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Immunology and Infection

मार्केल सेल Polyomavirus संक्रमण और पता लगाने

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम MCPyV के साथ प्राथमिक मानव चमड़े का fibroblast संक्रमित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रोटोकॉल चमड़े का fibroblasts का अलगाव, MCPyV virions, वायरस संक्रमण, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, और सीटू प्रतिदीप्ति में संकरण की तैयारी भी शामिल है । इस प्रोटोकॉल निस्र्पक MCPyV के लिए बढ़ाया जा सकता है-मेजबान बातचीत और अंय कोशिका MCPyV द्वारा संक्रमित प्रकार की खोज ।

Abstract

मार्केल सेल polyomavirus (MCPyV) संक्रमण मार्केल सेल कार्सिनोमा (एमसीसी), त्वचा कैंसर का एक अत्यधिक आक्रामक रूप के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यंत्रवत अध्ययन पूरी तरह से MCPyV आणविक जीव विज्ञान और oncogenic तंत्र की जांच करने के लिए पर्याप्त सेल संस्कृति मॉडल की कमी से प्रभावित किया गया है । यहां, हम प्रदर्शन और प्राथमिक मानव त्वचा कोशिकाओं के MCPyV संक्रमण का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का एक सेट का वर्णन । प्रोटोकॉल मानव चमड़े का fibroblasts के अलगाव का वर्णन, रिकॉमबिनेंट MCPyV virions की तैयारी, और दोनों immunofluorescent द्वारा वायरस के संक्रमण का पता लगाने (यदि) धुंधला और सीटू डीएनए में-संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया (HCR) है, जो एक अति संवेदनशील है प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (मछली) का रुख किया । प्रोटोकॉल के लिए इच्छुक शोधकर्ताओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है अंय प्रकार के सेल या सेल लाइनों कि MCPyV संक्रमण का समर्थन की पहचान । वर्णित मछली दृष्टिकोण भी संक्रमित मानव त्वचा में मौजूद वायरल DNAs के कम स्तर का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

मार्केल सेल polyomavirus (MCPyV) एक छोटा सा, डबल-फंसे डीएनए वायरस है कि एक दुर्लभ लेकिन आक्रामक त्वचा कैंसर के साथ जुड़ा हुआ है, मार्केल सेल कार्सिनोमा (एमसीसी)1,2। एमसीसी की मृत्यु दर ३३% के आसपास, से अधिक है कि मेलेनोमा3,4की । MCPyV के एक परिपत्र जीनोम है ~ 5 केबी1,5 bisected द्वारा एक गैर कोडिंग विनियामक क्षेत्र (NCRR) जल्दी और देर से कोडिंग क्षेत्रों में1। NCRR वायरल प्रतिकृति के मूल (ओरि) और वायरल प्रतिलेखन6,7के लिए द्वि-दिशा प्रवर्तक शामिल हैं । प्रारंभिक क्षेत्र encodes ट्यूमर प्रतिजन प्रोटीन बड़े टी (लेफ्टिनेंट), छोटे टी (sT), 57kT, वैकल्पिक लेफ्टिनेंट ओआरएफ (ALTO), साथ ही साथ एक नियामक miRNA1,8,9,10बुलाया । देर क्षेत्र कैप्सिड प्रोटीन VP1 और VP211,12,13encodes । लेफ्टिनेंट और सेंट सबसे अच्छा अध्ययन MCPyV प्रोटीन है और वायरल डीएनए प्रतिकृति और MCPyV प्रेरित tumorigenesis5का समर्थन करने के लिए दिखाया गया है । मेजबान जीनोम, जो एमसीसीएस के ८०% तक में मनाया गया है में MCPyV डीएनए के क्लोनिंग एकीकरण की संभावना वायरस के लिए एक कारण कारक है-सकारात्मक ट्यूमर विकास14,15।

एमसीसी की घटना पिछले बीस साल16से अधिक तीन गुना है । स्पर्शोन्मुख MCPyV संक्रमण सामान्य जनसंख्या17,18,19में भी व्यापक है । एमसीसी निदान और MCPyV संक्रमण के उच्च व्यापकता की बढ़ती संख्या के साथ, वहां एक के लिए वायरस और उसके oncogenic क्षमता की हमारी समझ में सुधार की जरूरत है । हालांकि, MCPyV जीव विज्ञान और oncogenic तंत्र के कई पहलुओं खराब समझ20रहते हैं । यह काफी हद तक है क्योंकि MCPyV की स्थापना की सेल लाइनों में खराब दोहराने11,12,21,22,23 और, हाल ही में जब तक, त्वचा कोशिकाओं MCPyV समर्थन करने में सक्षम संक्रमण22की खोज नहीं हुई थी । यंत्रवत अध्ययन पूरी तरह से जांच करने के लिए MCPyV और मेजबान कोशिकाओं के साथ अपनी बातचीत5वायरस प्रचार के लिए सेल संस्कृति प्रणाली की कमी से प्रभावित किया गया है ।

हमें पता चला कि प्राथमिक मानव चमड़े का fibroblasts (HDFs) नवजात मानव चमड़ी से अलग दोनों इन विट्रो और पूर्व vivo24में मजबूत MCPyV संक्रमण का समर्थन । इस अध्ययन से, हम MCPyV24के लिए पहली सेल संस्कृति संक्रमण मॉडल की स्थापना की । इस मॉडल प्रणाली पर निर्माण, हमें पता चला है कि WNT/β-catenin संकेतन मार्ग और अन्य विकास कारकों द्वारा मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) जीन की प्रेरण MCPyV संक्रमण को उत्तेजित करता है । इसके अलावा, हमने पाया है कि एफडीए-खल्क विरोधी trametinib को मंजूरी दी प्रभावी ढंग से MCPyV5,25संक्रमण को रोकता है । इन अध्ययनों से, हम भी मानव चमड़े का fibroblasts24,25, MCPyV virions11,12की तैयारी, मानव अधययन पर MCPyV संक्रमण प्रदर्शन को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल का एक सेट की स्थापना की fibroblasts 24 , 25 और अगर दाग26से MCPyV प्रोटीन का पता लगाने । इसके अलावा, हम में सीटू डीएनए संकरण चेन रिएक्शन (HCR) प्रौद्योगिकी27 संक्रमित मानव त्वचा कोशिकाओं में MCPyV डीएनए का पता लगाने के लिए एक अति संवेदनशील मछली तकनीक (HCR-डीएनए मछली) विकसित करने के लिए अनुकूलित । इन नए तरीकों MCPyV के संक्रामक चक्र के साथ ही सेलुलर प्रतिक्रिया MCPyV संक्रमण के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा । प्राकृतिक मेजबान जलाशय कोशिकाओं है कि MCPyV संक्रमण और कोशिकाओं है कि एमसीसी ट्यूमर को जंम दे बनाए रखने के अज्ञात रहते हैं । तकनीक हम इस पांडुलिपि में वर्णन करने के लिए मानव कोशिकाओं के विभिंन प्रकार की जांच के लिए दोनों जलाशय कोशिकाओं और एमसीसी ट्यूमर के मूल की पहचान लागू किया जा सकता है । हमारे ऐसे HCR-डीएनए मछली के रूप में स्थापित तरीकों, भी अंय डीएनए ट्यूमर वायरस का पता लगाने में नियोजित किया जा सकता है और मेजबान सेल बातचीत के लक्षण वर्णन ।

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Protocol

मानव नवजात चमड़ी पेन त्वचा रोग अनुसंधान केंद्र से प्राप्त किया गया । वयस्क मानव fibroblasts सर्जरी के बाद सामांय त्वचा त्याग से प्राप्त किए गए । सभी प्रोटोकॉल पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. मानव अधययन fibroblasts का अलगाव

  1. मानव नवजात चमड़ी से वसा और चमड़े के नीचे ऊतक ट्रिम और आधा या तिमाहियों में त्वचा के नमूने में कटौती करने के लिए कैंची की एक जोड़ी का प्रयोग करें ।
  2. रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबायोटिक-antimycotic के साथ पूरक पंजाब में 10 मिलीग्राम/एमएल dispase द्वितीय के 5 मिलीलीटर में ऊतक की मशीन ।
  3. एक बाँझ 10 सेमी डिश में, ध्यान से एपिडर्मिस microdissection संदंश का उपयोग कर चमड़े की परतों से अलग ।
  4. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए परिणामी चमड़े के ऊतकों स्थानांतरण FBS-फ्री मध्यम एंटीबायोटिक antimycotic के साथ पूरक में 2 मिलीग्राम/एमएल collagenase प्रकार चतुर्थ के 5 मिलीलीटर ।
  5. ३७ ° c में 5% सह2 में नमूना मशीन आवधिक झटकों के साथ 4-6 एच के लिए बस कुछ ही macroscopic ऊतक समुच्चय रहते हैं ।
  6. pipetting ऊपर और नीचे (triturating) जोरदार एक 10 मिलीलीटर पिपेट के साथ दस बार द्वारा dermis से एकल कोशिकाओं को रिलीज ।
  7. 5 मिनट के लिए १८० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें ।
  8. प्लेट DMEM मध्यम में असंबद्ध कोशिकाओं 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक, और 1% L-glutamine में ३७ ° c 5% CO2में ।

२. रिकॉमबिनेंट MCPyV विरिअन तयारी

  1. डाइजेस्ट ५० pR17b प्लाज्मिड के µ जी (MCPyV जीनोम ले) के २५० यू के साथ BamHI-HF एक २०० µ एल मात्रा में (4 ज ३७ डिग्री सेल्सियस पर) के लिए वेक्टर रीढ़ (चित्रा 2) से वायरल जीनोम अलग ।
  2. जोड़ें १२०० µ बफर पंजाब के एल (10 µ एल के साथ पूरक 3 एम NaAc, पीएच ५.२) के लिए पचा डीएनए और शुद्ध पर 2 miniprep स्पिन कॉलम (20 µ जी डीएनए क्षमता). Elute के २०० µ l के साथ प्रत्येक कॉलम से पच pR17b प्लाज्मिड को बफर (10 एमएम Tris-एचसीएल, पीएच 8.0, 1 एमएम EDTA) के रूप में ।
  3. एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में बंधाव प्रतिक्रिया तैयार करें । जोड़ें ४०० µ शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए के l से कदम २.२, ८.६ मिलीलीटर की 1.05 x टी-4 ligase बफर और 6 µ एल के उच्च एकाग्रता टी-4 ligase. रात भर 16 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  4. बफर पंजाब के ४५ मिलीलीटर जोड़ें (3 एम NaAc के 10 µ एल के साथ पूरक, पीएच ५.२) बंधाव के लिए और एक निर्वात कई गुना का उपयोग करने के लिए 2 miniprep स्पिन कॉलम के माध्यम से लोड । Elute प्रत्येक कॉलम के साथ ५० µ l ते बफर. डीएनए के बारे में 30 µ जी की एक उपज की उम्मीद है ।
  5. देर से दोपहर/शाम, बीज 6 x 106 293TT28 कोशिकाओं में एक 10 सेमी DMEM मध्यम युक्त 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड, और 1% L-glutamine बिना hygromycin बी के साथ पूरक डिश में
  6. अगली सुबह, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं के बारे में ५०% धाराप्रवाह हैं । Transfect का प्रयोग ६६ µ l का अभिकर्मक रिएजेंट (१.१ µ l/cm2), 12 µ g के री-ligated MCPyV से अलग R17b DNA से step २.४, ८.४ µ g क ऑफ एसटी एक्सप्रेशन प्लाज्मिड pMtB और ९.६ µ g ऑफ लेफ्टिनेंट एक्सप्रेशन प्लाज्मिड pADL *29.
  7. जब transfected कोशिकाओं लगभग धाराप्रवाह हैं, अगले दिन, कोशिकाओं trypsinize और उंहें जारी विस्तार के लिए एक 15 सेमी डिश के लिए स्थानांतरण ।
  8. वैकल्पिक रूप से विस्तार पर 293TT कोशिकाओं की एक छोटी संख्या लेने के लिए और अगर MCPyV लेफ्टिनेंट (CM2B4) और VP1 (MCV VP1 खरगोश30) के लिए धुंधला अभिकर्मक दक्षता निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन करते हैं । इस स्तर पर, परमाणु एलटी संकेत दिखाई जा सकता है लेकिन VP1 अभिव्यक्ति शायद पता लगाने के लिए नहीं होगा ।
  9. जब 15 सेमी डिश लगभग (आमतौर पर 5-6 दिन प्रारंभिक अभिकर्मक के बाद) धाराप्रवाह हो जाता है, ३ १५ सेमी व्यंजन में कोशिकाओं हस्तांतरण । फसल 15 मुख्यमंत्री व्यंजन से कोशिकाओं जब वे लगभग धाराप्रवाह हो और नीचे वायरस फसल प्रोटोकॉल का पालन करें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से चरण २.८ में वर्णित के रूप में गुणवत्ता नियंत्रण निष्पादित करें । इस अवस्था में अधिकांश कोशिकाएं MCPyV एलटी और VP1 पॉजिटिव दोनों होनी चाहिए ।
  10. फसल के लिए वायरस, trypsinize कोशिकाओं, 5 मिनट के लिए आरटी पर १८० x जी में स्पिन और supernatant को हटा दें । DPBS-Mg (९.५ mM MgCl2 और 1x एंटीबायोटिक-antimycotic के साथ DPBS) के एक सेल गोली की मात्रा जोड़ें । उसके बाद 25 मिमी अमोनियम सल्फेट जोड़ें (एक 1 एम पीएच 9 स्टॉक समाधान से) ०.५% ट्राइटन एक्स-१०० (एक 10% शेयर समाधान से), ०.१% Benzonase और एक एटीपी-निर्भर DNase के ०.१% द्वारा पीछा किया । अच्छी तरह से मिश्रण और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
  11. बर्फ पर 15 मिनट के लिए मिश्रण गर्मी और फिर 5M NaCl की ०.१७ मात्रा जोड़ें । मिश्रण और एक और 15 मिनट के लिए एक 4 ° c में १२,००० x g पर 10 मिनट के लिए स्पिन के लिए बर्फ पर मशीन केंद्रापसारक । यदि supernatant स्पष्ट नहीं है, धीरे ट्यूब उलटा और कताई कदम दोहराने । supernatant एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  12. ०.८ मीटर NaCl के साथ पूरक DPBS की एक मात्रा का उपयोग कर गोली resuspend, और २.११ चरण में वर्णित के रूप में फिर से स्पिन,.
  13. supernatants चरण २.११ और २.१२ से संयोजित करें, और चरण २.११ में वर्णित के रूप में एक अधिक समय स्पिन ।
  14. iodixanol की ढाल पतली दीवार में डालना 5 मिलीलीटर polyallomer ट्यूबों बिछाने (27%, तो ३३%, तो ३९%) ~ ०.७ मिलीलीटर एक 3 मिलीलीटर एक लंबी सुई या एक p1000 पिपेट के साथ लगे सिरिंज का उपयोग कर कदम ।
  15. तैयार iodixanol ढाल पर स्पष्ट वायरस युक्त supernatant के 3 मिलीलीटर लोड ।
  16. एक SW55ti रोटर में २३४,००० x g और 16 डिग्री सेल्सियस पर ३.५ ज के लिए स्पिन । त्वरण और मंदी को धीमी गति से सेट करें ।
  17. ultracentrifugation के बाद, सिलिकन ट्यूब में 12 भागों इकट्ठा (प्रत्येक अंश ~ ४०० µ एल है) ।
  18. dsDNA रिएजेंट और/या VP1 (MCV VP1 खरगोश30) के लिए पश्चिमी दाग द्वारा वायरस की उपस्थिति के लिए अंशों का विश्लेषण । पूल ढाल भागों पीक dsDNA और/या VP1 सामग्री के साथ और मात्रात्मक पीसीआर द्वारा शेयर विशेषताएं वायरल जीनोम के बराबर31की गणना । -८० ° c पर स्टोर MCPyV विरिअन शेयर ।

3. संक्रमण

  1. 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड और 1% L-glutamine के साथ DMEM में प्राथमिक मानव चमड़े का fibroblasts बनाए रखें । संगम तक पहुंचने पर, भाजित fibroblasts 1:4 नीचे कताई के बिना ।
    नोट: उच्चतम MCPyV संक्रमण दक्षता के लिए, मार्ग 5 और 12 के बीच प्राथमिक fibroblasts का उपयोग करें जो चढ़ाना के समय सक्रिय रूप से विभाजित हैं ।
  2. मानव अधययन fibroblasts को संक्रमित करने के लिए, मध्यम महाप्राण और कोशिकाओं को DPBS से धो लें ।
  3. डिश के लिए ०.०५% Trypsin-EDTA की 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  4. माइक्रोस्कोप के तहत जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं बंद पकवान आ रहे हैं ।
  5. 20 एनजी/एमएल EGF, 20 एनजी/एमएल bFGF और 3 µ एम CHIR99021, जिनमें से सभी MCPyV संक्रमण24को उत्तेजित करने के लिए, डिश के लिए और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल समाधान हस्तांतरण युक्त 10 मिलीलीटर DMEM/
  6. 2 मिनट के लिए १८० x g पर कक्षों को स्पिन करें, और supernatant को छोड़ें । DMEM/F12 मध्यम में 20 एनजी/एमएल EGF, 20 एनजी/एमएल bFGF और 3 µ एम CHIR99021 में 2-4 x 104 प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं में कोशिकाओं resuspend ।
  7. बीज २०० µ l एक ९६-well थाली के प्रत्येक कुआं में 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase प्रकार IV के साथ पूरक है । गल MCPyV बर्फ पर विरिअन स्टॉक । MCPyV virions के 109 वायरल जीनोम समकक्ष जोड़ें (चरण २.१८ में गणना) प्रत्येक २,५०० के लिए ५००० कोशिकाओं के लिए iodixanol के 1 µ एल प्रति संक्रमित होने के लिए ।   थाली की ओर धीरे से ठोकर और मशीन में थाली जगह है ।
  8. ३७ ° c में 5% CO2 में 48-72 h के लिए मशीनीकरण के बाद, एक अच्छी तरह से 20% FBS जोड़ें ।
  9. संक्रमण की अनुमति दें ३७ ° c में 5% CO2 में 72-96 h के लिए आगे बढ़ना करने के लिए ।

4. Immunofluorescent धुंधलाना

  1. 20 मिनट के लिए पंजाब में 3% paraformaldehyde के साथ चरण ३.९ में प्राप्त फिक्स कोशिकाओं ।
  2. पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं ।
  3. permeabilization बफर (०.५% ट्राइटन X-१००, 3% BSA में ०.२२ µm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर) 1 एच के लिए आरटी में कोशिकाओं में मशीन ।
  4. निंनलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ गर्मी कोशिकाओं: माउस मोनोक्लोनल विरोधी MCPyV लेफ्टिनेंट (CM2B4) (1:1000) और खरगोश polyclonal विरोधी MCPyV VP1 एंटीबॉडी (1:2000), आरटी में 3 एच के लिए ।
  5. तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी: Fluor ५९४ बकरी विरोधी माउस आईजीजी (1:1000) और Fluor ४८८ बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (1:500) के लिए आरटी पर 1 ज के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
  7. तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  8. Counterstain के साथ कोशिकाओं को ०.५ µ g/mL DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride).
  9. कांच स्लाइड पर coverslips माउंट और एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर विश्लेषण ।

5. सीटू डीएनए में-HCR

नोट: इस तकनीक की आवश्यकता है कि कोशिकाओं coverslips पर वरीयता प्राप्त है । इस प्रयोजन के लिए, संक्रमण की स्थिति (चरण 3) ऊपर वर्णित 24-well प्लेट स्वरूप के लिए स्केल किया जा सकता है ।

  1. फिक्स सेल coverslips पर प्रसंस्कृत पंजाब में 4% पीएफए के साथ 10 मिनट के लिए coverslips को दो बार पंजाबियों के साथ धो लें, तो उंहें ७०% इथेनॉल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं permeabilize के साथ इलाज ।
    नोट: फिक्स्ड नमूने कई दिनों के लिए इस स्थिति में रह सकते हैं ।
  2. जांच संकरण बफर और आरटी पर ६० मिनट के लिए मशीन के साथ इथेनॉल की जगह से पूर्व संकरण नमूने ।
  3. जांच (ओं) को पतला (1 µ m) (तालिका 1) 1:500 कमजोर पड़ने पर जांच संकरण बफर समाधान में 30 मिनट पूर्व संकरण कदम के अंत से पहले और ४५ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  4. इस मशीन के अंत में, पिपेट ~ पतला जांच मिश्रण के 10 μL माइक्रोस्कोप स्लाइड पर coverslip प्रति । coverslips, सेल साइड नीचे, संकरण जांच मिश्रण के उनके संबंधित बूंदों पर रखें । रबर सीमेंट की एक उदार राशि के साथ स्लाइड करने के लिए coverslips के किनारों और पीठ सील ।
  5. हीट ब्लॉक के समतल ओर स्लाइड्स सेट करके 3 मिनट के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस पर जोड़े गए जांचों के साथ स्लाइड को गर्म करे । एक humidified कक्ष के लिए स्लाइड स्थानांतरण और ४५ डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन । एक सरल humidified कक्ष बनाने के लिए, हल्के से डीएच2हे और एक प्लास्टिक कंटेनर के तल में जगह है कि एक रबर गैसकेट के साथ जवानों के साथ बाँझ कागज तौलिए घटा ।
    नोट: हीटिंग के दौरान रबर सीमेंट संक्षेप में बुलबुला कर सकते हैं । हालांकि, यह सुनिश्चित करें कि सील टूट नहीं है ।
  6. ध्यान से संदंश के साथ रबर सीमेंट दूर छील और coverslips सेल एक 24-अच्छी तरह से थाली के कुओं में वापस पक्ष जगह है । RT पर तीन बार जांच वॉश बफर के साथ coverslips धो लें ।
  7. coverslip परिवर्धन बफर में (२०० µ एल में 24-अच्छी तरह से प्लेटें) आरटी 30-60 मिनट में ।
  8. इस बीच, दो में से प्रत्येक ऐनी oligonucleotide hairpins को पहचानने की जांच (तालिका 1) अलग पीसीआर ट्यूबों में हीटिंग द्वारा ९४ ° c के लिए ९० एस और 30 मिनट के लिए आर टी के लिए ठंडा जबकि प्रकाश से रक्षा । 1:50 के एक कमजोर पड़ने पर प्रवर्धन बफर में दो hairpins, प्रत्येक मिश्रण ।
  9. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन के खुले चेहरे पर तेल फिल्म खींच द्वारा प्रवर्धन प्रतिक्रिया के लिए एक सतह बनाओ । पिपेट 50-100 µ एल की बूंदों hairpin/प्रवर्धन बफर मिश्रण के प्रत्येक coverslip के लिए आयल फिल्म पर । पूर्व प्रवर्धन समाधान से coverslips को सावधानीपूर्वक निकालने के लिए संदंश का उपयोग करें । एक छिद्रित डिस्पोजेबल पोंछ करने के लिए किनारे को छूने से coverslip सूखी, और प्रवर्धन छोटी बूंद पर सेल साइड नीचे जगह है ।
  10. एक humidified कक्ष में coverslips जोत प्लेट ढक्कन प्लेस और अंधेरे में आरटी पर रात भर गर्मी ।
  11. एक बार और कुओं के लिए coverslips लौटें । 5x SSCT के साथ नमूनों की मशीन [5x सोडियम क्लोराइड सोडियम साइट्रेट (एसएससी) ०.१% के बीच 20 एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर] युक्त ०.५ µ g/एमएल DAPI के लिए 1 ज पर आरटी । नमूनों को दो बार rt पर 5x SSCT से धोएं ।
  12. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर coverslips माउंट । कोशिकाओं और एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नमूनों की छवि का विश्लेषण.

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Representative Results

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल HDFs की एक लगभग समरूप आबादी के अलगाव की अनुमति दी (चित्रा 1) । के रूप में immunofluorescent धुंधला द्वारा प्रदर्शन किया, मानव चमड़े का लगभग १००% कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल में वर्णित शर्तों का उपयोग पृथक से सकारात्मक चमड़े fibroblast मार्करों, vimentin के लिए दाग थे, और कोलेजन मैं24, लेकिन मानव के लिए नकारात्मक चमड़ी keratinocyte मार्कर K14 (चित्रा १). चित्रा 2 विरिअन एकाग्रता के बाद रिकॉमबिनेंट MCPyV जीनोम और एक ultracentrifuge नमूना का उपयोग कर MCPyV virions पैदा करने की प्रक्रिया से पता चलता है । ( चित्रा 2खमें एक तीर से चिह्नित) ढाल के मुख्य में केंद्रित MCPyV virions के बैंड visualizing के बाद, ५०० µ एल अंश एकत्र किए गए थे और MCPyV qPCR चोटी भागों की पहचान करने के लिए प्रदर्शन किया गया था । qPCR विश्लेषण डेटा का एक उदाहरण चित्रा 2Cमें दिखाया गया है । कुछ अन्य प्रयोगों में नमूनों को एक खरगोश-रोधी MCPyV VLP एंटीबॉडी (पूरक चित्रा १) का प्रयोग करते हुए पाश्चात्य सोख्ता के साथ भी विश्लेषण किया गया. चित्रा 3 MCPyV से संक्रमित HDFs के immunofluorescent दाग छवियों से पता चलता है । मैंयुअल रूप से सकारात्मक कोशिकाओं को बढ़ाता है, हम के बारे में ३०० कोशिकाओं के कम से तीन यादृच्छिक विचार गिना । हम उन कोशिकाओं पर विचार करते हैं जो हलका पॉजिटिव, VP1 पॉजिटिव, या दोनों हलका और VP1 पॉजिटिव हो MCPyV इंफेक्शन के लिए पॉजिटिव हो । चित्रा 3में दिखाए गए प्रयोगों में, 30% से अधिक कोशिकाओं के एलटी सकारात्मक हैं और 10% से अधिक VP1 सकारात्मक हैं. संक्रमित कोशिकाओं में प्रतिकृति MCPyV जीनोम दोनों HCR-डीएनए मछली (चित्रा 4ए) और Immunofluorescent-HCR-डीएनए मछली (चित्रा 4बी) का उपयोग कर पाया गया । जबकि HCR-डीएनए मछली MCPyV डीएनए के स्थानीयकरण का पता चलता है प्रतिकृति फैक्टरी में मौजूद (घावों) चित्रा 4एमें, Immunofluorescent-HCR-डीएनए मछली तरीकों दोनों MCPyV डीएनए और लेफ्टिनेंट प्रोटीन का एक साथ पता लगाने की अनुमति देता है सह स्थानीयकरण प्रतिकृति केन्द्रों पर (चित्रा 4B). immunofluorescent से छवियां-HCR-डीएनए मछली का प्रदर्शन किया है कि इस तकनीक को वायरल डीएनए और जुड़े वायरल प्रोटीन के सह स्थानीयकरण प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 . मानव चमड़े का fibroblasts नवजात मानव चमड़ी से पृथक । मानव चमड़े का DMEM/F12 माध्यम में प्रसंस्कृत कोशिकाओं 10% FBS के साथ पूरक vimentin, कोलेजन मैं, या केरातिन 14 (K14) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग दाग थे । कोशिकाएँ भी DAPI से counterstained थीं. बार, ५० µm । यह आंकड़ा लियू एट अल., २०१६24के चित्रा S2 से अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . रिकॉमबिनेंट वायरल जीनोम का उपयोग कर MCPyV विरिअन का उत्पादन । (क) pR17b (MCPyV जीनोम प्लाज्मिड) का एक प्लाज्मिड नक्शा. (ख) एक MCPyV विरिअन नमूना काटा और एक ढाल पर शुद्ध की एक प्रतिनिधि तस्वीर । तीर ढाल के कोर में केंद्रित MCPyV virions के बैंड के निशान । (ग) प्रत्येक ढाल अंश में वायरल जीनोम प्रति संख्या qPCR का उपयोग quantified था. कोर ढाल अंशों (संख्या, ढाल के ऊपर से गिनती, ग्राफ के तल पर संकेत कर रहे हैं) । त्रुटि पट्टियों तीन तकनीकी दोहराता का मतलब (S.E.M.) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . मानव चमड़े का fibroblasts मजबूत MCPyV संक्रमण, प्रतिलेखन, और प्रतिकृति समर्थन करते हैं । अधययन fibroblasts मानव त्वचा से अलग EGF, bFGF, CHIR99021, और दो दिनों के लिए collagenase चतुर्थ युक्त DMEM F12 मध्यम में MCPyV virions के साथ इलाज किया गया । तीन और दिनों के लिए 20% FBS युक्त ताजा DMEM/F12 मध्यम को बदलने के बाद, कोशिकाओं इंयूनो-संकेत एंटीबॉडी और DAPI के साथ counterstained का उपयोग दाग थे । कोशिकाओं के कई न केवल उच्च व्यक्त किया है और VP1 लेकिन यह भी मजबूत MCPyV प्रतिकृति घावों दिखा । यह आंकड़ा लियू एट अल., २०१६24के चित्रा 3 से अनुकूलित किया गया था । स्केल बार, ५० m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 . मछली तकनीक का उपयोग कर संक्रमित कोशिकाओं में MCPyV का पता लगाना । (क) DMEM/F12 युक्त EGF, bFGF, CHIR99021, और collagenase प्रकार IV में प्रसंस्कृत मानव चमड़े की कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए MCPyV के साथ इलाज किया गया । 3 और दिनों के लिए FBS युक्त ताजा DMEM/F12 को बदलने के बाद, कोशिकाओं HCR-डीएनए मछली विश्लेषण के अधीन थे । कोशिकाएँ भी DAPI से counterstained थीं. (ख) मानव चमड़े का EGF, bFGF, और CHIR99021 युक्त माध्यम में प्रसंस्कृत कोशिकाओं या तो अनुपचारित (नकली) या इलाज किया गया (संक्रमित) के रूप में MCPyV के साथ (एक) में वर्णित है । कोशिकाओं के अधीन थे इंयूनो-मछली का उपयोग एलटी एंटीबॉडी और MCPyV-विशिष्ट डीएनए जांच के साथ counterstaining से पहले DAPI । HPV16 जांच एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । स्केल बार, 10 मी. यह आंकड़ा लियू एट अल., २०१६24के चित्रा 4 से अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जांच के नाम दृश्यों
MCPyV जांच 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV जांच 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV जांच 3 को CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV जांच 4 को CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV जांच 5 को CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV जांच 6 को CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV जांच 7 को CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV जांच 8 को CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV जांच 9 को CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV जांच 10 को CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
एचपीवी जांच 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
एचपीवी जांच 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
एचपीवी जांच 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
एचपीवी जांच 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
एचपीवी जांच 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

तालिका 1: अध्ययन में प्रयुक्त जांच ।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1. स्क्रीनिंग Iodixanol ढाल भागों MCPyV VP1 के लिए । MCPyV-संक्रमित कोशिकाओं लीजड ड और Iodixanol ढाल अंश के अधीन थे । कोर ढाल अंशों (संख्या, इस प्रयोग में ढाल के नीचे से गिनती, आंकड़ा के शीर्ष पर संकेत कर रहे हैं) पश्चिमी दाग विश्लेषण के अधीन थे VP1 का पता लगाने के लिए । प्रत्येक अंश के 10 µ l नमूने एक 5% अंतिम एकाग्रता के साथ 1x लोड डाई को समायोजित किया गया 2-mercaptoethanol और संक्षेप में ६५ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम । नमूनों को 4-12% बीआईएस-Tris जेल और blotted पर nitrocellulose पर अलग किया गया । पश्चिमी सोख्ता एक खरगोश-विरोधी MCPyV VLP आनटिसम पतला 1:5000 का उपयोग नोनफेट शुष्क दूध के साथ TBST में आयोजित किया गया था । आनटिसम अनुरोध पर उपलब्ध है । ५० केडीए मानक (जो इसी तरह विस्थापितों को ४७ केडीए MCPyV VP1 मोनोमर) तारांकन चिह्न से चिह्नित किया गया है. दिखाए गए चित्र में, नमूना कमी अपूर्ण थी और डाइसल्फ़ाइड-लिंक्ड VP1 multimers स्पष्ट हैं । dithiothreitol और/या उच्चतर विकार तापमान का उपयोग VP1 मोनोमर प्रजातियों के लिए और अधिक पूर्ण कमी में परिणाम कर सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

ऊपर वर्णित विधियों, मानव त्वचा के ऊतकों से चमड़े का fibroblasts के अलगाव सहित, रिकॉमबिनेंट MCPyV virions की तैयारी, संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के संक्रमण, immunofluorescent धुंधला, और एक संवेदनशील मछली HCR प्रौद्योगिकी से अनुकूलित विधि है, जो MCPyV संक्रमण का विश्लेषण करने के लिए शोधकर्ताओं को सक्षम करना चाहिए27. इन विट्रो में MCPyV संक्रमण को प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक उच्च titer विरिअन तैयारियों का उत्पादन होता है । रिकॉमबिनेंट MCPyV virions की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल का प्रयोग यहां वर्णित है, हम idoxanol विलायक11,12की मिलीलीटर प्रति 1012 जीनोम प्रतियां के वायरल titers हासिल । इन उच्च titer MCPyV तैयार करने के लिए हमें केवल प्राथमिक त्वचा कोशिका प्रकार है कि अब तक पूर्ण MCPyV संक्रमण चक्र24का समर्थन प्रकट होता है के रूप में HDFs की पहचान करने की अनुमति दी ।

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर ताजा मानव चमड़े का fibroblasts अलग हमें MCPyV संक्रमण प्रयोग में इस्तेमाल किया कोशिकाओं की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए सक्षम है और विभिन्न रोगी नमूनों से अलग कोशिकाओं में निष्कर्षों की निरंतरता सुनिश्चित करते हैं । सभी मानव अधययन नवजात त्वचा से अलग fibroblasts qPCR द्वारा MCPyV डीएनए की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए MCPyV संक्रमण के अभाव रिकॉमबिनेंट MCPyV virions के साथ इलाज से पहले सुनिश्चित करने के लिए । आदेश में अधिकतम MCPyV संक्रमण दक्षता प्राप्त करने के लिए, यह उच्च बीतने fibroblasts समर्थन कम MCPyV संक्रमण क्षमता के रूप में नवजात मानव चमड़ी से हौसले से पृथक मानव चमड़े का fibroblasts का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, जब वयस्क त्वचा के नमूनों से समानांतर में अलग, नवजात त्वचा के नमूनों से fibroblasts बहुत उच्च MCPyV संक्रमण क्षमता24का समर्थन किया । हम MCPyV संक्रमण के लिए किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोशिकाओं का परीक्षण नहीं किया है । हालांकि, हम कोई विशेष कारण है कि व्यावसायिक रूप से अलग fibroblasts से हीन होना चाहिए अगर वे ठंड के बिंदु पर उच्च मार्ग रहे है देखते हैं ।

हम भी अंय जानवरों से चमड़े का fibroblasts अलग करने के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है । उदाहरण के लिए, हमने प्रोटोकॉल का उपयोग सफलतापूर्वक अधययन fibroblasts को माउस से अलग करने के लिए किया है (मस musculus), चूहा (Rattus norvegicus), tree छछूंदर (Tupaia Belangeri), और रीसस समूल (Macaca mulatta)25. के रूप में मानव कोशिकाओं में मनाया, fibroblasts युवा चिंपांजी से अलग की अनुमति दी अधिक पुराने जानवरों की तुलना में अधिक कुशल MCPyV संक्रमण25।

पारंपरिक मछली की तुलना में, HCR-डीएनए मछली वायरल जीनोम का पता लगाने के लिए एक सरल, लेकिन अति संवेदनशील विधि है24,27। MCPyV प्रतिकृति के केंद्र आसानी से उच्च विशिष्ट कबरा घावों के रूप में संक्रमित कोशिकाओं के नाभिक में पता लगाया जा सकता है, के साथ कोई पृष्ठभूमि संकेत एक एचपीवी विशिष्ट जांच के साथ इलाज के नमूनों में पता चला (4 चित्रा)24। भविष्य में, दृष्टिकोण इसलिए संक्रमित मानव त्वचा में कम बहुतायत MCPyV डीएनए का पता लगाने के लिए पता लगाया जा सकता है । यह भी अंय डीएनए वायरस की निगरानी अनुकूलित किया जा सकता है । जब immunofluorescent धुंधला के साथ संयुक्त, इंयूनो-मछली एक साथ वायरल डीएनए का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली विधि प्रदान करता है और या तो वायरल इनकोडिंग प्रोटीन या मेजबान एक ही कोशिकाओं (चित्रा 4) में मौजूद प्रोटीन । इष्टतम यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह सबसे अच्छा है immunofluorescent धुंधला और HCR-डीएनए मछली विश्लेषण के लिए ताजा तय नमूनों का उपयोग करें । HCR-डीएनए मछली विश्लेषण के लिए, जांच और एम्पलीफायर में संग्रहित किया जाना चाहिए-८० ° c छोटे aliquots में दोहराया ठंड और गल से बचने के लिए.

HDF सेल संस्कृति और MCPyV संक्रमण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम सेल विकास की स्थिति है कि सबसे अच्छा समर्थन MCPyV प्रवेश, प्रतिलेखन, और HDFs में प्रतिकृति का पता लगाया । हम इस तरह के EGF, bFGF के रूप में विकास कारकों, और WNT संकेतन मार्ग की उत्तेजना काफी MCPyV संक्रमण को बढ़ावा देने के साथ कि HDFs के उपचार की खोज की । जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा पता चलता है कि, इन विकास कारकों और WNT संकेतन मार्ग के सक्रियकरण के साथ उत्तेजना पर, मैट्रिक्स metalloproteinase के कई जीन (एमएमपी) परिवार, MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 और 13 सहित, मजबूती से प्रेरित थे । क्योंकि इन एमएमपी एंजाइमों अपमानजनक extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के लिए सक्षम हैं, हम कारण है कि वे मेजबान कोशिकाओं के extracellular मैट्रिक्स को बाधित करने से MCPyV संक्रमण को उत्तेजित कर सकते हैं । दरअसल, collagenase प्रकार चतुर्थ, एमएमपी परिवार के एक सदस्य के साथ HDFs के इलाज, मजबूती MCPyV संक्रमण (चित्रा 3)24उत्तेजित करता है । हम भी MCPyV संक्रमण पर निरोधात्मक प्रभाव के लिए कई एफडीए अनुमोदित कळेनासे अवरोधकों सहित यौगिकों, की एक सरणी दिखलाई । हमें पता चला कि trametinib, एक MEK1 और MEK2 अवरोध करनेवाला, नाटकीय रूप से MCPyV संक्रमण24रोकता है । दूसरों का उपयोग करें या MCPyV अवरोधकों कि प्रतिरक्षा रोगियों में MCPyV वायरल लोड को कम करने के लिए एक दवा डिस्कवरी मंच के रूप में इस संक्रमण प्रणाली को संशोधित कर सकते हैं ।

संक्षेप में, अत्यधिक कुशल MCPyV संक्रमण प्राप्त करने के लिए इन प्रोटोकॉल एक मंच प्रदान करने के लिए खराब समझ MCPyV संक्रामक चक्र और MCPyV-प्रेरित oncogenic तंत्र वायरल संक्रमण के संदर्भ में स्पष्ट । प्रोटोकॉल का यह सेट भविष्य के अध्ययन में लागू किया जा सकता है अतिरिक्त MCPyV-स्वतंत्र मानव कोशिका प्रकार का पता लगाने, और एमसीसी के मूल कोशिकाओं, जिसमें संयोग MCPyV संक्रमण ट्यूमर विकास के लिए नेतृत्व कर सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक डॉ Meenhard Herlyn (Wistar संस्थान) और डॉ एम Celeste शमौन (पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के) के लिए धंयवाद देना चाहूंगा रिएजेंट और तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए । हम भी सहायक चर्चा के लिए हमारी प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धंयवाद । इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) अनुदान (R01CA187718, R01CA148768 और R01CA142723), NCI कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (NCI P30 CA016520), और पेन CFAR पुरस्कार (P30 AI ०४५००८) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४४ मार्केल सेल polyomavirus अलगाव अधययन fibroblasts संक्रमण collagenase IV CHIR99021 immunofluorescent धुंधला प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण सीटू डीएनए में-संकरण चेन रिएक्शन प्रतिलेखन प्रतिकृति
मार्केल सेल Polyomavirus संक्रमण और पता लगाने
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Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

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