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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Merkel-Zell-Polyomavirus Infektion und Erkennung

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären menschlichen dermalen Fibroblasten mit MCPyV zu infizieren. Das Protokoll enthält Isolation der dermalen Fibroblasten, Vorbereitung von MCPyV Virionen, Virusinfektion, Immunfluoreszenz-Färbung und Fluoreszenz in Situ Hybridisierung. Dieses Protokoll kann für die Charakterisierung von MCPyV-Wirt Interaktionen und entdecken andere Zelltypen infizierbar durch MCPyV erweitert werden.

Abstract

Merkel Zelle Polyomavirus (MCPyV) Infektion kann zum Merkel-Karzinom (MCC), eine sehr aggressive Form von Hautkrebs führen. Mechanistische Studien vollständig MCPyV Molekularbiologie und onkogenen Mechanismen zu untersuchen haben durch einen Mangel an ausreichenden Zellmodelle Kultur erschwert. Hier beschreiben wir eine Reihe von Protokollen für die Durchführung und Nachweis MCPyV Infektion der primären menschlichen Hautzellen. Die Protokolle beschreiben die Isolation der menschlichen dermalen Fibroblasten, Vorbereitung von rekombinanten MCPyV Virionen und Nachweis von Virus-Infektion durch immunofluorescent (IF) Färbung und in-situ DNA-Hybridisierung Kettenreaktion (HCR), die sehr empfindlich ist Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Ansatz. Die Protokolle hierin können angepasst werden, indem interessierte Forscher identifizieren, andere Zelltypen oder Zell-Linien, die MCPyV Infektion unterstützen. Die beschriebene Vorgehensweise der Fisch könnte auch zur Erkennung von niedrigen Niveau der viralen DNA in die infizierten menschlichen Haut angepasst werden.

Introduction

Merkel Zelle Polyomavirus (MCPyV) ist eine kleine, doppelsträngige DNA-Virus, das eine seltene, aber aggressiver Hautkrebs, Merkel Cell Carcinoma (MCC)1,2zugeordnet wurde. Die Sterblichkeit von MCC, rund 33 % übersteigt die der Melanom-3,-4. MCPyV hat eine kreisförmige Genom von ~ 5 kb1,5 geteilt durch eine nicht-kodierenden regulatorischen Region (NCRR) in frühen und späten Codierung Regionen1. Die NCRR enthält die viralen Ursprungs der Replikation (Ori) und bidirektionale Promotoren für virale Transkription6,7. Die frühen Region kodiert Tumor Antigen Proteine genannt großen T (LT), kleine T (sT), 57kT, alternative LT ORF (alt) sowie ein Autoregulatory MiRNA1,8,9,10. Die späten Region kodiert das Kapsid Proteine VP1 und VP211,12,13. LT und sT sind die am besten untersuchten MCPyV Proteine und haben gezeigt, dass die virale DNA-Replikation und MCPyV-induzierten Tumorgenese5unterstützen. Klonale Integration der MCPyV DNA in das Wirtsgenom, die in bis zu 80 % der MCCs beobachtet wurde, ist wahrscheinlich ein ursächlicher Faktor für Virus-positiven Tumor Entwicklung14,15.

Die Inzidenz von MCC hat in den vergangenen zwanzig Jahren16verdreifacht. Asymptomatische MCPyV Infektion ist auch weit verbreitet in der allgemeinen Bevölkerung17,18,19. Mit der zunehmenden Zahl von MCC Diagnosen und die hohe Prävalenz von MCPyV Infektion ist für unser Verständnis des Virus und seine onkogenen Potential zu verbessern. Jedoch bleiben viele Aspekte der MCPyV Biologie und onkogenen Mechanismen schlecht verstandene20. Dies ist vor allem, weil MCPyV repliziert schlecht in etablierten Zelle Linien11,12,21,22,23 und bis vor kurzem Hautzellen unterstützen MCPyV Infektion nicht entdeckten22gewesen. Mechanistische Studien vollständig MCPyV und seine Wechselwirkung mit Wirtszellen zu untersuchen haben durch einen Mangel an Zellkultursystem für die Vermehrung des Virus5behindert.

Wir entdeckten, dass primäre menschliche dermale Fibroblasten (HDFs) von Neugeborenen menschliche Vorhaut Unterstützung robuste MCPyV Infektion sowohl in-vitro isoliert- und ex-Vivo-24. Aus dieser Studie haben wir die erste Zelle Kultur Infektionsmodell für MCPyV24. Aufbauend auf diesem Modellsystem, haben wir gezeigt, dass die Induktion von Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Gene durch den WNT/β-Catenin Signalisierung Weg und andere Wachstumsfaktoren MCPyV Infektion stimuliert. Darüber hinaus fanden wir, dass die FDA-zugelassenen MEK Antagonist Trametinib effektiv MCPyV Infektion5,25hemmt. Aus diesen Studien haben wir auch eine Reihe von Protokollen für die Isolierung von menschlichen dermalen Fibroblasten24,25, MCPyV Virionen11,12, vorbereiten, durchführen von MCPyV Infektion auf menschlichen dermalen Fibroblasten 24 , 25 und Erkennung von MCPyV Proteine durch IF Färbung26. Darüber hinaus haben wir die in-situ DNA-Hybridisierung Kettenreaktion (HCR) Technologie27 eine hochempfindliche Fisch-Technik (HCR-DNA Fisch) entwickelt zur Erfassung von MCPyV DNA in infizierten menschlichen Hautzellen angepasst. Diese neuen Methoden werden für das Studium des ansteckenden Zyklus der MCPyV als auch die zelluläre Reaktion auf eine MCPyV Infektion nützlich sein. Das natürliche Reservoir Wirtszellen, die MCPyV Infektion beibehalten und die Zellen, die Anlass zu MCC Tumoren bleiben unbekannt. Die Techniken, die wir in dieser Handschrift beschreiben könnte angewendet werden, um verschiedene Arten von menschlichen Zellen, sowohl die Reservoir-Zellen zu identifizieren und Herkunft der MCC Tumoren zu untersuchen. Unsere etablierten Methoden wie HCR-DNA Fisch, konnte auch in der Erkennung von anderen DNA-Tumorviren und Charakterisierung von Host-Zell-Interaktionen eingesetzt werden.

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Protocol

Menschlichen Neugeborenen Vorhäute wurden von Penn Skin Disease Research Center erhalten. Erwachsenen menschliche Fibroblasten wurden von ausrangierten normale Haut nach der Operation erhalten. Die Protokolle wurden von der University of Pennsylvania Institutional Review Board genehmigt.

1. Isolierung der menschlichen dermalen Fibroblasten

  1. Verwenden Sie eine Schere schneiden Sie Fett und subkutane Gewebe aus der menschlichen Neugeborenen Vorhaut und schneiden die Hautprobe in halbieren oder Vierteln.
  2. Inkubieren Sie das Gewebe in 5 mL 10 mg/mL Dispase II in PBS mit Antibiotikum Antimykotikums ergänzt bei 4 ° C über Nacht.
  3. Trennen Sie in eine sterile 10 cm Teller sorgfältig die Epidermis der Hautschichten mit Mikrodissektion Pinzette.
  4. Übertragung resultierenden dermale Gewebe eine 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL 2 mg/mL Kollagenase Typ IV in FBS-freies Medium mit Antibiotikum Antimykotikums ergänzt.
  5. Inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C in 5 % CO2 für 4-6 h mit periodischen schütteln, bis nur wenige makroskopische Gewebe Aggregate bleiben.
  6. Lassen Sie einzelne Zellen aus der Dermis durch Pipettieren nach oben und unten (verreiben) kräftig zehnmal mit einer 10 mL-Pipette.
  7. 180 X g für 5 min Zentrifugieren, und den Überstand verwerfen.
  8. Platte die dissoziierten Zellen in DMEM Medium ergänzt mit fetalen Kälberserum 10 %, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % L-Glutamin bei 37 ° C in 5 % CO2.

(2) rekombinante MCPyV Virion Vorbereitung

  1. Digest 50 µg pR17b Plasmids (Buchwert MCPyV Genom) mit 250 U der BamHI-HF in einem Volumen von 200 µL (4 h bei 37 ° C), das virale Genom aus dem Vektor-Backbone (Abbildung 2) zu trennen.
  2. Die verdaute DNA 1200 µL Puffer PB (ergänzt mit 10 µL 3 M NaAc, pH 5,2) hinzu und reinigen Sie über 2 Miniprep Spin Spalten (Kapazität 20 µg DNA) zu. Das verdaute pR17b Plasmid aus jeder Spalte mit 200 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA) eluieren.
  3. Bereiten Sie die Ligatur Reaktion in einer 50 mL Zentrifugenröhrchen. 400 µL gereinigtes Plasmid DNA aus Schritt 2.2, 8,6 mL 1,05 x T4 Ligase Puffer und 6 µL hohe Konzentration T4-Ligase hinzufügen. Über Nacht bei 16 ° C inkubieren.
  4. Der Ligatur fügen Sie 45 mL Puffer PB (ergänzt mit 10 µL 3 M NaAc, pH 5,2 hinzu) und verwenden Sie vielfältige Vakuum durch 2 Miniprep Spin Spalten zu laden. Eluieren Sie jede Spalte mit 50 µL TE-Puffer. Erwarten Sie eine Rendite von ca. 30 µg DNA.
  5. Am späten Nachmittag/Abend, 6 x 106 293TT28 Samenzellen in einer 10 cm Schale mit DMEM Medium ergänzt mit fetalen Kälberserum 10 %, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % L-Glutamin ohne Hygromycin B.
  6. Am nächsten Morgen dafür sorgen, dass die Zellen etwa 50 sind % konfluierende. Transfizieren mit 66 µL Transfection Reagens (1,1 µL/cm2), 12 µg Re ligiertes MCPyV isolieren R17b DNA aus Schritt 2.4, 8,4 µg ST Ausdruck Plasmid pMtB und 9,6 µg LT Ausdruck Plasmid pADL *29.
  7. Wenn die transfizierten Zellen fast konfluierende, am nächsten Tag sind, trypsinize die Zellen und übertragen Sie sie auf eine 15 cm Schüssel für eine weitere Expansion.
  8. Gegebenenfalls nehmen Sie eine kleine Anzahl von 293TT Zellen bei der Erweiterung und durchführen, wenn für MCPyV LT (CM2B4) Färbung und VP1 (MCV VP1 Kaninchen30) Transfection Leistungsfähigkeit zu bestimmen. Zu diesem Zeitpunkt möglicherweise nuklearen LT Signal sichtbar aber VP1 Ausdruck wird wahrscheinlich nicht nachweisbar sein.
  9. Wann wird die 15 cm Schüssel fast Zusammenfluss (in der Regel 5-6 Tage nach anfänglichen Transfektion), die Zellen in drei 15 cm Gerichte übertragen. Die Zellen von den 15 cm Speisen zu ernten, wenn sie fast konfluierende und die Virus-Ernte-Protokoll unten folgen.
    Hinweis: Führen Sie optional Qualitätskontrolle wenn wie in Schritt 2.8 beschrieben. Die meisten Zellen sollte MCPyV LT und VP1 positive in diesem Stadium.
  10. Um das Virus zu ernten, trypsinize Zellen, drehen 180 X g für 5 min bei RT und den Überstand zu entfernen. Fügen Sie eine Pellet Zellvolumen des DPBS-Mg (DPBS mit 9,5 mM MgCl2 und 1 X Antibiotikum Antimykotikums). Fügen Sie dann 25 mM Ammoniumsulfat (von einer 1 M pH 9 Vorratslösung) gefolgt von 0,5 % Triton x-100 (von einem 10 % Stammlösung), 0,1 % Benzonase und 0,1 % der eine ATP-abhängige DNase. Gut mischen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
  11. Inkubieren Sie die Mischung für 15 min auf Eis, und fügen Sie dann 0,17 Volumen von 5 M NaCl. Mischen und auf Eis für eine weitere 15 min. Spin für 10 min bei 12.000 X g in einer Zentrifuge 4 ° C inkubieren. Wenn der Überstand nicht klar ist, sanft invertieren Sie das Rohr und wiederholen Sie die Spinnerei Schritt. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch.
  12. Aufschwemmen der Pellets mit einem Band des DPBS ergänzt mit 0,8 M NaCl und Spin wieder, wie in Schritt 2.11 beschrieben.
  13. Kombinieren Sie die Überstände aus dem Schritt 2.11 und 2.12 und spin noch einmal wie in Schritt 2.11 beschrieben.
  14. Gießen Sie Steigungen von Iodixanol in 5 mL Polyallomer Rohre mit dünnen Wandstärken durch unterlegen (27 %, dann 33 % und 39 %) ~0.7 mL Schritten mit einer 3 mL Spritze mit einer langen Nadel oder einer Pipette p1000 ausgestattet.
  15. 3 mL geklärte Virus enthaltende Überstand auf die vorbereiteten Iodixanol Steigung zu laden.
  16. Für 3,5 h bei 234.000 X g und 16 ° C in einen SW55ti Rotor drehen. Legen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungswerte zu verlangsamen.
  17. Nach der Ultrazentrifugation Sammle 12 Fraktionen in silikonisierte Röhren (jede Fraktion ist ~ 400 µL).
  18. Analysieren der Fraktionen auf das Vorhandensein des Virus durch DsDNA-Reagenz und/oder Western-Blot für VP1 (MCV VP1 Kaninchen30). Bündeln Sie gradient Brüche mit Peak DsDNA und/oder VP1 Inhalte zu und charakterisieren Sie die Lager durch quantitative PCR, das virale Genom entspricht31zu berechnen. Speichern Sie MCPyV Virion Lager bei-80 ° C.

3. Infektion

  1. Pflegen der primären menschlichen dermale Fibroblasten in DMEM mit 10 % fetalen Kälberserum, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % L-Glutamin. Nach dem Zusammenfluss erreichen, split Fibroblasten 1:4 ohne Schleudern nach unten.
    Hinweis: Verwenden Sie für höchste MCPyV Infektion Effizienz, primäre Fibroblasten zwischen 5 und 12, die zum Zeitpunkt der Beschichtung aktiv teilen.
  2. Zu menschliche dermale Fibroblasten infizieren, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS.
  3. Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA, das Gericht und bei 37 ° C für ca. 5-10 min inkubieren.
  4. Überprüfen Sie unter die Lupe genommen, um sicherzustellen, dass die Zellen von der Schüssel kommen.
  5. Fügen Sie 10 mL DMEM/F12 Medium mit 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF und 3 µM CHIR99021, alle MCPyV Infektion24, auf den Teller zu stimulieren und die Zelle-Lösung in eine 15 mL Tube übertragen.
  6. Spin-down der Zellen bei 180 X g für 2 min, und den Überstand verwerfen. Aufschwemmen der Zellen in DMEM/F12 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF und 3µM-haltigem Medium CHIR99021 mit 2-4 x 104 -Zellen pro mL.
  7. Samen Sie 200 µL Zellsuspension mit 1 mg/mL Kollagenase Typ IV in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte ergänzt. MCPyV Virion Lager auf dem Eis auftauen. Fügen Sie 109 virale Genom äquivalente MCPyV Virionen (berechnet in Schritt 2.18) pro 1 µL Iodixanol für jeweils 2.500 bis 5.000 Zellen zu infizieren.   Tippen Sie auf der Seite der Platte vorsichtig und legen Sie die Platte in den Inkubator.
  8. Fügen Sie nach der Inkubation bei 37 ° C in 5 % CO2 für 48-72 h, 20 % FBS in jede Vertiefung.
  9. Die Infektion bei 37 ° C in 5 % CO2 für 72-96 h Vorgehen zu ermöglichen.

4. Immunofluorescent Färbung

  1. Zellen mit 3 % Paraformaldehyd in PBS für 20 min im Schritt 3.9 erhalten zu beheben.
  2. Zweimal waschen Sie die Zellen mit PBS.
  3. Inkubation der Zellen blockieren/Permeabilisierung Puffer (0,5 % Triton x-100, 3 % BSA mit PBS-Puffer durch 0,22 µm Filter gefiltert) bei RT für 1 h.
  4. Inkubation der Zellen mit der folgenden primären Antikörper: Maus monoklonalen Anti-MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) und Kaninchen polyklonale Anti-MCPyV VP1 Antikörper (1: 2000), bei RT für 3 h.
  5. Waschen Sie die Zellen mit PBS dreimal.
  6. Inkubation der Zellen mit den sekundären Antikörper: Fluor 594 Ziege Anti-Maus IgG (1: 1000) und Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen IgG (1: 500) bei RT für 1 h.
  7. Waschen Sie Zellen mit PBS dreimal.
  8. Counterstain Zellen mit 0,5 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride).
  9. Mount Deckgläsern auf Glas gleitet und analysieren mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.

5. In-situ DNA-HCR

Hinweis: Dieses Verfahren erfordert, dass die Zellen auf Deckgläsern ausgesät werden. Zu diesem Zweck können die Infektionsbedingungen beschrieben (Schritt 3) auf das 24-Well-Plattenformat skaliert.

  1. Beheben von Zellen kultiviert auf Deckgläsern mit 4 % PFA mit PBS-Puffer für 10 min. waschen den Deckgläsern zweimal mit PBS, dann behandeln sie mit 70 % Ethanol auf die Zellen bei 4 ° C über Nacht permeabilize.
    Hinweis: Feste Proben können für mehrere Tage in diesem Zustand bleiben.
  2. Pre-hybridisieren Sie Proben durch ersetzt das Äthanol mit Sonde Hybridisierung Puffer und Inkubation für 60 min bei RT
  3. Verdünnen Sie die Wortanzahl (1 µM) (Tabelle 1) in Sonde Hybridisierung Lösung bei Verdünnung 1: 500 30 min vor Ende der Pre-Hybridisierung Schritt zu puffern und inkubieren Sie bei 45 ° C.
  4. Am Ende der Inkubationen pipette ~ 10 μL der verdünnten Probe Mix pro Deckglas auf Objektträger. Ort der Deckgläsern, Zelle-Seite nach unten, auf ihre jeweiligen Tröpfchen Hybridisierung Sonde mischen. Versiegeln der Kanten und Rücken von den Deckgläsern, die Folien mit einen großzügigen Betrag von Gummilösung.
  5. Erhitzen Sie die Folien mit zusätzlichen Sonden bei 94 ° C für 3 min durch Festlegen der Folien auf der flachen Seite eines Blocks Hitze. Übertragen Sie die Folien in eine feuchte Kammer und über Nacht bei 45 ° C inkubieren. Um eine einfache feuchte Kammer bilden, feuchten Sie leicht sterilen Papiertüchern mit dH2O und in der Unterseite von einem Kunststoff-Behälter, der mit einer Gummidichtung dichtet.
    Hinweis: Beim Aufheizen die Gummilösung kann kurz Blase. Jedoch sicherstellen Sie, dass die Dichtung nicht bricht.
  6. Sorgfältig ziehen Sie die Gummilösung mit Zange ab und die Deckgläsern Zelle-Seite nach oben Rücken in Vertiefungen von einer 24-Well-Platte. Waschen Sie die Deckgläsern mit Sonde Waschpuffer bei RT dreimal.
  7. Das Deckglas in der Verstärkung Puffer (200 µL in 24-Well Platten) bei RT inkubieren 30-60 Minuten.
  8. Unterdessen Tempern jeweils die zwei markierten Oligonukleotid-Haarnadeln erkennen die Sonden (Tabelle 1) in separaten PCR-Röhrchen durch Erhitzen auf 94 ° C für 90 s und Abkühlung auf RT für 30 min und vor Licht zu schützen. Mischen Sie die zwei Haarnadeln in Verstärkung Puffer, jeweils bei einer Verdünnung von 01:50.
  9. Machen Sie eine Oberfläche für die Amplifikation Reaktion durch Dehnung Paraffin Film über das offene Gesicht des 24-Well-Platte Deckel. 50-100 µL Tröpfchen der Haarnadel/Verstärkung Puffer Mischung auf der Paraffin-Film für jede Deckglas Pipette. Verwenden Sie Zange zum Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläsern aus der Vorverstärkung Lösung. Trocknen Sie das Deckglas durch Berühren der Kante zu einem porösen Einweg-Wipe und legen Sie Zelle-Seite nach unten auf das Droplet Verstärkung.
  10. Legen Sie die Platte Deckel hält die Deckgläsern in eine feuchte Kammer und Inkubation über Nacht bei RT im Dunkeln.
  11. Die Deckgläsern, Brunnen wieder zurückkehren. Inkubieren Sie die Proben mit 5 X SSCT [5 x Natrium-Chlorid-Natrium-Citrat (SSC) 0,1 % Tween 20 durch einen 0,22 µm-Filter gefiltert] enthaltend 0,5 µg/mL DAPI für 1 h bei RT waschen die Proben zweimal mit 5 X SSCT bei RT
  12. Montieren Sie die Deckgläsern auf Objektträger. Analysieren Sie die Zellen und die Proben unter Verwendung einer invertierten Fluoreszenzmikroskop Bild.

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Representative Results

In diesem Manuskript beschriebene Protokoll erlaubt Isolierung von einer nahezu homogenen Bevölkerung von HDFs (Abbildung 1). Wie immunofluorescent Färbung zeigen, fast 100 % der menschlichen Haut Zellen isoliert verwenden, waren die in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen positiv gebeizt für dermalen Fibroblasten Marker Vimentin und Kollagen ich24, aber negativ für den menschlichen Vorhaut Keratinozyten Marker K14 (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt den Prozess der Generierung von MCPyV Virionen mit rekombinanten MCPyV Genom und ein Virion-Probe nach Ultrazentrifugen Konzentration. Nachdem die Band von MCPyV Virionen konzentriert sich auf den Kern des Verlaufs (markiert durch einen Pfeil in Abbildung 2B) zu visualisieren, wurden 500 µL Brüche gesammelt und MCPyV qPCR wurde durchgeführt, um die Gipfel-Fraktionen zu identifizieren. Ein Beispiel für die qPCR Analysedaten ist in Abbildung 2Cdargestellt. In einigen anderen Experimenten analysierte die Proben auch mit Western blotting mit einem Kaninchen-Anti-MCPyV VLP Antikörper (ergänzende Abbildung1). Abbildung 3 zeigt immunofluorescent gefärbten Bilder von HDFs mit MCPyV infiziert. Um positive Zellen manuell zu quantifizieren, zählten wir mindestens drei zufällige Ansichten von etwa 300 Zellen. Wir betrachten Zellen, die LT positive, VP1 positiv, oder LT sowohl VP1 positiv positiv für MCPyV-Infektion sind. In den Experimenten, die in Abbildung 3dargestellt über 30 % der Zellen sind LT positive und mehr als 10 % sind VP1 positiv. Die MCPyV Genome in infizierten Zellen repliziert wurden mit der HCR-DNA Fisch (Abb. 4A) und Immunofluorescent-HCR-DNA Fisch (Abbildung 4B) nachgewiesen. Während der HCR-DNA Fisch die Lokalisierung von MCPyV DNA vorhanden in der Replikation-Fabrik (Herde) in Abbildung 4Aoffenbart, die Immunofluorescent-HCR-DNA Fisch-Methoden ermöglicht simultane Detektion von MCPyV DNA und LT Protein Co Lokalisierung bei der Replikation Zentren (Abbildung 4B). Die Bilder vom Fisch immunofluorescent-HCR-DNA nachgewiesen, dass diese Technik verwendet werden könnte, um Co Lokalisierung der viralen DNA und dem damit verbundenen virale Protein zu offenbaren.

Figure 1
Abbildung 1 . Menschlichen dermalen Fibroblasten isoliert von Neugeborenen menschliche Vorhaut. Menschliche Haut Zellen kultiviert in DMEM/F12 Medium mit 10 % FBS waren voller Flecken, die mit Antikörpern gegen Vimentin, ergänzt Kollagen I oder Keratin 14 (K14). Die Zellen wurden auch mit DAPI counterstained. Bar, 50 µm. Diese Zahl wurde von Abbildung S2 von Liu Et Al., 201624angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Produktion von MCPyV Virion mit rekombinante virale Genom. (A) A Plasmid Karte von pR17b (MCPyV Genom Plasmid). (B) ein repräsentatives Bild einer MCPyV Virion Probe geerntet und gereinigt über einen Farbverlauf. Pfeil markiert die Band MCPyV Virionen konzentriert sich auf den Kern des Farbverlaufs. (C) das virale Genom Kopie Zahl in jeder Farbverlauf Bruchteil wurde quantifiziert mit qPCR. Kern Sie-gradient Brüche (Zahlen, beginnend mit der Spitze des Verlaufs, sind am unteren Rand der Grafik angegeben). Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von drei technischen Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Menschliche dermale Fibroblasten zu unterstützen, robuste MCPyV Infektion, Transkription und Replikation. Dermale Fibroblasten aus der menschlichen Haut isoliert wurden zwei Tage lang mit MCPyV Virionen in DMEM-F12 mittlere enthaltenden EGF, bFGF, CHIR99021 und Kollagenase IV behandelt. Nach dem Wechsel zu frischen DMEM/F12-Medium mit 20 % FBS für drei weitere Tage Zellen waren Immuno-gefärbten unter Verwendung der angegebenen Antikörper und counterstained mit DAPI. Viele Zellen nicht nur äußerten sich höchst LT und VP1, sondern zeigen auch robuste MCPyV Replikation Brennpunkte. Diese Zahl wurde von Abbildung 3 von Liu Et Al., 201624angepasst. Bar, 50 m. Skalieren Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Erkennung von MCPyV in infizierten Zellen mit Fisch Techniken. (A) menschlichen dermalen Zellen kultiviert in DMEM/F12 mit EGF, bFGF, CHIR99021 und Kollagenase Typ IV für 2 Tage mit MCPyV behandelt wurden. Nach dem Wechsel zu frischen DMEM/F12 mit FBS für 3 Tage, wurden die Zellen HCR-DNA FISH-Analyse unterzogen. Die Zellen wurden auch mit DAPI counterstained. (B) menschlichen dermale Zellen kultiviert in mittlerer enthaltenden EGF, bFGF, und CHIR99021 wurden entweder unbehandelt (Mock) oder MCPyV (infizierte) behandelt, wie in (A) beschrieben. Die Zellen einer ausgesetzt waren, Immuno-Fisch mit LT Antikörper und MCPyV-spezifische DNA-Sonden vor Gegenfärbung mit DAPI. HPV16 Sonden dienten als Negativkontrolle. Maßstabsleiste, 10 m. Diese Zahl wurde von Abbildung 4 von Liu Et Al., 201624angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Namen des Prüfpunkts Sequenzen
MCPyV Sonde 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV Sonde 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV Sonde 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV Sonde 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV Sonde 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV Sonde 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV Sonde 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV Sonde 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV Sonde 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV Sonde 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV-Fühler 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV-Sonde 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV-Sonde 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV-Sonde 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV-Sonde 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA Ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tabelle 1: Sonden in der Studie verwendet.

Supplemental Figure 1
Ergänzende Abbildung 1. Screening Iodixanol gradient Brüche für MCPyV VP1. MCPyV-infizierte Zellen wurden lysiert und Iodixanol gradient Fraktionierung. Kern Gradienten Brüche (Zahlen, beginnend mit der Unterseite des Farbverlaufs in diesem Experiment werden am oberen Rand der Abbildung angegeben) wurden Western-Blot Analyse VP1 erkennen unterzogen. 10 µL Proben der einzelnen Fraktionen wurden 1 x Last Farbstoff mit einem 5 % Endkonzentration von 2-Mercaptoethanol angepasst und kurz erhitzt bis 65 ° C. Die Proben wurden getrennt auf einem 4-12 % Bis-Tris-Gel und auf Nitrozellulose ausgelöscht. Westliche Beflecken wurde in TBST mit fettfreie Trockenmilch mit einem Kaninchen-Anti-MCPyV VLP Antiserum verdünnt 1: 5.000 durchgeführt. Das Antiserum ist auf Anfrage erhältlich. Die 50 kDa standard (das ist ähnlich zu den 47 kDa MCPyV VP1 Monomer wandert) ist mit einem Sternchen gekennzeichnet. In das angezeigte Bild Probenreduzierung war unvollständig und Disulfid-linked VP1 Multimere sind offensichtlich. Verwendung von Dithiothreitol und/oder höhere Denaturierung Temperaturen führt zu mehr vollständige Reduktion der VP1-Monomer-Arten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die Methoden, die oben beschrieben, inklusive Isolation der dermalen Fibroblasten aus menschlicher Hautgewebe, Vorbereitung der rekombinanten MCPyV Virionen, Infektion des kultivierten Zellen, immunofluorescent Färbung und eine empfindliche Fische Methode adaptiert von HCR-Technologie, die sollten Forscher MCPyV Infektion27analysieren können. Einer der kritischsten Schritte zur Erreichung MCPyV Infektion in-vitro-ist die Herstellung von hoch-Titer Virion Zubereitungen. Unter Verwendung des Protokolls für die Zubereitung von rekombinanten MCPyV Virionen, die hier beschriebenen, erreichen wir eine virale Titer von 1012 -Genom-Kopien pro mL Idoxanol Lösungsmittel11,12. Diese hohe Titer MCPyV Präparate erlaubt uns HDFs so weit als nur primäre Haut Zelltyp zu identifizieren, die angezeigt wird, die volle MCPyV Infektion unterstützen Zyklus24.

Isolieren von frischen menschlichen dermalen Fibroblasten über das Protokoll in diesem Manuskript beschrieben hat uns zu kontrollieren die Qualität der verwendeten MCPyV Infektion Zellen experimentieren und Sicherstellung der Konsistenz der Ergebnisse über Zellen isoliert von anderen Patientenproben ermöglicht. Alle menschliche dermale Fibroblasten isoliert von Neugeborenen Haut sollte auf Vorhandensein von MCPyV DNA qPCR zu gewährleisten ohne MCPyV Infektion vor der Behandlung mit rekombinanten MCPyV Virionen beurteilt. Um die maximale MCPyV Infektion Effizienz zu erzielen, ist es wichtig mit menschlichen dermalen Fibroblasten frisch von Neugeborenen menschliche Vorhaut isoliert, da höhere Durchgang Fibroblasten niedriger MCPyV Infektion Effizienz unterstützen. Darüber hinaus unterstützt, wenn parallel von Erwachsenen Hautproben isoliert, Fibroblasten von Neugeborenen Hautproben viel höhere MCPyV Infektion Effizienz24. Wir haben nie alle im Handel erhältlichen Zellen für MCPyV-Infektion getestet. Jedoch sehen wir keinen besonderen Grund, die kommerziell Fibroblasten isoliert als minderwertig sein sollte, sind höhere Durchgang zum Zeitpunkt einfrieren.

Wir haben auch das Protokoll hier beschriebenen dermale Fibroblasten von anderen Tieren isoliert verwendet. Zum Beispiel haben wir das Protokoll verwendet, um erfolgreich dermale Fibroblasten aus Ratte (Rattus Norvegicus), Maus (Mus Musculus), Baum-Spitzmaus (Modellorganismus Belangeri) und Rhesus-Makaken (Macaca Mulatta)25isolieren. Wie in den menschlichen Zellen beobachtet, erlaubt Fibroblasten isoliert vom jungen Schimpansen viel effizienter MCPyV Infektion im Vergleich zu den älteren Tiere25.

Im Vergleich zu traditionellen Fisch, ist HCR-DNA Fisch ein einfaches, aber sehr empfindliche Methode zum Nachweis von viraler Genome24,27. Zentren der MCPyV Replikation können ohne weiteres als hochspezifische punktförmige Herde, mit wenig bis kein Hintergrundsignal erkannt in den gleichen Proben mit einer HPV-Sonde (Abbildung 4)24behandelt in den Kernen der infizierten Zellen erkannt werden. In Zukunft könnte der Ansatz daher geprüft werden, um niedrig-Fülle MCPyV DNA in infizierten menschlichen Haut zu erkennen. Es könnte auch andere DNA-Viren überwachen angepasst werden. In Kombination mit immunofluorescent Färbung bietet die Immuno-Fische eine leistungsfähige Methode zur Erkennung von gleichzeitig virale DNA und virale codierte Protein oder Host-Proteine in den gleichen Zellen (Abbildung 4). Für optimale Ergebnisse mit den Protokollen beschrieben hier, empfiehlt es sich, frisch feste Proben zum immunofluorescent Beizen und HCR-DNA FISH-Analyse verwenden. Die HCR-DNA FISH-Analyse sollten die Sonden und Verstärker bei-80 ° C in kleinen Aliquote, vermeiden wiederholtes Einfrieren und Auftauen aufbewahrt werden.

Mit dem HDF Zellkultur und MCPyV Infektion Protokoll, erkundeten wir die Zelle Wachstumsbedingungen, die am besten MCPyV Eintrag, Transkription und Replikation in HDFs unterstützen. Wir entdeckten, dass die Behandlung des HDFs mit Wachstumsfaktoren, wie z. B. EGF, bFGF und Stimulation der WNT-Signalweg deutlich MCPyV Infektion fördern. Gene Expression profiling zeigt, dass mehrere Gene an der Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Familie, einschließlich MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 und 13, nach Stimulation mit diesen Wachstumsfaktoren und Aktivierung der WNT Signalweg, robust induziert wurden. Weil diese MMP Enzyme erniedrigende extrazelluläre Matrixproteine fähig sind, Grund haben wir, dass sie MCPyV Infektion durch Unterbrechung der extrazellulären Matrix der Wirtszellen stimulieren können. In der Tat, Behandlung von HDFs mit Kollagenase Typ IV, ein Mitglied der Familie MMP robust stimuliert MCPyV Infektion (Abbildung 3)24. Wir sehen auch eine Reihe von Verbindungen, darunter mehrere FDA-zugelassene Kinase-Inhibitoren für die hemmende Wirkung auf MCPyV Infektion. Wir entdeckten, dass Trametinib ein MEK1 und MEK2-Hemmer, dramatisch hemmt MCPyV Infektion24. Andere können verwenden oder ändern diese Infektion-System als eine Droge-Discovery-Plattform für MCPyV-Hemmer, die die MCPyV-Viruslast bei immungeschwächten Patienten zu reduzieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen bieten diese Protokolle für hocheffiziente MCPyV Infektion zu erreichen, eine Plattform, die schlecht aufzuklären ansteckenden Zyklus MCPyV und MCPyV-induzierten Onkogene Mechanismen im Rahmen einer Virusinfektion verstanden. Dieser Satz von Protokollen könnte in zukünftigen Studien zu erkunden, zusätzliche MCPyV-permissive menschlichen Zelltypen und den ursprünglichen Zellen von MCC, in welche Nebenkosten MCPyV Infektion zu Tumorentstehung führen könnte angewendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institut) und Dr. M. Celeste Simon (Universität von Pennsylvania) Danke für die Reagenzien und technische Unterstützung. Wir danken auch die Mitgliedern unserer Labore für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health (NIH) Stipendien (R01CA187718, R01CA148768 und R01CA142723), das NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) und dem Penn CFAR Award (P30 AI 045008) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

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Dermalen Fibroblasten Infektion Immunologie und Infektion Ausgabe 144 Merkel Zelle Polyomavirus Isolation Kollagenase IV CHIR99021 immunofluorescent Färbung Fluoreszenz in Situ Hybridisierung in-situ DNA-Hybridisierung Kettenreaktion Transkription Replikation
Merkel-Zell-Polyomavirus Infektion und Erkennung
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Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

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