et l'analyse suivante d'un anticorps monoclonal du fluide de culture cellulaire récolté (HCCF) des microbioréacteurs automatisés a été décrit. L'utilisation de l'analyse pour déterminer les attributs de qualité critiques (CqA) et la maximisation du volume limité de l'échantillon pour extraire des informations vitales sont également présentées.
Abstract
Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont l'un des produits biologiques les plus populaires et les plus bien caractérisés fabriqués aujourd'hui. Le plus souvent produit à l'aide de cellules, de cultures et de conditions de processus de hamster chinois (CHO) doivent être optimisés pour maximiser les titreleurs d'anticorps et atteindre des profils de qualité cibles. En règle générale, cette optimisation utilise des bioréacteurs à micro-échelle automatisés (15 ml) pour filtrer les conditions de processus multiples en parallèle. Les critères d'optimisation comprennent la performance culturelle et les attributs de qualité critiques (CQA) du produit d'anticorps monoclonal (mAb), ce qui peut avoir une incidence sur son efficacité et son innocuité. Les indicateurs de performance de la culture comprennent la croissance cellulaire et la consommation d'éléments nutritifs, tandis que les ACQ comprennent les profils de n-glycosylation et d'agrégation du mAb, les variantes de charge et le poids moléculaire. Ce protocole détaillé décrit comment purifier et analyser par la suite les échantillons de HCCF produits par un système automatisé de microbioréacteurs afin d'obtenir des mesures et des extrants de performance précieux. Tout d'abord, une protéine automatisée Une méthode de chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC) est utilisée pour purifier le mAb à partir d'échantillons de culture cellulaire récoltés. Une fois concentrés, les profils de glycane sont analysés par spectrométrie de masse à l'aide d'une plate-forme spécifique (voir le Tableau des Matériaux). Les poids moléculaires des anticorps et les profils d'agrégation sont déterminés à l'aide de la chromatographie d'exclusion de taille-diffusion de lumière à angle multiple (SEC-MALS), tandis que les variantes de charge sont analysées à l'aide de l'électrophorèse de zone capillaire de micropuce (mCZE). En plus des mesures de performance de la culture capturées au cours du processus de bioréacteur (c.-à-d. la viabilité de la culture, le nombre de cellules et les métabolites communs, y compris la glutamine, le glucose, le lactate et l'ammoniac), les médias usés sont analysés pour identifier les éléments nutritifs limitants à améliorer les stratégies d'alimentation et la conception globale des processus. Par conséquent, un protocole détaillé pour la quantification absolue des acides aminés par la spectrométrie de masse de chromatographie liquide (LC-MS) des médias dépensés est également décrit. Les méthodes utilisées dans ce protocole tirent parti des plates-formes à haut débit qui sont compatibles pour un grand nombre d'échantillons en petit volume.
Introduction
Les thérapies protéiques sont utilisées pour traiter une variété croissante deconditions médicales, y compris les complications de greffe de tissu, les désordres autoimmuns, et les cancers 1. Depuis 2004, la Food and Drug Administration (USFDA) des États-Unis a documenté une proportion croissante de demandes de permis biologiques (BLA) de toutes les approbations réglementées par le Center for Drug Evaluation and Research (CDER), les BLA représentant plus de 25 % des demandes de permis biologiques en 2014 et 20152.
Compte tenu de ce marché en expansion, les fabricants de produits biopharmaceutiques sont mis au défi de livrer rapidement plus de produits avec une qualité constante. Les efforts visant à accroître le rendement des produits se sont concentrés sur l'ingénierie cellulaire CHO et le criblage de la chaîne de production, bien que les améliorations les plus significatives soient dues aux progrès de l'optimisation des stratégies médias/alimentation et des contrôles environnementaux de la culture cellulaire1, 3 (en) , 4 ( en plus) , 5 pendant le processus de fabrication.
Puisque les mAbs sont produits dans un système biologique, il peut y avoir une variabilité inhérente des protéines. La composition des anticorps peut être modifiée après la traduction, comme la glycosylation ou affectée par la dégradation ou les réactions enzymatiques. Ces variations structurelles peuvent provoquer des réactions immunitaires dangereuses ou altérer la liaison des anticorps, ce qui peut à son tour réduire ou éliminer la fonction thérapeutique prévue5. Ainsi, les attributs de qualité critique (CQA) des anticorps monoclonaux - profil N-glycan, distribution de variantes de charge, et le pourcentage d'anticorps sous forme monomeric - sont régulièrement surveillés et contrôlés dans le cadre d'une approche Qualité par conception (QbD) pendant processus de fabrication1,6. Dans un environnement de production réglementé, les protéines thérapeutiques doivent répondre aux critères d'acceptation pour être autorisées comme un médicament commercial approuvé7. Les méthodes présentées ici feraient généralement partie du processus de caractérisation de la qualité d'un anticorps7,8, et tout scientifique protéique sera familier avec leur utilisation.
Dans les travaux antérieurs9, l'application et l'exploitation de microbioréacteurs pour le dépistage à haut débit des conditions de culture cellulaire dans le biotraitement en amont a été décrite. Le produit purifié obtenu à partir des différentes conditions des médias est soumis à l'analyse N-glycan en utilisant LC-MS. Les modèles de glycosylation des protéines thérapeutiques peuvent être détectés et caractérisés en utilisant les techniques LC-MS10,11, et le la présence de diverses espèces de glycanes a été liée à des paramètres de bioprocessus tels que la stratégie d'alimentation, le pH et la température12. L'effet des différentes conditions des médias sur la qualité du produit, indiqué par le pourcentage de l'IgG résultant sous forme monomeric, est également évalué avec Size Exclusion Chromatography- Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)13,14 , 15. Le profil de la variante de charge représente un certain nombre de modifications16 qui pourraient avoir un impact sur la fonction d'un produit. L'électrophorèse de zone microcapillaire (mCZE) est une technique qui offre un temps d'analyse considérablement plus rapide par rapport à la chromatographie traditionnelle d'échange de cation (CEX) et aux méthodes de mise au point isoélectrique capillaire (cIEF) utilisées pour l'analyse des variantes de charge17 ,18. Les médias de bioréacteurs dépensés ont été analysés pour suivre la consommation d'acides aminés pendant la production de protéines en ce qui concerne les changements dans les attributs d'identification de l'anticorps19,20,21,22 , 23.
L'analyse des protéines nous permet d'identifier les paramètres critiques des processus (CPP) en fonction des relations entre les entrées de processus et les changements dans les ACQ. Pendant le développement du bioprocessus, l'identification et la mesure des CpP démontrent fondamentalement le contrôle des processus et s'assurent que le produit n'a pas changé, ce qui est essentiel dans les environnements de fabrication hautement réglementés. Dans cet article, des techniques analytiques pour mesurer certaines des caractéristiques biochimiques de la protéine la plus pertinente pour les CQA de produit (profil de N-glycan, variantes de charge, et homogénéité de taille) sont présentées.
Protocol
1. Purification des anticorps
REMARQUE : Le tampon d'équilibre pour l'anticorps interne est de 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. Le tampon d'élution utilisé est 0,1 M d'acide acétique. Les tampons et la résine (protéine A) dépendent de l'anticorps spécifique purifié. Le volume de la colonne est équivalent à la hauteur du lit de la résine. La quantité de phase mobile utilisée est déterminée en termes de volume de colonne.
- Initialisation du système de purification
- Ouvrez le logiciel attaché au système de purification. À l'aide d'instructions manuelles, équilibrez la colonne avec le tampon d'équilibre à un débit de 2 ml/min pendant 40 min. Arrêtez la course manuelle après l'équilibre.
- Dans le collecteur de fractions, placez 15 ml de tubes coniques pour recueillir les anticorps purifiés et les tubes coniques de 50 ml pour recueillir le flux pendant le lavage à haute teneur en sel. Assurez-vous que le collecteur de fractions est réinitialisé à la position de départ en ouvrant et en fermant le collecteur de fractions avant le début de la course. Le collecteur de fractions est maintenu à 7 oC.
REMARQUE : Le collecteur de fractions peut être réinitialisé manuellement sous l'onglet Fraction Collector dans Paramètres,pour les tubes de 15 ml et 50 ml.
- Injection d'échantillon
REMARQUE : Le fluide de culture cellulaire récolté utilisé dans les procédures suivantes a été obtenu à partir de cellules d'ovaire de hamster chinois cultivées dans des micro-bioréacteurs automatisés9.- Ajouter le liquide de culture de cellules de récolte filtré de 0,22 m à une seringue vide de 12 ml dont l'extrémité de la buse est plafonnée.
- Tenir la seringue avec la buse vers le bas, insérer le piston de seringue jusqu'à ce qu'une petite partie du piston est po Pour vous assurer que le liquide ne fuit pas, tournez la seringue avec la buse vers le haut et retirez le bouchon.
- Toujours en tenant la seringue avec la buse vers le haut, poussez le cylindre pour dissiper tout air jusqu'à ce que le fluide de culture cellulaire est à la pointe de la buse. Insérez la buse de seringue dans le port d'injection manuelle sur le système de purification et tordez pour serrer.
- Poussez vers le bas sur le piston jusqu'à ce que tout l'échantillon soit injecté et soit visible dans la boucle d'échantillon de 10 ml de grand volume ci-jointe.
- Ouvrez le fichier de méthode enregistré. Enregistrez le fichier de résultat à l'emplacement requis et spécifiez le nom du fichier lorsqu'il est invité. Coup après que l'échantillon a été injecté dans la boucle d'échantillon de grand volume.
- Exécution de la méthode de purification
- Sélectionnez la méthode enregistrée et cliquez sur l'exécution lorsqu'il est invité par un logiciel d'instrument (étape 1.2.5).
REMARQUE : Le système est mis en place pour exécuter les étapes suivantes. L'utilisateur n'a pas besoin de faire quoi que ce soit pendant que l'instrument est en cours d'exécution. - Équilibrez la colonne avec trois volumes de colonne (CV) de tampon d'équilibre à un débit de 2 mL/min. Une fois que la colonne est liboudrée, le système, à l'aide de la boucle d'échantillon à grand volume, injectera l'échantillon sur la colonne à un débit de 1 ml/min.
- Une baisse du signal UV à 280 nm indique que l'échantillon est terminé de chargement. Laver la colonne avec un tampon d'équilibre à un débit de 2 ml/min jusqu'à ce que le signal UV tombe en dessous de 25 mAU.
- Utilisez quatre CV de 25 mM Tris avec 1 M NaCl au pH 7,5 pour effectuer un lavage secondaire à haute teneur en sel à un débit de 2 ml/min. Le collecteur de fractions du système recueillera toute protéine/ADN qui se détache de la colonne pendant le lavage au sel dans des tubes de 50 ml.
- Appliquer cinq CV de tampon d'élution à un débit de 1 mL/min pour élifier l'anticorps hors de la colonne. Recueillir l'éluate dans des tubes de 15 ml à base de signal UV; lorsque le signal UV 280 est supérieur à 35 mAU, la collecte commence; la collecte se termine lorsque le signal descend en dessous de 50 mAU; c'est ce qu'on appelle la coupe de pointe.
REMARQUE : La coupe de pointe assure la normalisation des profils d'élution et évite les résidus de pointe d'élution qui peuvent contenir des agrégats protéiques24. - Laver la colonne à l'aide de trois CV de tampon d'équilibre. La course se termine après l'étape de lavage.
- Après l'élution neutraliser immédiatement la protéine purifiée en utilisant 1 M Tris base à un pH de 5,5. Mesurer la concentration protéique à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis à microvolume à 280 nm et 260 nm et stocker à 4 oC.
- Concentrez l'anticorps purifié à l'aide d'unités centrifuges (étape 2). Soumettez ensuite l'anticorps purifié à l'analyse de glycane à l'aide de LC-MS et après l'agrégation, analysez le profil à l'aide de SEC-MALS (étapes 3 et 4).
REMARQUE : L'anticorps purifié ne doit pas être gelé sans autre échange de tampons, car de fréquents cycles de gel et de dégel peuvent causer l'agrégation et les précipitations.
- Sélectionnez la méthode enregistrée et cliquez sur l'exécution lorsqu'il est invité par un logiciel d'instrument (étape 1.2.5).
2. Concentration d'anticorps purifiés
REMARQUE : Le tampon Tris-acétate est neutralisé de 0,1 M d'acide acétique avec une base tris de 1 M à un pH de 5,5.
- Insérer des filtres 100 kDa dans des tubes de centrifugeuse.
- Laver les filtres avec 500 l'eau double distillée. Centrifugeuse pendant 10 min à 14 000 x g à température ambiante (RT). Répétez cette étape deux fois. Jeter le filtrate.
- Transférer les filtres rincés dans des tubes de centrifugeuse frais et ajouter 500 ll d'échantillon à chaque filtre. Centrifugeuse pendant 10 min à 14 000 x g.
- Inverser le filtre dans un tube de spin frais. Centrifugeuse pendant 2 min à 1 000 x g pour recueillir l'échantillon concentré.
- Déterminer les concentrations d'échantillons à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis. Videz le spectrophotomètre à l'aide d'une solution de tampon Tris-acétate. Utilisez un coefficient d'extinction des protéines de 1,37 mL(mg-cm)-1 à 280 nm pour une solution IgG de 1 % (% m/v).
- Utilisez l'échantillon concentré pour préparer une solution de travail de 2 mg/mL de 2 mg/mL pour l'analyse du glycane et de 30 oL de solution de travail de 3,5 mg/mL pour SEC-MALS.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les échantillons doivent être réfrigérés à 4 oC. À une concentration de 2 mg/mL, ces échantillons devraient être stables pendant au moins trois mois à 4 oC, tandis que des concentrations plus élevées pourraient se précipiter.
3. Analyse des N-glycans à l'aide de la spectroscopie de masse
- Étiquetage n-glycan et isolement
- Commencez par des concentrations d'anticorps de 2 mg/mL dans un tampon approprié comme le phosphate de sodium neutre, le citrate ou le tampon HEPES. Préparer une norme de mAb intacte (comme le nIST mAb) à 2 mg/mL pour traiter à côté des échantillons expérimentaux pour servir de contrôle positif.
REMARQUE : Les anticorps doivent être dans un tampon final ne contenant aucun SDS et moins de 0,1 mM de nucléophiles (tels que Tris, TNT, glycine ou histidine). Les SDD dans le tampon de l'échantillon doivent être supprimés. Si les nucléophiles sont dans le tampon, diluez-les vers le bas ou effectuez un échange de mémoire tampon puisqu'ils interfèrent avec le kit. Le protocole général est fourni avec le kit de glycan. - Diluer 7,5 l des anticorps avec 15,3 l d'eau de qualité LC-MS dans des tubes de 1 ml fournis avec le kit, puis dénaturer à l'aide de 6 l de 5 % de solution d'un surfactant enzymatique et mS à 90 oC pendant 3 min.
- Refroidir les échantillons pendant 3 min à température ambiante (RT). Ensuite, ajouter 1,2 l de PNGase F et incuber pendant 5 min à 50 oC.
- Après avoir refroidi 3 min à RT, étiquetez les N-glycans clivés en ajoutant 12 l de réactif de marquage fluorescent dissous dans le diméthylformamide anhyus (DMF) et attendez 5 min. Diluer le mélange étiqueté N-glycan avec 358 l d'acétonitrile (ACN).
- Placez une plaque de chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) dans un vide multiple avec des cales et un plateau de déchets. Utilisez une pipette multicanal pour un grand nombre d'échantillons.
- Conditionner les puits avec 200 l d'eau, où le vide est ajusté de sorte que le liquide prendra 15-30 s pour passer à travers la résine HILIC. Équilibrez-le avec 200 L de 85 % D'ACN avant de charger le mélange de glycane étiqueté acn dilué (400 l), en appliquant le vide après l'ajout de chaque nouveau liquide aux puits. Laver la résine avec 600 l de 1% d'acide formique (FA)/90% ACN deux fois.
- Remplacer le bac à déchets par des tubes de collecte de 600 l. Éluter les N-glycans étiquetés avec tampon d'élution SPE (3 élutions de 30 l chacun) dans les tubes de collecte. Diluer les élutions mises en commun avec 310 l de diluant d'échantillon DMF/ACN. Pipette les échantillons dans des flacons d'échantillonneur automatique pour être prêt pour l'analyse de fluorescence (FLR)-MS.
REMARQUE : Ces échantillons sont stables lorsqu'ils sont entreposés à -80 oC pendant au moins 1 mois. Conservez la plaque HILIC dans son emballage d'origine, scotché fermé et à l'intérieur d'un dessiccateur pour une utilisation future.
- Commencez par des concentrations d'anticorps de 2 mg/mL dans un tampon approprié comme le phosphate de sodium neutre, le citrate ou le tampon HEPES. Préparer une norme de mAb intacte (comme le nIST mAb) à 2 mg/mL pour traiter à côté des échantillons expérimentaux pour servir de contrôle positif.
- Analyse LC-MS des N-glycans étiquetés
- Analyser les échantillons d'élution N-glycan étiquetés sur un système de chromatographie liquide ultra-performance (UPLC) couplé à un détecteur de fluorescence et un spectromètre de masse quadrupole (Q-ToF). Utilisez une colonne approuvée pour la séparation chromatographique des glycanes étiquetés et de la chaleur à 60 oC pendant les séparations.
REMARQUE : La colonne doit être rincée avec 60 % d'acétonitrile et 40 % de H2O avant utilisation : 50 CV avant la première utilisation ou 20 CV si la colonne a déjà été utilisée.- Utilisez 50 mM d'ammonium formate (AmF) (fabriqué avec du concentré de phase mobile) et 100% ACN de qualité LC-MS pour les phases mobiles. L'AmF est sensible aux changements de pH et est utilisable pendant 1 mois après le mélange. Définir le débit initial à 0,4 mL/min, le gradient LC fournissant une AmF croissante pendant la phase d'élution.
- Définir le détecteur FLR pour mesurer à EX 265/EM 425 nm avec un taux d'échantillonnage de 2 Hz. Définir le mode de sensibilité à l'ion positif Q-ToF à MS1, avec une plage de masse de 100-2 000 daltons (Da), un temps de balayage de 0,25 secondes et l'acquisition de données continuum. Utilisez la leucine enkephalin (2 ng/L dans 50% ACN/0.1% FA) pour la référence de masse interne, dans le mode "Ne PAS appliquer la correction".
REMARQUE : La correction interne de référence de masse sera appliquée plus tard pendant le traitement des données. - Resuspendre l'échelle dextran séquentiellement en 22,5 l de H2O, 25 'L de DMF et 52,5 'L d'ACN. Préparer 10 aliquots ll pour le stockage à -80 oC, car l'échelle n'est pas stable pendant plus de 24 h à des températures plus élevées (température ambiante, 4 oC). L'échelle dextran se dégrade après plus d'un cycle de gel-dégel.
- Placer les échantillons dans l'échantillonneur automatique réglé à 10 oC. Chargez une fiole d'échelle dextran avec des échantillons, car les informations sur le temps de rétention de l'échelle seront utilisées pour les affectations tandis que les informations de masse utilisées pour valider les identifications. Utilisez 10 injections de L pour les échantillons et 7,5 injections de L pour l'échelle. Injecter des échantillons dans triplicate. Exécutez la méthode chargée.
- Analyser les échantillons d'élution N-glycan étiquetés sur un système de chromatographie liquide ultra-performance (UPLC) couplé à un détecteur de fluorescence et un spectromètre de masse quadrupole (Q-ToF). Utilisez une colonne approuvée pour la séparation chromatographique des glycanes étiquetés et de la chaleur à 60 oC pendant les séparations.
- Identification N-Glycan pour les données LC-MS
- Effectuer le traitement des données avec un programme optimisé pour les données de spectrométrie de masse de fluorescence de la fluotométrie de la fluotométrie par interaction hydrophile (HILIC-FLR-MS).
- Appliquer des corrections de référence de masse internes dans le programme. Désigner les injections échelle dextran comme «standard» dans l'information de l'échantillon . Dans la méthode d'analyse, définir les temps de rétention des composés de séparation à ceux des composés de l'échelle qui ont été détectés au cours de la course.
- Pour vous assurer que le % de zone sera retourné pour les glycanes identifiés, modifiez la méthode d'analyse : Sous l'onglet Traitement, cliquez sur Paramètres de quantitation - Calibrer et définir le type « Courbe de calibration » pour « Réponse relative (%) ».
4. Analyse de l'agrégation d'anticorps à l'aide de SEC-MALS
- Préparation de l'échantillon
- Transférer la protéine diluée de 3,5 mg/mL (étape 2) dans un flacon avec un insert en verre de 150 l. Utilisez une pointe de chargement de gel à pipet dans la cloche inférieure de l'insert pour éviter l'introduction de bulles.
- Capuchon de la fiole avec un chapeau septa et d'analyser immédiatement. Conserver à 4 oC si vous analysez plus tard.
- Configuration et équilibre SEC-MALS
REMARQUE : Analyser l'agrégation sur SEC-MALS configurée avec une chromatographie liquide ultra haute pression (UHPLC) avec un détecteur MALS et un détecteur d'indice réfractif contrôlé par le logiciel MALS.- Configurer un fichier de méthode dans le logiciel UHPLC pour le contrôle du système UHPLC, en fixant le débit à 0,4 ml/min avec une phase mobile de 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) (dilué à partir de 10x), le volume d'injection à 5 oL, la température de la colonne à 25 oC , et le détecteur de diode Array (DAD) pour surveiller 280 nm. Définir la durée de l'exécution à 20 min. Équilibrez le système pendant au moins 4 h avant toute analyse d'échantillon.
- L'interface entre les détecteurs UHPLC et Multi Angle Light Scattering - Refractive Index (MALS-RI) nécessite l'utilisation de la sortie analogique sur le DAD. Régler l'atténuation DAD à 1.000 mAU dans le fichier de méthode DAD et au/UV réglage à 1 (instrument UV -gt;Channels 'gt;Channel 1).
- Allumez la lampe DAD 30 min avant de commencer l'analyse et fixez la longueur d'onde à 280 nm. Dans le même temps, purger la cellule de référence de l'indice réfractif (IR) pendant 15 min ou jusqu'à ce que la ligne de base soit stable, puis fermer la cellule de référence.
- Configurer la séquence logicielle SEC-MALS, en réglant le temps de collecte à 12 min, le volume d'injection à 5 ll, le dn/dc à 0,185 mL/g, le coefficient d'extinction A280 s'il est précédemment déterminé expérimentalement ou à 1,37 mL (mg-cm)-1, et la concentration de la échantillon. Cliquez sur Exécuter et attendre que le dialogue « en attente d'injection » apparaisse à l'écran.
REMARQUE : Le coefficient d'extinction de l'A280 est spécifique à la protéine d'intérêt et doit être déterminé expérimentalement. - Configurer une liste d'échantillons dans le logiciel UHPLC dans le même ordre que dans le logiciel MALS-RI et soumettre.
REMARQUE : Il est important d'exécuter un contrôle d'aptitude au système avant et après une course. L'albumine de sérum bovin est typiquement employée pour vérifier l'élargissement de pointe, un signe que la colonne de SEC peut avoir besoin de nettoyage ou de remplacement. La même injection standard BSA peut être utilisée pour spécifier l'alignement du signal, l'élargissement des pics et la normalisation des détecteurs.
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Analyse globale avec le logiciel MALS
- Cliquez sur l'onglet marqué Procédures. Spécifier le niveau minimum de despiking requis; aucun n'est généralement suffisant.
- Vérifier que les lignes de base ont été tracées correctement et ajuster si nécessaire, pour les canaux LS1, LS2, LS3, RI et UV. Définir la zone de pointe d'intérêt.
- Examinez la distribution de masse moléculaire pour confirmer que les pics appelés contiennent des particules de taille similaire.
5. Analyse de variante de charge
- Préparation et étiquetage de l'échantillon
- Commencez par 80 l d'une solution d'anticorps de 3,5 mg/mL. Desaler l'échantillon à l'aide d'une colonne de desalting de 0,5 ml (7 k MWCO). Préparer la colonne en claquant d'abord le bouchon inférieur, puis en desserrant le bouchon supérieur, et en la plaçant dans un tube micro centrifugeur de 1,7 mL. Centrifuger la colonne de dessalement pendant 1 min à 1 500 x g.
REMARQUE : Marquez l'extérieur de la colonne avec un point afin qu'il puisse être placé dans l'orientation d'origine pour les prochaines étapes. - Transférer la colonne dans un nouveau tube de microcentrifuge. Ajouter les 80 l de protéines diluées en haut de la colonne. Alignez la colonne à l'orientation d'origine. Centrifugeuse pendant 2 min à 1 500 x g. Retirer l'échantillon de la centrifugeuse, jeter la colonne de dessalement et bien mélanger l'échantillon.
REMARQUE : Le dessalement n'est nécessaire que si la matrice de l'échantillon contient des amines primaires, des excipients qui perturberont l'électrophoresis de l'échantillon ou d'autres substances incompatibles. - Diluer l'échantillon à une concentration finale de 2 mg/mL dans un volume de 25 l et ajouter 5 l de la mémoire tampon d'étiquetage (voir Tableau des matériaux : Kitde réactif variable de charge ) dans la plaque de 96 puits. Préparer le réactif d'étiquetage en diluant la quantité nécessaire de réactif d'étiquetage (voir Tableau des matériaux : Kitde réactif variable de charge ) 1:30 en diméthylformamide. Incuber l'échantillon pendant 10 minutes à température ambiante loin de la lumière.
REMARQUE : Il est important de décongeler, puis d'utiliser immédiatement ce réactif et de l'utiliser dans les 10 minutes suivant le mélange avec dMF. - Après l'incubation, ajouter 60 l d'eau de qualité réagent et bien mélanger par tuyauterie. Couvrir la plaque d'un joint de plaque et centrifuer la plaque à 1 000 x g pendant 1 min.
- Commencez par 80 l d'une solution d'anticorps de 3,5 mg/mL. Desaler l'échantillon à l'aide d'une colonne de desalting de 0,5 ml (7 k MWCO). Préparer la colonne en claquant d'abord le bouchon inférieur, puis en desserrant le bouchon supérieur, et en la plaçant dans un tube micro centrifugeur de 1,7 mL. Centrifuger la colonne de dessalement pendant 1 min à 1 500 x g.
- Préparation de la puce variante de charge
- Préparer la puce Charge Variant en enlevant la solution de stockage et en lavant les puits 1, 3, 4, 7, 8 et 10 avec de l'eau. Remplacez ensuite l'eau par un tampon de fonctionnement pH 7.2 (voir Tableau des matériaux : Charger le kit de réactifvariable).
- Ajouter 750 'L de pH 7.2 tampon courant au tube tampon et placer le tube tampon à l'endroit indiqué sur le coin supérieur gauche du plateau de l'échantillon. Maintenant, retirez le joint de plaque de la plaque de 96 puits, appuyez sur Décharger la plaque sur l'interface utilisateur de l'instrument, et insérez la plaque dans le plateau d'échantillon GXII.
REMARQUE : Des tampons pH 7.2 ont été utilisés pour cette analyse. pH 5.6-7.2 tampons peuvent être utilisés en fonction de la protéine pI. Lors de l'utilisation de tampons de pH plus bas, des temps d'exécution d'échantillons plus longs peuvent être nécessaires. - Appuyez sur le bouton Décharger la puce sur l'interface utilisateur. Assurez-vous que les électrodes sont exemptes de toutes les particules, et si ce n'est pas, nettoyer avec un écouvillon sans pouf. Lors de l'insertion de la puce assurez-vous que la fenêtre au centre de la puce est exempte de particules ou de taches. Si nécessaire, nettoyer avec un chiffon souple sans peluches.
REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des puces d'électrophoresis capillaires, retirez le tampon par aspiration sous vide, suivi de l'ajout immédiat de la solution suivante pour empêcher les puits de se dessécher. Pour minimiser l'introduction de bulles, pratiquez la technique de pipetage inversé. Lors de la manipulation de la puce, être conscient de la fragile capillaire s'étendant à partir du fond de la puce, en veillant à ce qu'il ne se dessèche pas et ne pas briser la manipulation rugueuse. - Fermez le couvercle à la chambre à puce et sélectionnez l'assay HT Protein Charge Variant. Cliquez sur le bouton Exécuter. Suivez les invites pour sélectionner les puits de l'échantillon, le type de plaque, le temps d'assougat (68, 90 ou 100 s) et le nom du fichier. Cliquez sur Démarrer à la fin des invites.
- Le nettoyage des copeaux nécessite le lavage de chaque puits 2x avec de l'eau, suivie de l'ajout de tampon de stockage (voir Tableau des matériaux: Charger Variant Reagent Kit). Une fois dans le tampon de stockage, remplacez la puce dans l'instrument et, lorsqu'elle est invitée, sélectionnez l'assay HT Protein Charge. Sur l'écran principal, sélectionnez Wash sur l'interface utilisateur. Une fois terminée, retirer la puce, essuyer les électrodes avec de l'eau et un écouvillon sans conserve, et entreposer la puce à 4 oC.
- Analyse des variantes de charge
- Ouvrez le logiciel d'analyse des instruments. Importer la course en allant à File .'m.'import Data File... et en cliquant sur le fichier souhaité. Seul le nom sera reporté sur le logiciel, afin de renommer les puits est avantageux (Outils 'gt; Sample Name Editor). Sélectionnez les fichiers à exporter en maintenant le décalage pendant la sélection des fichiers. Cliquer sur File -gt;Export... et sélectionnez la boîte Raw Data, puis la boîte format AIA.
- Ouvrez l'onglet Projets de navigation dans le logiciel d'analyse. Cliquez sur Database 'gt;Import Data... et sélectionnez l'exporté. Fichiers CDF.
- Une fois importé, naviguez vers l'onglet Injections, sélectionnez les fichiers à analyser, cliquez à droite et accédez au processus... Dans la fenêtre qui apparaît, sélectionnez la case à cocher à côté du processus et sélectionnez la case radio « Utiliser la méthode de traitement spécifiée » et la méthode de traitement souhaitée à partir de la case déroulante. Dans la boîte déroulante immédiatement ci-dessous étiquetée "Comment:" sélectionnez Calibrate et Quantitate. Une fois traités, naviguez vers l'onglet Résultats et vérifiez l'intégration des chromatogrammes.
REMARQUE : La méthode de traitement doit être vérifiée pour chaque méthode. Comme point de départ, les paramètres utilisés pour la méthode de traitement actuelle sont inclus dans le fichier supplémentaire.
REMARQUE : L'exportation des données peut se faire sous la forme d'un rapport ou seule la quantification maximale peut être exportée. Ceux-ci peuvent être faits en même temps que le traitement ou à partir de la fenêtre de résultats.
6. Analyse des acides aminés
- Mise en place de la courbe standard pour la quantification absolue des acides aminés par LC-MS
- Préparer le mélange d'acide aminé étendu (EAA) en dissolvant 59,45 mg d'Asn, 59,00 mg d'Hyp, 65,77 mg de Gln, et 91,95 mg de Trp dans 25 ml de 0,1 N HCl. La concentration finale de chaque acide aminé dans le mélange EAA est de 18 nmol/L.
- Préparer la solution de stock standard interne (ISTD) en dissolvant 58,58 mg de Nva et 44,54 mg de Sar dans 50 ml de HCl.
- Préparer les normes complètes d'acides aminés en combinant la solution de stock d'acides aminés contenant Ala, Asp, Arg, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val à 1 nmol/ L chacun avec le mélange EAA pour les concentrations finales d'acides aminés de 900 , 225, 90, 22,5 et 9 pmol/L. Ajouter le stock ISTD préparé aux normes d'acide aminé pour une concentration finale de 90 pmol/L ou 900 pmol/L pour créer des normes internes « faibles » et « élevées » à utiliser comme contrôles positifs pour la méthode.
- Placez les concentrations d'acides aminés dans des flacons d'échantillons dans l'autosampler de l'UPLC. Générer une courbe d'étalonnage (9 à 900 pmol/L) dans le logiciel d'instrument basé sur les concentrations standard d'acides aminés en utilisant les instructions suivantes.
- Utilisez le Q-ToF dans le mode de sensibilité positive à l'ionisation électrospray (ESI) couplé à un UPLC pour l'analyse intacte des acides aminés. Pour la séparation chromatographique, utilisez une colonne de phase normale faite pour les séparations d'acides aminés. Préparer les tampons suivants avec des réactifs de niveau de spectrométrie de masse : A -acétonitrile - 0,1 % d'acide formique et B à 100 mM de formatamium. Définir le débit de LC à 0,6 ml/min et la température de la colonne à 40 oC.
- Utilisez les conditions de gradient suivantes de 15 minutes pour les séparations d'acides aminés : 14 % B (0-3 min), 14-100 % B (3-10 min), 100 % B (10-13 min), 100-8 % B (13-14 min), 8 % B (14-15 min).
- Utilisez les listes de colonnes « Type d'échantillon » et « Conc A » dans le programme d'acquisition de SP afin de créer une courbe d'étalonnage pour l'analyse future des supports de bioréacteurs bruts dans le programme de quantitation. Pour que ces colonnes apparaissent dans le programme d'acquisition, utilisez l'affichage personnalisé... commandez lorsque vous cliquez à droite sur la barre de menu supérieure.
- Le type d'échantillon pour les normes d'acide aminé sera "Standard" tandis que les échantillons de médias seront "Analyte". Remplissez la colonne « Conc A » avec les concentrations numériques des normes dans les unités requises (pmol/L).
- Exécuter les concentrations standard d'acides aminés préparés au moins deux fois. Validez que l'instrument UPLC et le spectromètre de masse fonctionnent correctement en vérifiant les pics ISTD.
- Utilisez l'option « Méthode d'édition » dans l'application de quantitation pour créer la méthode de quantitation (fichier .mdb). Définissez tous les acides aminés d'intérêt dans l'application de quantitation, tels que le nom composé, la valeur m/z et le temps de rétention prévu. Modifier les paramètres d'intégration de la méthode ici.
- Utilisez la méthode d'acide aminé créé sur les échantillons standard pour créer la courbe d'étalonnage. Cette courbe peut être exportée vers un fichier '.cdb' pour une utilisation avec les échantillons de médias à l'aide de la commande Export.gt;Calibration...
- Dans l'application de quantitation, enregistrez la mise en page souhaitée dans un fichier 'qlt' à appliquer aux futurs jeux de données à l'aide de "Save Layout As...". Nom (nom d'injection), Zone et Conc sont les colonnes de sortie les plus importantes.
- Analyse des acides aminés des médias de bioréacteurs bruts par LC-MS
- Le bioréacteur brut Centrifuge est de 1 962 x g pendant 5 minutes et passe à travers un filtre de 0,22 m.
- Suivi d'un nettoyage à l'acide perchlorique pour éliminer les protéines et les particules : mélangez le support bioréacteur filtré avec 0,4 N HClO4 à un ratio de 1:1 et centrifugeuse à 14 700 x g pendant 5 min à RT. Recueillir les médias clarifiés dans les flacons d'autosampler.
REMARQUE : Ajuster le volume d'injection au besoin pour que les concentrations d'acides aminés se situent dans la plage d'étalonnage. Selon l'instrument, le volume d'injection peut être ajusté entre 0,1 et 10 L. - Exécuter des échantillons multimédias en triplelicate par LC-MS. Utilisez des « échantillons de processus » dans le cadre du programme de quantitation ainsi que la méthode (.mdb) et le fichier d'étalonnage (.cdb). La méthode et la courbe d'étalonnage seront automatiquement appliquées aux échantillons de supports bruts par l'application de quantitation une fois toutes les injections terminées.
- Pour exporter des données pour analyse dans un autre programme (comme une feuille de calcul), utilisez la commande «Imprimer» et créer un fichier '.xps ou '.pdf'.
Representative Results
Le liquide de culture cellulaire récolté du bioréacteur à microéchelle automatisé est purifié à l'aide d'une chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC), comme on le voit à la figure 1 et les attributs de qualité critique des protéines purifiées (ACQ) ont été caractérisés par divers méthodes analytiques en aval. Il s'agit d'un avantage clé du système automatisé de microbioréacteurs; les différences dans les ACQ peuvent être évaluées rapidement dans un large éventail de conditions. Les données N-glycan des mAbs produites par CHO qui sont traitées par spectrométrie de masse devraient apparaître comme les chromatogrammes indiqués dans la figure 2. La figure représente une comparaison entre deux chromatogrammes montrant que le pic mannose 5 (M5) d'un échantillon est considérablement plus faible. Si seulement une ligne de base bruyante est observée au lieu de pics, cela peut signifier que la configuration de la chromatographie est défectueuse ou que la procédure n'est pas réussie. En utilisant des contrôles, le dépannage peut être simplifié. Tout d'abord, évaluer les pics FLR à partir de l'échelle dextran; ces pics indiquent que le système chromatographique fonctionne correctement. Ensuite, comparez les pics obtenus expérimentalement avec ceux obtenus à partir d'une norme mAb intacte traitée. Si les pics de la norme sont visibles, mais qu'aucun pic d'échantillon n'est identifié, les échantillons de mAb n'ont pas été traités correctement. Cela peut être dû à la présence de SDS ou de nucléophiles dans le tampon interférant avec l'étiquetage et la purification n.glycane.
SEC-MALS peut être utilisé pour évaluer deux autres CQA : le profil d'agrégation et le poids moléculaire de l'anticorps. Un chromatogramme SEC-MALS représentatif est comparable à celui de la figure 3. La distribution de masse moléculaire et le poids moléculaire absolu ont été déterminés à l'aide du logiciel requis avec un coefficient d'extinction de 1,37 mL (mg-cm)-1 et un dn/dc de 0,185 mL/g. Comme l'appel de pointe et la définition de la ligne de base dans le logiciel est effectuée manuellement, les résultats peuvent varier légèrement d'un utilisateur à l'autre. Le poids moléculaire absolu de l'igG1 monomérique de la figure 3 est de 1,504 x 105 Da - 0,38% (bleu) et le complexe d'ordre supérieur est de 7,799 x 105 Da - 3,0% (rouge). La polydisperosité des agrégats est beaucoup plus grande que celle du monomère, comme l'indique la répartition de masse molaire rouge du pic 1 (figure 3). La petite quantité d'échantillons et l'importance de l'agrégation en tant que CQA font de cette technique un outil d'analyse complémentaire très précieux au système automatisé de microbioréacteurs.
Le résultat de mCZE est un électrophérogramme, comme dans la figure 4, qui montre le profil de la variante de charge pour un anticorps monoclonal. Le profil est une signature unique pour la protéine à l'étude et est très sensible au pH de fonctionnement. Un pic de colorant libre à gauche du profil de la variante de charge est également visible. Lors de l'établissement d'un pH opérationnel, l'opérateur a le pouvoir discrétionnaire d'équilibrer la résolution et le signal; en outre, l'opérateur doit s'assurer d'une bonne séparation par rapport au pic de teinture libre qui migre à 30 s. L'échantillon peut être dessalé après l'étiquetage pour enlever ce pic, bien que cela entraîne une perte significative de signal. Une fois qu'un pH opérationnel est établi, les profils d'échantillon peuvent être comparés. Bien que généralement cohérents, les changements dans l'efficacité de l'étiquetage ou les différences dans les excipients peuvent conduire à des différences mineures dans la migration d'un échantillon et le profil de la variante de charge rendant les électrophétographies difficiles à comparer directement. Au lieu de cela, la méthode de comparaison est généralement basée sur les pourcentages d'espèces de base, principales et acides. Dans ce cas, des différences relatives aussi faibles que 1-2% peuvent être identifiées à l'aide de mCZE.
La consommation d'acides aminés peut être surveillée pour déterminer si l'épuisement entraîne des changements dans les ACQ. Les réinspirations de chromatogrammes du spectromètre de masse peuvent être utilisées pour évaluer la création réussie d'une courbe d'étalonnage pour la quantification absolue des acides aminés dans les échantillons de médias de bioréacteurs bruts. La figure 5 représente deux chromatogrammes d'ion totaux (TIC) et un chromatogramme d'ion extrait (XIC) comme résultats représentatifs au cours de ce processus. Dans la figure 5A, le TIC indiqué représente le signal d'arrière-plan du système tampon comme seul un blanc d'eau a été injecté. Figure 5 B représente un TIC représentatif de la norme sur les acides aminés où, par rapport au blanc d'eau, on peut observer de petits pics qui correspondent aux espèces d'acides aminés (comme la lysine à 7,96 minutes). Pour intégrer le pic et faciliter la quantification de la zone de pointe (et donc de la concentration), le XIC est utilisé là où seul le signal d'une « fenêtre de masse de chromatogramme » définie est affiché. Selon la sensibilité de l'instrument et la qualité de la séparation chromatographique, la fenêtre de masse optimale devra être déterminée par l'utilisateur. Dans cet exemple (Figure 5C), le XIC de lysine (m/z 147.1144) avec une fenêtre de masse de 10 ppm est montré où la lysine dans la norme d'acide aminé élit la colonne à 8,03 minutes.
Figure 1 . Chromatogramme représentatif du régime de purification utilisant la technique de chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC). Les phases de la méthode de purification correspondant au volume (mL) sont étiquetées le long de l'axe X. L'absorption UV à 280 nm (axe mAU y, ligne solide) est surveillée tout au long du cycle de purification. Les impuretés non spécifiquement liées sont déplacées par l'augmentation de la conductivité (axe mS/cm y, ligne pointillée) pendant le lavage à haute teneur en sel. L'anticorps est évacué de la colonne Protéine A avec l'introduction d'un tampon d'élution (Conc B, ligne pointillée) lorsque le pH diminue à 4 (non montré). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Un chromatogramme représentatif de fluorescence obtenu à partir de glycanes marqués qui sont vérifiés de masse. L'axe X est le temps de rétention (minutes) tandis que l'axe y est l'intensité du signal. Le pic à 14,94 min représente le glycane Mannose 5 (M5), où une grande différence entre la force du signal M5 peut être observée entre les deux échantillons qui sont superposés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Répartition moléculaire du poids de l'anticorps monoclonal IgG1. Chromatogram d'un anticorps monoclonal intact d'IgG1 séparé par chromatographie d'exclusion de taille dans 1x PBS (pH7.4). L'absorption est surveillée à 280 nm (noir; axe gauche) et des détecteurs d'index de diffusion de lumière et de réfraction ont été utilisés pour calculer le poids moléculaire absolu de chaque pic (rouge et bleu; axe droit). Les espèces de poids moléculaire élevé sont indiquées avec le pic étiqueté « HMW ». Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 . Profil de variante de charge d'un anticorps monoclonal IgG1. Cet électrophétographie est généré sur une plate-forme mCZE. Un pic de teinture libre migre à 30 s et est bien séparé de l'IgG1. Pour la quantification, les pics ont été divisés en espèces de base, principales et acides à l'aide d'un logiciel d'analyse des données aux instruments. La ligne rouge décrit les zones de pointe intégrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. Résultats représentatifs des chromatogrammes d'ion pour l'analyse d'acide aminé basée sur la spectrométrie de masse des médias bruts de bioréacteur. L'axe x est le temps (minutes) tandis que l'axe y est l'intensité du signal (A) Un blanc d'eau sert de contrôle négatif et révèle le signal de fond observé au cours du gradient de chromatographie liquide (B) L'acide aminé de 225 pmol/L standard est utilisé ici comme un contrôle positif, comme les pics individuels observés dans ce chromatogramme ion total représentent les différents acides aminés du mélange standard étant résolu chromatographiquement (C) Un représentant extrait chromatogramme d'ions pour m /z 147.1144, qui est lysine. Le pic de 7,96 min en B correspond au pic de 8,03 en C de lysine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
HCCF contient des débris et de grandes particules qui peuvent obstruer et détruire l'instrumentation coûteuse, de ce fait, la clarification de la culture est nécessaire avant le traitement en aval. La centrifugation est généralement la première approche pour séparer les cellules et autres particules insolubles des protéines suivies de filtration. Ce HCCF filtré est alors soumis à la chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC) pour la purification. La purification du HCCF à partir de microbioréacteurs automatisés pour obtenir le produit est une étape importante dans le traitement en aval. Ici, un système FPLC de banc avec une colonne de protéine A est employé pour obtenir des anticorps monoclonaux du HCCF. L'analyse des processus en amont peut fournir un aperçu utile du comportement cellulaire et guider la conception des bioprocessus, aidant à obtenir un produit de qualité cohérent et fiable. L'analyse nous permet également de lier les attributs de qualité critique (CQA) aux processus en amont et en aval. Présentés ici sont quatre essais qui sont couramment utilisés dans la caractérisation des anticorps monoclonaux. Ces techniques sont robustes, fiables et facilement déployables pour l'analyse des procédés et des produits à partir d'une variété de sources en amont qui ne sont que partiellement purifiées et peuvent encore contenir des niveaux résiduels d'ADN et de HCP.
Lors du nettoyage d'échantillons pour l'analyse, un équilibre important doit être trouvé entre la création d'un échantillon suffisamment propre pour l'analyse tout en préservant la variabilité présente dans le bioréacteur. Les deux contaminants les plus courants qui ont un impact sur le produit sont l'ADN et le HCP, qui peuvent être vérifiés en mesurant l'absorption du ratio à 260/280 nm et par l'intermédiaire de SDS-PAGE ou de CE-SDS. Les essais présentés ici ne sont pas sensibles aux faibles niveaux de contenu en ADN. La pureté du produit est pure, comme le détermine le CE-SDS.
L'analyse des variantes de charge avec un système d'électrophorèse microcapillary fournit une méthode à haut débit pour identifier les variantes de charge, avec des puces et des réactifs qui sont relativement faciles à mettre en œuvre. La nature de la technique et la chimie du réactif d'étiquetage sont à la fois sensibles aux excipients et à d'autres amines primaires, ce qui nécessite une étape de dessalement pour la plupart des matrices d'échantillons. D'après l'expérience, de faibles niveaux d'ADN comigrent avec le colorant libre de la réaction d'étiquetage et n'ont pas d'impact sur la qualité des résultats. Bien que la variabilité de la quantification de pointe de base, principale et acide soit généralement de 1 %, des niveaux plus élevés d'ADN et d'autres contaminants peuvent augmenter la variabilité de l'analyse. Il est extrêmement important d'être compatible avec l'étiquetage des protéines et d'assurer l'utilisation rapide de DMF après l'enlèvement de la bouteille et d'être mélangé avec le colorant. Les normes de lysine et/ou d'histidine sont recommandées comme contrôles d'étiquetage. Au fil du temps et selon la qualité de l'échantillon, les puces peuvent encrasser ou perdre le revêtement sur les canaux microfluidiques, ce qui entraîne un plus grand bruit, la présence de pics fantômes et une plus grande variation d'échantillon en échantillon. Pour identifier cet événement, des blancs et une norme d'adéquation du système (c.-à-d. NISTmAb) ont été analysés simultanément avec les échantillons à intervalles réguliers. Lorsque des problèmes de puce surviennent, les puces peuvent être lavées avec la solution de stockage ou remplacées.
Les méthodes utilisées pour l'analyse glycane des glycoprotéines thérapeutiques impliquent principalement la chromatographie liquide (LC) et/ou la spectrométrie de masse (MS), avec l'analyse de microarray de lectine gagnant en popularité comme troisième option25. La méthode décrite dans le présent document utilise à la fois LC et MS, qui a des avantages et des inconvénients. Les méthodes spectrométriques de masse ont l'avantage de la vérification de masse des glycanes analysés, ce qui n'est pas possible avec les méthodes à base de LC en utilisant une sortie de détection fluorescente ou des microréseaux de lectine. Cette méthode utilise la détection de LC et de fluorescence pour attribuer des identités glycanes en utilisant la comparaison de temps de rétention à une norme d'échelle dextran. La surveillance de la fluorescence permet une sensibilité et une quantification accrues en raison de la facilité de sa détection, où la SP seule pourrait ne pas être en mesure de quantifier les espèces à faible abondance en raison de la faible efficacité d'ionisation des oligosaccharides. Les informations de masse de la SP sont utilisées pour confirmer les identités glycanes, mais le logiciel de traitement n'utilise pas l'information de masse comme critères d'affectation primaires. Par conséquent, sans chromatographie reproductible et des pics facilement résolvables, cette méthode peut souffrir en ce qui concerne les affectations de glycane. Heureusement, l'information de masse peut aider avec des affectations de glycan même dans les situations où la chromatographie est inférieure, telle que des décalages dans le temps de rétention qui entravent les affectations de glycane reproductible. Si cette méthode est utilisée sans SP, la chromatographie doit être au plus haut niveau puisque l'information de masse ne peut pas être utilisée pour corriger la dérive du temps de résidence.
La méthode d'analyse des acides aminés décrite ici utilise LC-MS pour la quantitation rapide des acides aminés sous-évalués dans les médias de culture cellulaire brut. D'autres méthodes d'analyse des acides aminés nécessitent des agents de dérivatisation des acides aminés pour permettre la détection des UV26. La méthode LC-MS offre d'importants avantages par rapport à la méthode LC-UV : elle permet l'identification basée à la fois sur le temps de rétention et la masse ionique par opposition à la méthode LC-UV, qui est limitée par un manque de caractérisation de masse. De plus, la méthode LC-MS offre des avantages en temps et en reproductibilité, car la méthode LC-UV nécessite une réaction de dérivation qui prend beaucoup de temps, ce qui peut donner une variabilité de l'échantillon27. Cependant, l'injection de supports de culture cellulaire brut dans la méthode LC-MS peut causer des effets néfastes sur le signal de SP en raison de l'encrassement de l'écumeur d'ion. Une échelle d'étalonnage est injectée fréquemment comme une vérification de l'aptitude du système, et l'ordre de l'échantillon est randomisé pour prévenir les biais dans les données.
Le processus de culture cellulaire pour la production d'anticorps à l'aide de microbioréacteurs est précédemment décrit9. Dans cette étude, les protocoles détaillés pour les méthodes de caractérisation des anticorps monoclonaux qui maximisent les données acquises à partir de volumes d'échantillons limités sont bien définis. Des quantités limitées de liquide de culture cellulaire récoltée peuvent parfois restreindre l'information sur le produit acquise et la sélection des bonnes procédures analytiques pour obtenir des données sur la qualité du produit est essentielle. L'analyse est importante pour relier les paramètres des processus en amont aux changements dans la qualité du produit. Ici, une ligne directrice est fournie pour les utilisateurs de caractériser mAbs lors de la collaboration avec des microbioréacteurs.
Disclosures
Cette publication reflète les vues de l'auteur et ne doit pas être interprétée comme représentant les vues ou les politiques de la FDA.
Acknowledgments
Les auteurs tient à remercier Scott Lute pour le soutien analytique qu'il a fourni. Le Programme de cheminement critique du CDER (CA #1-13) fournit un financement interne partiel et un soutien pour ce travail. Ce projet est appuyé en partie par une nomination au Programme de participation au stage et à la recherche à l'Office of Biotechnology Products, Food and Drug Administration des États-Unis, administré par le Oak Ridge Institute for Science and Education par l'entremise d'un entre le département de l'Énergie des États-Unis et la FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
| Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
| Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
| µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
| 0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
| 10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
| 1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
| 1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
| 1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
| 1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
| 15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
| 150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
| 96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
| ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
| ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
| ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
| Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
| Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
| Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
| Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
| Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
| Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
| Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
| Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
| Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
| GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
| GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
| GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
| GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
| GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
| Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
| Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
| Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
| Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
| Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
| RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
| Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
| TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
| UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
| Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
| Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
| Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
| Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |
References
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