Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

بوليومافيروس خلية ميركل العدوى والكشف

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتصيب الابتدائي تنتجها من الخلايا الجلدية البشرية الليفية مع MCPyV. يشمل البروتوكول عزل الخلايا الليفية الجلدية، وإعداد فيريونس MCPyV والإصابة بعدوى الفيروس، وتلطيخ الفلورة والأسفار في التهجين الموقعي. ويمكن تمديد هذا البروتوكول وصف التفاعلات MCPyV-المضيف واكتشاف أنواع الخلايا الأخرى إينفيكتابل ب MCPyV.

Abstract

يمكن أن تؤدي الإصابة polyomavirus (MCPyV) خلية ميركل إلى ميركل سرطان الخلية (MCC)، أحد أشكال سرطان الجلد شديدة عدوانية. الدراسات الميكانيكية إجراء تحقيقات كاملة في البيولوجيا الجزيئية MCPyV وآليات النمطان أعيقت بعدم وجود نماذج ثقافة الخلية الملائمة. وهنا يصف لنا مجموعة من البروتوكولات لأداء، واكتشاف الإصابة MCPyV خلايا الجلد البشرية الأساسية. وصف البروتوكولات عزلة الليفية الجلدية البشرية، إعداد فيريونس MCPyV المؤتلف، والكشف عن الإصابة بالفيروس تلطيخ (إذا كان) إيممونوفلوريسسينت وفي الموقع التهجين الحمض النووي سلسلة من ردود الفعل (HCR)، التي هي درجة عالية من الحساسية الأسفار في نهج الموقع التهجين (الأسماك). يمكن تكييفها مع البروتوكولات الملحقة هذه الوثيقة من الباحثين المهتمين التعرف على أنواع الخلايا أو خطوط الخلايا التي تدعم MCPyV العدوى الأخرى. وصف نهج الأسماك يمكن تكييفها أيضا للكشف عن مستويات منخفضة من السلطات الوطنية المعينة موجودة في جلد الإنسان المصابة الفيروسية.

Introduction

ميركل خلية polyomavirus (MCPyV) هو فيروس الحمض النووي الصغيرة، مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي تم إقرانها مع سرطان جلد نادرة ولكن العدوانية، ميركل الخلية الكبدية (MCC)1،2. يتجاوز معدل الوفيات من لجنة التنسيق الإداري، حوالي 33%، سرطان الجلد3،4. وقد MCPyV جينوم دائرية ~ 5 كيلو بايت1،5 جزئين حسب منطقة تنظيمية غير الترميز (نكر) في أوائل وأواخر ترميز المناطق1. نكر يحتوي على أصل الفيروسية النسخ المتماثل (أوري) والمروجين ثنائي الاتجاه للنسخ الفيروسي6،7. المنطقة أوائل يشفر البروتينات مستضد ورم دعا كبير تي (LT)، تي الصغيرة (ش)، 57kT، ORF الملازم البديلة (ألتو)، فضلا عن أوتوريجولاتوري ميرنا1،،من89،10. ترميز المنطقة أواخر بروتينات قفيصه VP1 و VP211،،من1213. الملازم وشارع البروتينات MCPyV أفضل درس وأظهرت دعما لتكرار الحمض النووي الفيروسي والمستحثه MCPyV tumorigenesis5. ومن المرجح الاستنساخ إدماج MCPyV الدنا في الجينوم المضيفة، وقد لوحظ في تصل إلى 80 في المائة من مراكز مراقبة الرحلات، عاملاً سببياً للمصابات بفيروس الورم التنمية14،15.

حالات الإصابة بلجنة التنسيق الإداري ثلاثة إضعاف على مدى السنوات العشرين الماضية16. أعراض الإصابة MCPyV أيضا على نطاق واسع في عموم السكان17،،من1819. مع تزايد عدد التشخيصات لجنة التنسيق الإداري وتفشي العدوى MCPyV، هناك حاجة إلى تحسين فهمنا للفيروس وإمكاناتها النمطان. ومع ذلك، يظل العديد من جوانب البيولوجيا MCPyV وآليات النمطان غير مفهومة20. هذا إلى حد كبير لأن MCPyV يتطابق سيئة في الخلية أنشئت خطوط11،12،21،،من2223 ، وحتى وقت قريب، خلايا قادرة على دعم MCPyV الجلد ولم تكن الإصابة اكتشفت22. قد عرقلت الدراسات الميكانيكية للتحقيق الكامل MCPyV وتفاعلها مع الخلايا المضيفة بالافتقار إلى نظام الثقافة خلية لنشر الفيروسات5.

فقد اكتشفنا أن الليفية الجلدية البشرية الأولية (هي) المعزولة من القلفة البشرية الولدان دعم قوي MCPyV العدوى على حد سواء في المختبر و السابقين فيفو24. من هذه الدراسة، قمنا بإنشاء أول خلية ثقافة العدوى نموذج MCPyV24. وبناء على هذا النظام النموذجي، واظهرنا أن استحثاث جينات أية (MMP) مصفوفة من WNT/بيتا-كاتينين إشارات الطريق وغيرها من عوامل النمو يحفز الإصابة MCPyV. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن تراميتينيب خصم مجاهدي خلق التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير يعوق فعالية MCPyV العدوى5،25. من هذه الدراسات، كما أنشأنا مجموعة من البروتوكولات لعزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية24،25، إعداد MCPyV فيريونس11،12، أداء MCPyV العدوى في الخلايا الليفية الجلد البشري 24 , 25 وكشف MCPyV البروتينات التي إذا المصبوغة26. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تكييفها في الموقع الحمض النووي التهجين سلسلة من ردود الفعل (HCR) التكنولوجيا27 لتطوير تقنية أسماك حساسة للغاية (HCR-الحمض النووي الأسماك) للكشف عن MCPyV الحمض النووي في خلايا الجلد البشرية المصابة. هذه الأساليب الجديدة سوف تكون مفيدة لدراسة دورة المعدية MCPyV، فضلا عن الاستجابة الخلوية للإصابة MCPyV. الخلايا الخزان المضيفة الطبيعية التي تحافظ على العدوى MCPyV والخلايا التي تؤدي إلى أورام لجنة التنسيق الإداري ما زال مجهولاً. يمكن تطبيق التقنيات يصف لنا في هذه المخطوطة دراسة أنواع مختلفة من الخلايا البشرية لتحديد الخلايا الخزان ومنشأ الأورام لجنة التنسيق الإداري. يمكن أيضا استخدام اساليبنا المتبعة، مثل "الأسماك" HCR-الحمض النووي، وفي الكشف عن فيروسات الورم الحمض النووي الأخرى ووصف التفاعلات الخلية المضيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتم الحصول على فوريسكينس حديثي الولادة البشرية من مركز أبحاث الأمراض الجلدية بنسلفانيا. تم الحصول على الكبار الليفية البشرية من التخلص من الجلد الطبيعي بعد الجراحة. ووافق جميع البروتوكولات الملحقة بجامعة "بنسلفانيا مجلس المراجعة المؤسسية".

1-عزل الخلايا الليفية الجلد البشري

  1. استخدام مقص لتقليم قبالة النسيج تحت الجلد والدهون من القلفة الولدان البشرية وقطع العينة الجلد في إنصاف أو أرباع.
  2. احتضان الأنسجة في 5 مل من 10 ملغ/مل ديسباسي الثاني في برنامج تلفزيوني وتستكمل مع مضاد حيوي فطري في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  3. في صحن معقم 10 سم، منفصلة بعناية البشرة من طبقات الجلد باستخدام الملقط ميكروديسيكتيون.
  4. نقل الأنسجة الجلدية الناتجة إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 5 مل من 2 مغ/مل كولاجيناز اكتب الرابع المتوسط خالية من FBS وتستكمل مع مضاد حيوي فطري.
  5. احتضان العينة في 37 درجة مئوية في 5% CO2 لح 4-6 مع تهز الدوري حتى تبقى عدد قليل الأنسجة العيانية المجاميع.
  6. بيان بيبيتينج صعودا وهبوطاً (تريتوراتينج) بقوة عشر مرات ماصة 10 مل خلايا مفردة من الأدمة.
  7. الطرد المركزي في 180 x ز لمدة 5 دقائق، وتجاهل المادة طافية.
  8. لوحة الخلايا ينتابها المتوسط دميم وتستكمل مع مصل العجل الجنين 10% والأحماض الأمينية غير الأساسية 1% 1% لالجلوتامين في 37 درجة مئوية في 5% CO2.

2-المؤتلف إعداد virion MCPyV

  1. خلاصة 50 ميكروغرام من بلازميد pR17b (التي تحمل الجينوم MCPyV) مع 250 يو من بامهي-التردد في وحدة تخزين 200 ميليلتر (ح 4 في 37 درجة مئوية) لفصل الجينوم الفيروسي من ناقلات العمود الفقري (الشكل 2).
  2. إضافة 1200 ميليلتر من المخزن المؤقت PB (تستكمل مع 10 ميليلتر من 3 م NaAc، pH 5.2) للحمض النووي هضمها وتنقية أعمدة الدوران مينيبريب ما يزيد على 2 (20 ميكروغرام قدرة الحمض النووي). الوت بلازميد هضمها pR17b من كل عمود مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl، pH8.0، يدتا 1 مم).
  3. إعداد رد فعل ربط في أنبوب الطرد مركزي 50 مل. إضافة 400 ميليلتر لتنقية بلازميد الحمض النووي من الخطوة 2، 2، 8.6 مل x T4 1.05 ليجاسى المخزن المؤقت و 6 ميليلتر من ليجاسى ارتفاع تركيز T4. احتضان في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. إضافة 45 مل من المخزن المؤقت PB (تستكمل مع 10 ميليلتر من 3 م NaAc، pH 5.2) إلى عملية ربط واستخدام مشعب فراغ لتحميل من خلال أعمدة الدوران مينيبريب 2. الوت كل عمود مع 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. ويتوقع عائد من حوالي 30 ميكروغرام للحمض النووي.
  5. في وقت متأخر بعد الظهر/المساء، طبق البذور 6 × 106 293TT28 الخلايا إلى 10 سم تحتوي على دميم المتوسطة وتستكمل مع مصل العجل الجنين 10% والأحماض الأمينية غير الأساسية 1% 1% لتر-الجلوتامين دون هيجروميسين باء
  6. في صباح اليوم التالي، التأكد من أن الخلايا هي حوالي 50% المتلاقية. ترانسفيكت باستخدام ميليلتر 66 من تعداء كاشف (1.1 ميليلتر/سم2)، 12 ميكروغرام من MCPyV الواصلة إعادة عزل الحمض النووي R17b من الخطوة 2، 4، 8.4 ميكروغرام من ش التعبير بلازميد بمتب و 9.6 ميكروغرام من الملازم التعبير بلازميد بادل *29.
  7. عندما تكون الخلايا transfected المتلاقية تقريبا، وفي اليوم التالي، تريبسينيزي الخلايا ونقلها إلى طبق 15 سم لاستمرار التوسع.
  8. بشكل اختياري اتخاذ عدد قليل من الخلايا 293TT على التوسع وأداء إذا تلطيخ للملازم MCPyV (CM2B4) و VP1 (MCV VP1 الأرنب30) لتحديد كفاءة تعداء. في هذه المرحلة، قد تكون نووية الملازم إشارة مرئية ولكن التعبير VP1 ربما لن تكون قابلة للكشف.
  9. عندما يصبح الطبق 15 سم تقريبا روافد (عادة 5-6 أيام بعد تعداء الأولية)، تحويل الخلايا إلى ثلاثة أطباق 15 سم. حصاد الخلايا من الأطباق 15 سم عندما تصبح تقريبا المتلاقية ويتبع البروتوكول الحصاد الفيروسات أدناه.
    ملاحظة: بشكل اختياري تنفيذ مراقبة الجودة إذا كما هو موضح في الخطوة 2.8. ينبغي أن تكون معظم الخلايا MCPyV LT و VP1 إيجابية في هذه المرحلة.
  10. حصاد الفيروس، تريبسينيزي الخلايا، وتدور في 180 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وإزالة المادة طافية. إضافة خلية واحدة بيليه حجم دببس-ملغ (دببس مع 9.5 مم مجكل2 و 1 x مضاد حيوي فطري). قم بإضافة كبريتات الأمونيوم 25 مم (من 1 م الأس الهيدروجيني 9 حل أسهم) تليها 0.5% X-100 تريتون (من 10% أسهم حلاً)، 0.1% بينزوناسي و 0.1% من "الدناز" ATP-تعتمد على. يخلط جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  11. احتضان المخلوط لمدة 15 دقيقة على الجليد ومن ثم إضافة حجم 0.17 5 م كلوريد الصوديوم. خلط واحتضان على الجليد لآخر 15 دقيقة تدور لمدة 10 دقيقة في س 12,000 ز في الطرد مركزي 4 درجات مئوية. إذا لم تكن المادة طافية واضحة، برفق عكس الأنبوب وكرر الخطوة الغزل. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
  12. ريسوسبيند بيليه باستخدام وحدة تخزين واحدة من دببس وتستكمل مع 0.8 م كلوريد الصوديوم، وتدور مرة أخرى، كما هو موضح في الخطوة 2.11.
  13. الجمع بين سوبيرناتانتس من الخطوة 2.11 و 2.12، وتدور أكثر من مرة واحدة كما هو موضح في الخطوة 2.11.
  14. في رقيقة الجدار 5 مل بوليالومير أنابيب صب تدرجات إيوديكسانول من أونديرلايينج (33%، 27%، ثم 39 في المائة) ~0.7 مل خطوات استخدام المحاقن 3 مل مزودة بإبرة طويلة أو ماصة p1000.
  15. تحميل 3 مل من توضيح المادة المحتوية على الفيروس طافية على استعداد إيوديكسانول التدرج.
  16. تدور عن 3.5 ح في س 234,000 ز و 16 درجة مئوية في دوار SW55ti. تعيين التسارع والتباطؤ بطء.
  17. بعد تنبيذ فائق، جمع 12 الكسور في أنابيب سيليكونيزيد (كل جزء هو ~ 400 ميليلتر).
  18. تحليل الكسور لوجود فيروس بكاشف دسدنا و/أو لطخة غربية ل VP1 (MCV VP1 الأرنب30). تجمع الكسور التدرج مع ذروة دسدنا و/أو محتوى VP1 وتميز المخزون قبل PCR الكمي لحساب الجينوم الفيروسي أي ما يعادل31. تخزين MCPyV virion المخزون في-80 درجة مئوية.

3-العدوى

  1. الحفاظ على الابتدائي الليفية الجلدية البشرية في دميم مع مصل العجل الجنين 10%، والأحماض الأمينية غير الأساسية 1% و 1% لتر-الجلوتامين. عند الوصول إلى التقاء، انقسام الخلايا الليفية 1:4 دون الغزل إلى أسفل.
    ملاحظة: لأعلى كفاءة الإصابة MCPyV، استخدام الخلايا الليفية الأولية بين 5 و 12 أن يتم تقسيم نشاط في الوقت لطلاء الممرات.
  2. لتصيب الإنسان الليفية الجلدية، نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع دببس.
  3. أضف 1 مل من 0.05% التربسين-أدتا إلى الطبق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
  4. فحص تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا هي نزوله الطبق.
  5. أضف 10 مل من DMEM/F12 المتوسطة التي تحتوي على 20 نانوغرام/مل مماثلة، 20 نانوغرام/مل بفجف و 3 ميكرومتر CHIR99021، كل منها حفز MCPyV الإصابة24، إلى الطبق ونقل الحل خلية في أنبوب 15 مل.
  6. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 180 س ز 2 دقيقة، وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا في المتوسط DMEM/F12 تحتوي على 20 نانوغرام/مليلتر مماثلة، 20 نانوغرام/مل بفجف و 3µM CHIR99021 2-4 × 104 خلايا كل مل.
  7. البذور 200 ميليلتر من تعليق خلية تستكمل مع 1 ملغ/مل كولاجيناز النوع الرابع في كل بئر من صفيحة 96-جيدا. ذوبان الجليد MCPyV virion الأسهم على الجليد. إضافة 109 الجينوم الفيروسي مكافئات فيريونس MCPyV (المحسوبة في الخطوة 2.18) كل 1 ميليلتر من إيوديكسانول لكل الخلايا 2,500 إلى 5000 للإصابة.   اضغط على الجانب من اللوحة برفق ووضع اللوحة في الحاضنة.
  8. تضاف بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 لح 48-72، 20% FBS لكل بئر.
  9. السماح بالعدوى إلى المضي قدما في 37 درجة مئوية في 5% CO2 لح 72-96.

4-تلوين إيمونوفلوريسسينت

  1. إصلاح الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 9 مع بارافورمالدهيد 3% في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
  2. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين.
  3. احتضان الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لحجب permeabilization (0.5% X-100 تريتون، جيش صرب البوسنة 3% في برنامج تلفزيوني تصفيتها عن طريق 0.22 ميكرومتر تصفية) في RT ح 1.
  4. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية التالية: الفأر الملازم MCPyV مكافحة [مونوكلونل] (CM2B4) (1: 1000) والارنب MCPyV مكافحة [بولكلونل] جسم VP1 (1:2000)، في RT ح 3.
  5. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
  6. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية: 594 فلور الماعز الماوس المضادة IgG (1: 1000) وفلور 488 الماعز المضادة الأرنب مفتش (1: 500) على RT ح 1.
  7. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
  8. كونتيرستين الخلايا مع 0.5 ميكروغرام/مل DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، هيدروكلوريد).
  9. جبل كوفيرسليبس على الزجاج الشرائح وتحليل استخدام مجهر مقلوب الأسفار.

5-في الموقع الحمض النووي-المجلس الأعلى للجمهورية

ملاحظة: يتطلب هذا الأسلوب أن يكون المصنف الخلايا في كوفيرسليبس. لهذا الغرض، قد الارتقاء بالإصابة بالشروط الموضحة أعلاه (الخطوة 3)، على شكل لوحة 24-جيدا.

  1. إصلاح الخلايا المستزرعة في كوفيرسليبس مع 4% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني عن 10 دقيقة أغسل كوفيرسليبس مرتين مع برنامج تلفزيوني، ثم تعاملهم مع الإيثانول 70% بيرميبيليزي الخلايا عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يمكن أن تظل عينات الثابتة في هذه الدولة لعدة أيام.
  2. قبل هجن عينات الاستعاضة عن الإيثانول بمسبار التهجين المخزن المؤقت وحضانة لمدة 60 دقيقة في الرايت
  3. تمييع probe(s) (1 ميكرومتر) (الجدول 1) في التهجين مسبار المخزن المؤقت الحل في تمييع 1: 500 30 دقيقة قبل نهاية الخطوة السابقة التهجين واحتضان عند 45 درجة مئوية.
  4. في نهاية إينكوباتيونس، "الماصة؛" ~ 10 ميكروليتر من هذا المزيج المخفف المسبار كل ساترة على شرائح المجهر. مكان كوفيرسليبس، جانب الخلية إلى أسفل، على بهم قطرات كل منهما من مسبار التهجين مزيج. ختم الحواف وظهورهم كوفيرسليبس على الشرائح مع ليبرالية مبلغ الأسمنت والمطاط.
  5. الحرارة الشرائح مع تحقيقات إضافية في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق عن طريق تحديد الشرائح على الجانب المسطح من كتلة الحرارة. نقل الشرائح إلى دائرة هوميديفيد واحتضان عند 45 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لجعل غرفة هوميديفيد بسيطة، يثبط طفيفة مناشف ورقية معقمة مع dH2س ومكان في الجزء السفلي من وعاء من البلاستيك أن الأختام مع طوقا مطاط.
    ملاحظة: أثناء تدفئة الأسمنت المطاط يمكن فقاعة بإيجاز. ومع ذلك، ضمان أن لا يكسر الختم.
  6. عناية قشر بعيداً من الأسمنت المطاطي بالملقط ووضع الجانب الخلية كوفيرسليبس حتى الظهر في آبار صفيحة 24-جيدا. أغسل كوفيرسليبس بمسبار يغسل المخزن المؤقت في الرايت ثلاث مرات.
  7. احتضان ساترة في المخزن المؤقت للتضخيم (200 ميليلتر في لوحات 24-جيدا) في الرايت 30-60 دقيقة.
  8. يصلب في الوقت نفسه، كل من دبابيس الشعر المسمى اليغنوكليوتيد هما الاعتراف بالمسابير (الجدول 1) في أنابيب PCR منفصلة بالتدفئة إلى 94 درجة مئوية ل 90 s وتبريد RT لمدة 30 دقيقة مع حماية من الضوء. مزيج من دبابيس الشعر اثنين في المخزن المؤقت للتضخيم، كل منهما في إضعاف 01:50.
  9. جعل سطح لرد فعل التضخيم التي تمتد البارافين الفيلم على وجه فتح غطاء لوحة 24-جيدا. "الماصة؛" 50-100 ميليلتر قطرات من الخليط دبوس/التضخيم المخزن المؤقت على الفيلم البارافين لكل ساترة. استخدام الملقط لإزالة كوفيرسليبس عناية من الحل قبل التضخيم. الجاف ساترة بلمس الحافة إلى مسح المتاح المليئة بالثغرات، ووضع الجانب خلية لأسفل على الحبرية التضخيم.
  10. ضع غطاء لوحة عقد في كوفيرسليبس في غرفة هوميديفيد واحتضان بين عشية وضحاها في RT في الظلام.
  11. العودة كوفيرسليبس إلى الآبار مرة أخرى. احتضان العينات مع 5 x SSCT [5 × سترات الصوديوم (SSC) كلوريد الصوديوم 0.1% 20 توين التي تمت تصفيتها من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر] التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام/مل DAPI ح 1 في الرايت أغسل العينات مرتين مع 5 x SSCT في الرايت
  12. جبل في كوفيرسليبس على شرائح المجهر. تحليل الخلايا والعينات باستخدام مجهر مقلوب الأسفار صورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح البروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة عزلة السكان متجانسة تقريبا من هي (الشكل 1). كما يتبين من تلطيخ إيمونوفلوريسسينت، تقريبا 100% من الخلايا الجلدية البشرية المعزولة باستخدام الشروط الموصوفة في هذا البروتوكول كان إيجابيا الملون لعلامات جلدية تنتجها الخلايا الليفية وفيمنتين والكولاجين أنا24، ولكن السلبية للإنسان علامة keratinocyte القلفة K14 (الشكل 1). ويبين الشكل 2 عملية توليد فيريونس MCPyV استخدام المؤتلف MCPyV الجينوم وعينه virion بعد تركيز أولتراسينتريفوجي. بعد تصور فرقة فيريونس MCPyV تتركز في جوهر التدرج (تميزت سهم في الشكل 2ب)، وقد جمعت 500 ميليلتر الكسور وأجرى MCPyV qPCR لتحديد الكسور الذروة. ويرد مثال qPCR تحليل البيانات في الشكل 2ج. في بعض التجارب الأخرى، تم تحليل العينات أيضا مع النشاف الغربية باستخدام جسم عزام أرنب-مكافحة-MCPyV (تكميلية الشكل 1). ويبين الشكل 3 إيمونوفلوريسسينت الصور الملون من هي مصابة MCPyV. يدوياً تحديد الخلايا إيجابية، احصينا مالا يقل عن ثلاثة آراء عشوائية من الخلايا حوالي 300. ونحن نعتبر الخلايا LT إيجابية، VP1 الإيجابية، أو الملازم و VP1 الإيجابية أن تكون إيجابية بالنسبة للعدوى MCPyV. في هذه التجارب هو موضح في الشكل 3، ما يزيد على 30% خلايا هم الملازم إيجابية وأكثر من 10% VP1 إيجابية. تم اكتشاف الجينوم MCPyV تكرارها في الخلايا المصابة باستخدام كل من الأسماك HCR-الحمض النووي (الشكل 4أ) والأسماك إيمونوفلوريسسينت-المجلس الأعلى للجمهورية-الحمض النووي (الشكل 4ب). بينما "الأسماك" HCR-الحمض النووي يكشف التعريب MCPyV الحمض النووي الموجودة في المصنع النسخ المتماثل (البؤر) في الشكل 4أ، أساليب "الأسماك" إيمونوفلوريسسينت-المجلس الأعلى للجمهورية-الحمض النووي يتيح الكشف عن متزامنة MCPyV الحمض النووي والملازم يشترك إضفاء الطابع المحلي البروتين في النسخ المتماثل مراكز (الشكل 4ب). الصور من الأسماك إيمونوفلوريسسينت-المجلس الأعلى للجمهورية-الحمض النووي أثبتت أنه يمكن استخدام هذه التقنية للكشف عن التعريب المشارك من الحمض النووي الفيروسي والبروتينات الفيروسية المرتبطة بها.

Figure 1
الشكل 1 . الليفية الجلدية البشرية المعزولة من القلفة البشرية الولدان. الخلايا الجلدية البشرية المستزرعة في المتوسط DMEM/F12 تستكمل مع 10% FBS كانت ملطخة باستخدام الأجسام المضادة ضد فيمنتين، الكولاجين أنا، أو كيراتين 14 (K14). كما كانت كونتيرستاينيد الخلايا مع DAPI. بار، 50 ميكرومتر. وكان هذا الرقم مقتبسة من S2 الشكل من ليو et al., 201624. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . إنتاج virion MCPyV استخدام الجينوم الفيروسي المؤتلف. (A) A بلازميد خريطة pR17b (MCPyV الجينوم بلازميد). (ب) صورة تمثيلية عينة virion MCPyV حصادها وتنقيتها عبر تدرج. السهم يمثل عصابة فيريونس MCPyV تتركز في جوهر التدرج. عدد (ج) نسخة الجينوم الفيروسي في كل جزء التدرج كان كمياً باستخدام قبكر. الأساسية للكسور التدرج (أرقام، عد من الأعلى من التدرج، مبينة في الجزء السفلي من الرسم البياني). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط (S.E.M.) ليكرر التقنية الثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . الليفية الجلدية البشرية دعم قوية MCPyV العدوى، والنسخ، والنسخ المتماثل- الليفية الجلدية المعزولة من جلد الإنسان تعامل مع فيريونس MCPyV في الرابع مماثلة، بفجف، CHIR99021، وكولاجيناز تحتوي على المتوسط F12 دميم لمدة يومين. بعد تغيير إلى المتوسطة DMEM/F12 الطازجة التي تحتوي على 20% FBS لثلاثة أيام أخرى، الخلايا المناعية الملطخة باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها وكونتيرستينيد مع DAPI. العديد من الخلايا ليس فقط أعربوا عن الغاية الملازم و VP1 ولكن أيضا إظهار MCPyV قوية النسخ المتماثل البؤر. تم تكييف هذا الرقم من الرقم 3 من ليو وآخرون، 201624. مقياس بار، 50 م. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . كشف MCPyV في الخلايا المصابة باستخدام تقنيات الأسماك- (أ) عن طريق الجلد الخلايا البشرية المزروعة في DMEM/F12 الذي يحتوي على نوع مماثلة، بفجف، CHIR99021، وكولاجيناز رابعا تعامل مع MCPyV لمدة يومين. بعد تغيير إلى دميم/F12 الطازجة التي تحتوي على FBS لمدة 3 أيام أخرى، تعرض الخلايا لتحليل الحمض النووي HCR "الأسماك". كما كانت كونتيرستينيد الخلايا مع DAPI. (ب) الخلايا الجلدية البشرية المستزرعة في مماثلة تحتوي على المتوسط، بفجف، و CHIR99021 كانت أما غير المعالجة (صورية) أو تعامل (المصابة) مع MCPyV كما هو موضح في (A). تعرض الخلايا المناعية-صيد الأسماك باستخدام الملازم الحمض النووي الخاصة MCPyV وجسم تحقيقات قبل كونتيرستينينج مع DAPI. واستخدمت المسابير HPV16 كعنصر سلبي. مقياس بار، 10 أمتار. تم تكييف هذا الرقم من الرقم 4 من ليو وآخرون، 201624. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

اسم مسبار تسلسل
MCPyV مسبار 1 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك تجاجكتاككتكاكتاجاجتجتتتتاتاكتجكاجتتكككجكككتج كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
MCPyV المسبار 2 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك أجاجككتكجاجكتاجاجككككاجككتكتجككاكتجااااااا كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
MCPyV التحقيق 3 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك كاتجاكتكاتتككتجاجاجكجاجتتجاكتجاتااكاااكتت كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
MCPyV المسبار 4 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك جاتاكتجككتتتتتتجكتاتاجككتكتاجككتكاجاجتككتكتكت كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
MCPyV المسبار 5 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك آجكتتكتككتجتاجاتاجكتتككااجتاكتككتجتجتجكاكت كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
MCPyV التحقيق 6 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك جاتجتجككاتاكاتاجاجكاتكتككاااجكتجكاكاجاجكك كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
MCPyV المسبار 7 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك جكتكاجججاجااجتجاتكاتكجكاجاجاجاتككتكككاجتجككا كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
مسبار MCPyV 8 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك آجككتججاكجكتجاجاجاكككاتاكككاجاجاجاجكتكتجكتج كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
MCPyV المسبار 9 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك أجكتتكججاككككككااتتتكجكتتكتجاجاتجاجاجججتك كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
MCPyV المسبار 10 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك كتتتجكتاجاكاجتجتكتجكجكتجتجكااتجتتتكتجاجا كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
فيروس الورم الحليمي البشري مسبار 1 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك كاجكتكتجتجكاتاكتجتجتاكتتكتججتكجكتككتجتججتككت كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
فيروس الورم الحليمي البشري المسبار 2 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك أكاتاتتجتاتججكتكتجتككجتكتجكتجتككاجكتجاككاتك كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
فيروس الورم الحليمي البشري التحقيق 3 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك جتكاجكتاتاكتججتجتاجتككااتجكاجكاتاكاككاتكجكاك كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
فيروس الورم الحليمي البشري مسبار 4 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك كتتتجتاتججتكجكجكجججتجتتجككاجتجكتجككتاتات كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت
فيروس الورم الحليمي البشري المسبار 5 تااا ككتكاككتاككتككاكتكتكاككاتاتكجكتك ككاتككاتاكاتكككجتاكككتكتككككاتجتاككتجكاجاتكاج كاكاتتاكاجاككتكاككتاككتككاكتكتكاك أتتت

الجدول 1: المسابر المستخدمة في هذه الدراسة.

Supplemental Figure 1
تكميلية الشكل 1. فحص كسور التدرج إيوديكسانول MCPyV VP1. تم تفكيك الخلايا المصابة MCPyV وتعرضوا لوجود التدرج إيوديكسانول. الأساسية كسور التدرج (أرقام، العد من أسفل التدرج في هذه التجربة، مبينة في الجزء العلوي من هذا الرقم) تعرضوا لتحليل لطخة غربية للكشف عن VP1. 10 ميليلتر عينات من كل جزء تم تعديلها إلى 1 x تحميل صبغ مع تركيز نهائي 5% 2-mercaptoethanol وساخنة بإيجاز إلى 65 درجة مئوية. العينات تم فصل في جل تريس مكررا 4-12% ومسح على النيتروسليلوز. وأجرى النشاف الغربية في تبسة مع اللبن المجفف الخالي من بينها antiserum المخفف عزام أرنب-مكافحة-MCPyV باستخدام. أنتيسيروم متاح عند الطلب. كاتشين 50 القياسية (التي تهاجر وبالمثل إلى كاتشين 47 مونومر MCPyV VP1) هو علامة نجمية. في الصورة المعروضة، والحد من عينة كانت ناقصة والمرتبطة بثنائي كبريتيد مولتيميرس VP1 الظاهر. يمكن أن يؤدي استخدام ديثيوثريتول و/أو ارتفاع درجات الحرارة تمسخ خفض أكثر اكتمالا للأنواع مونومر VP1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأساليب المذكورة أعلاه، بما في ذلك عزل الخلايا الليفية الجلد من أنسجة جلد الإنسان، إعداد المؤتلف MCPyV فيريونس، وعدوى الخلايا المستزرعة وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت، وأسلوب أسماك حساسة مقتبس من HCR التكنولوجيا، التي وينبغي أن تمكن الباحثين من تحليل MCPyV العدوى27. إحدى الخطوات الأكثر أهمية لتحقيق MCPyV العدوى في المختبر هو إنتاج الاستعدادات virion عيار عالية. باستخدام البروتوكول لإعداد المؤتلف فيريونس MCPyV الموصوفة هنا، يمكننا أن نحقق التتر الفيروسية 1012 الجينوم النسخ لكل مل من المذيب11،إيدوكسانول12. هذه عالية-عيار MCPyV الاستعدادات سمح لنا لتحديد هي كنوع خلايا الجلد الأولية فقط حتى الآن التي تظهر لدعم العدوى MCPyV كامل دورة24.

عزل الليفية الجلدية البشرية الطازجة باستخدام البروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة قد أتاح لنا لمراقبة نوعية الخلايا المستخدمة في الإصابة MCPyV التجربة وضمان الاتساق في النتائج التي توصل إليها عبر الخلايا المعزولة من عينات المرضى المختلفة. وينبغي تقييم جميع الليفية الجلدية البشرية المعزولة من جلد الأطفال حديثي الولادة لوجود الحمض النووي MCPyV qPCR ضمان عدم وجود العدوى MCPyV قبل المعالجة مع المؤتلف MCPyV فيريونس. بغية الحصول على أقصى قدر من الكفاءة العدوى MCPyV، من الضروري استخدام الليفية الجلدية البشرية المعزولة طازجة من القلفة البشرية حديثي الولادة أعلى ممر الليفية ودعم MCPyV انخفاض الإصابة بالكفاءة. علاوة على ذلك، عندما عزل بالتوازي من عينات الجلد الكبار، أيد الليفية من عينات الجلد الولدان كثير أعلى MCPyV كفاءة الإصابة24. قد اختبرنا ابدأ أي الخلايا المتوفرة تجارياً للإصابة MCPyV. ومع ذلك، نرى لا سبب محدد التي عزلت تجارياً الليفية ينبغي أن يكون أدنى من غيرها من إذا هم المرور أعلى نقطة تجميد.

كما أننا استخدمنا البروتوكول الموصوفة هنا لعزل الخلايا الليفية الجلد من الحيوانات الأخرى. على سبيل المثال، أننا استخدمنا البروتوكول لعزل الخلايا الليفية الجلد من الماوس (Mus musculus) والفئران (الجرذ النرويجي) شجرة النمرة (طوبيا بيلانجيري) (Macaca مالطا) المكاك الريسوسي25بنجاح. كما لوحظ في الخلايا البشرية، يسمح الليفية معزولة عن الشمبانزي الشابة العدوى MCPyV أكثر كفاءة بكثير مقارنة ب الحيوانات الأكبر سنا25.

مقارنة بالأسماك التقليدية، المجلس الأعلى للجمهورية-الحمض النووي "الأسماك" بسيطة، ولكن أسلوب حساسة للغاية للكشف عن الجينوم الفيروسي24،27. يمكن أن يتم الكشف عن مراكز النسخ المتماثل MCPyV سهولة في نويات الخلايا المصابة كبؤر الشروريه محددة للغاية، مع قليل من أي إشارة الخلفية اكتشف في عينات نفس تعامل مع فيروس الورم الحليمي البشري مسبار محددة (الشكل 4)24. في المستقبل، يمكن استكشاف النهج التالي للكشف عن وفرة منخفضة MCPyV الحمض النووي الموجودة في جلد الإنسان المصاب. كما يمكن تكييفها لرصد الفيروسات الحمض النووي الأخرى. عندما يتم دمجها مع تلطيخ إيمونوفلوريسسينت، المناعية-الأسماك يوفر وسيلة قوية للكشف في الوقت نفسه عن الحمض النووي الفيروسي والبروتين المرمز الفيروسية أو بروتينات المضيف الحالي في نفس الخلايا (الشكل 4). للحصول على أفضل النتائج باستخدام البروتوكولات المذكورة هنا، فمن الأفضل استخدام عينات طازجة الثابتة لتلطيخ إيمونوفلوريسسينت وتحليل الحمض النووي HCR "الأسماك". لتحليل الحمض النووي HCR "الأسماك"، يجب تخزين المسابير ومكبر للصوت في-80 درجة مئوية في مختبرين صغيرة لتجنب تكرار التجميد وذوبان الجليد.

استخدام المركز الثقافي الفرنسي خلية ثقافة وبروتوكول MCPyV العدوى، وبحثنا في ظروف نمو الخلية أن أفضل دعم MCPyV الدخول والنسخ، والنسخ المتماثل في هي. لقد اكتشفنا أن المعاملة هي مع عوامل النمو، مثل لو، بفجف، والحث على مسار WNT مما يشير إلى تعزز إلى حد كبير العدوى MCPyV. التنميط الجيني التعبير يكشف أن جينات عدة من الأسرة أية (MMP) مصفوفة، بما في ذلك MMP1، 3، 7، 9، 10، 11 و 13، كانت فعل قوة على التحفيز، وهذه عوامل النمو وتفعيل WNT مما يشير إلى المسار. لأن هذه الإنزيمات MMP قادرون على اللاإنسانية البروتينات المصفوفة خارج الخلية، ونحن السبب أنها قد تحفز الإصابة MCPyV بتعطيل المصفوفة خارج الخلية من الخلايا المضيفة. والواقع أن علاج هي مع كولاجيناز النوع الرابع، عضو في الأسرة، ونظام التمثيل التناسبي المختلط قوة يحفز MCPyV الإصابة (الشكل 3)24. ونحن أيضا فحص مجموعة واسعة مركبات، بما في ذلك عدة كيناز وافقت إدارة الأغذية والعقاقير مثبطات، لتأثير المثبطة في الإصابة MCPyV. فقد اكتشفنا أن تراميتينيب، مثبط MEK1 و MEK2، كبير يحول دون MCPyV الإصابة24. آخرون استخدام أو تعديل هذا النظام الإصابة كمنصة اكتشاف المخدرات لمثبطات MCPyV التي تقلل من الحمل الفيروسي MCPyV في مرضى المناعة.

باختصار، توفر هذه البروتوكولات لتحقيق كفاءة عالية MCPyV العدوى منبرا توضيح سوء فهم دورة MCPyV المعدية والمستحثه MCPyV آليات النمطان في سياق العدوى الفيروسية. ويمكن تطبيق هذا المجموعة من البروتوكولات في الدراسات المستقبلية لاستكشاف أنواع الخلايا البشرية MCPyV متساهلة إضافية، ولجنة التنسيق الإداري، الذي عارضة MCPyV العدوى يمكن أن يؤدي إلى تطوير ورم الخلايا الأصلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف يود أن يشكر الدكتور مينارد هيرلين (معهد ويستار) والدكتور م. سيليست سيمون (جامعة بنسلفانيا) لتوفير الكواشف والدعم التقني. كما نشكر أعضاء مختبراتنا لمناقشة مفيدة. وكان يدعمها هذا العمل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01CA187718 و R01CA148768 و R01CA142723)، ومنح دعم مركز السرطان NCI (NCI P30 CA016520)، وجائزة "كفار بنسلفانيا" (P30 منظمة العفو الدولية 045008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 144، بوليومافيروس خلية ميركل، العزلة، الليفية الجلدية، العدوى، كولاجيناز الرابع، CHIR99021، إيممونوفلوريسسينت تلطيخ، والأسفار في التهجين الموقعية، والحمض النووي-التهجين في الموقع سلسلة من ردود الفعل، والنسخ ، النسخ المتماثل
بوليومافيروس خلية ميركل العدوى والكشف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter