Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Poliomavirus de células de Merkel la infección y la detección

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para infectar fibroblastos dérmicos humanos primarios con MCPyV. El protocolo incluye aislamiento de fibroblastos dérmicos, preparación de viriones MCPyV, infección por el virus, tinción de inmunofluorescencia y fluorescencia hibridación in situ. Este protocolo puede ampliarse para caracterizar las interacciones MCPyV-host y descubrir otros tipos de células infectables por MCPyV.

Abstract

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infección puede conducir al carcinoma de la célula de Merkel (MCC), una forma altamente agresiva de cáncer de piel. Estudio de mecanismos para investigar completamente MCPyV molecular biología y mecanismos oncogénicos ha visto obstaculizado por la falta de modelos de cultivo celular adecuado. Aquí, describimos un conjunto de protocolos para realizar y detectar MCPyV la infección de células de piel humana primaria. Los protocolos describen el aislamiento de los fibroblastos dérmicos humanos, preparación de viriones recombinantes de MCPyV y la detección de infección por el virus por tinción de inmunofluorescencia (IF) y in situ hibridación de ADN reacción en cadena (HCR), que es muy sensible fluorescencia en el enfoque de situ del hibridación (pescado). Los protocolos en este documento pueden ser adaptados por los investigadores interesados a identificar otros tipos de células o líneas celulares compatibles con infección MCPyV. El enfoque descrito de pescado también podría adaptarse para detectar bajos niveles de ADN viral presente en la piel humana infectada.

Introduction

Polyomavirus de la célula de Merkel (MCPyV) es un virus ADN pequeño, doble hebra que se ha asociado con un cáncer de piel raro pero agresivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. La tasa de mortalidad de MCC, alrededor del 33%, supera la de melanoma3,4. MCPyV tiene un genoma circular de ~ 5 kb1,5 atravesada por una región reguladora no codificante (NCRR) en regiones1codificación de temprano y tarde. El NCRR contiene el origen viral de replicación (Ori) y de bidireccional promotores de transcripción viral6,7. La región temprana codifica proteínas de antígeno de tumor llamadas grandes T (LT), pequeño T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), así como una hay miRNA1,8,9,10. La región tardía codifica las proteínas de la cápside VP1 y VP211,12,13. LT y sT son las proteínas de MCPyV mejor estudiadas y han demostrado para apoyar la replicación de ADN viral y la tumorigénesis inducida por MCPyV5. Integración clonal de MCPyV ADN en el genoma del anfitrión, que se ha observado en hasta un 80% de la MCC, es probablemente un factor causal para tumor virus-positivo de desarrollo14,15.

La incidencia de CCM se ha triplicado en los últimos veinte años16. MCPyV la infección asintomática también es generalizada en la población general de18,17,19. Con el creciente número de diagnósticos MCC y la alta prevalencia de infección por MCPyV, hay una necesidad de mejorar nuestra comprensión del virus y su potencial oncogénico. Sin embargo, muchos aspectos de la biología MCPyV y mecanismos oncogénicos siguen siendo mal entendidos20. Esto es en gran parte porque MCPyV mal se replica en células establecidas líneas11,12,21,,,2223 y, hasta hace poco, la piel las células capaces de soportar MCPyV la infección no había sido descubierto22. Estudio de mecanismos para investigar completamente MCPyV y su interacción con las células huésped se ha visto obstaculizado por la falta de sistema de cultivo de células para propagar el virus5.

Hemos descubierto que fibroblastos dérmicos humanos primarios (HDFs) aislaron de prepucio humano neonatal soporte robusto MCPyV la infección tanto en vitro y ex vivo24. De este estudio, estableció el primer modelo de infección de cultura celular MCPyV24. Basándose en este modelo de sistema, demostró que la inducción de genes de matriz metaloproteinasa (MMP) por la WNT/β-catenina señalización de vía y otros factores de crecimiento estimula la infección MCPyV. Por otra parte, encontramos que el aprobado por la FDA MEK antagonista trametinib impide eficazmente la infección de MCPyV5,25. De estos estudios, también establecimos un conjunto de protocolos para el aislamiento de los fibroblastos dérmicos humanos24,25, preparación MCPyV viriones11,12, realizar la infección MCPyV en fibroblastos dérmicos humanos 24 , detección de MCPyV de proteínas por tinción IF26y 25 . Además, adaptamos la in situ ADN hibridación la reacción en cadena (HCR) tecnología27 para desarrollar una técnica altamente sensible de pescado (HCR-DNA FISH) para la detección de ADN MCPyV en las células infectadas de la piel humana. Estos nuevos métodos serán útiles para estudiar el ciclo infeccioso de MCPyV, así como la respuesta celular a la infección por MCPyV. Las células de depósito de huéspedes naturales que mantienen la infección MCPyV y las células que dan origen a tumores MCC sigue siendo desconocidas. Las técnicas que describimos en este manuscrito podrían aplicarse para examinar varios tipos de células humanas para identificar tanto las células de depósito y el origen de tumores MCC. Nuestros métodos establecidos, tales como pescados de HCR-DNA, también podrían ser empleados en la detección de otros virus ADN de tumor y la caracterización de las interacciones de la célula huésped.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prepucio neonatal humana fueron obtenido del centro de investigación de la enfermedad de la piel de Penn. Fibroblastos humanos adultos fueron obtenidos de piel normal desechada después de la cirugía. Todos los protocolos fueron aprobados por la Universidad de Pennsylvania Junta de revisión institucional.

1. aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos

  1. Utilice un par de tijeras recorte el tejido subcutáneo y grasa de prepucio neonatal humano y cortar la muestra de piel en mitades o cuartos.
  2. Incubar el tejido en 5 mL de dispase II en PBS suplementado con antibiótico-antimicótico de 10 mg/mL a 4 ° C durante la noche.
  3. En un recipiente estéril de 10 cm, cuidadosamente separe la epidermis de las capas dérmicas con unas pinzas de microdissection.
  4. Transferencia el tejido cutáneo resultante a un tubo cónico de 15 mL que contiene 5 mL de colagenasa de 2 mg/mL tipo IV en FBS-libre suplementado con antibiótico-antimicótico.
  5. Incubar la muestra a 37 ° C en 5% CO2 para 4-6 h con agitación periódica hasta que queden pocos agregados macroscópicos del tejido.
  6. Liberar las células de la dermis mediante pipeteo arriba y abajo (trituración) enérgicamente diez veces con una pipeta de 10 mL.
  7. Centrifugue a 180 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
  8. Las células disociadas en medio DMEM suplementado con suero de ternera fetal 10%, los de aminoácidos no esenciales 1% y 1% de la placa L-glutamina a 37 ° C en 5% CO2.

2. recombinante MCPyV preparación de virion

  1. Recopilación de 50 μg de plásmido pR17b (llevar MCPyV genoma) con 250 U de BamHI-HF en un volumen de 200 μl (4 h a 37 ° C) para separar el genoma viral de la columna vertebral del vector (figura 2).
  2. Añadir 1200 μl de buffer PB (complementado con 10 μl de NaAc de 3 M, pH 5.2) a la DNA digerida y purificar más 2 columnas de spin miniprep (capacidad de ADN de 20 μg). Eluir el plásmido digerido pR17b de cada columna con 200 μL de tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).
  3. Preparar la reacción de la ligadura en un tubo de centrífuga de 50 mL. Añadir 400 μL de ADN de plásmido purificado del paso 2.2, 8,6 mL de tampón de ligasa x T4 1.05 y 6 μl de ligasa de T4 de alta concentración. Incubar a 16 ° C durante la noche.
  4. Agregar 45 mL de solución de PB (complementado con 10 μl de NaAc de 3 M, pH 5.2) para la ligadura y un colector de vacío se utiliza para cargar a través de 2 columnas de miniprep spin. Eluir cada columna con 50 μl de tampón TE. Esperar un rendimiento de alrededor de 30 μg de DNA.
  5. En la tarde tarde, semilla 6 x 106 293TT28 células en 10 cm plato con medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal de becerro, los de aminoácidos no esenciales 1% y 1% L-glutamina sin higromicina B.
  6. A la mañana siguiente, asegúrese de que las células son cerca de 50% confluente. Transfectar utilizando 66 μl de reactivo de transfección (1,1 μl/cm2), 12 μg de MCPyV ligado a aislar ADN R17b en el paso 2.4, 8.4 μg de TB pMtB de plásmido de expresión ST y 9,6 μg de LT expresión plásmido pADL *29.
  7. Cuando las células transfected casi confluentes, al día siguiente, trypsinize las células y transferirlos a un plato de 15 cm de continua expansión.
  8. Opcionalmente tomar una pequeña cantidad de células 293TT expansión y llevar a cabo si la coloración de MCPyV LT (CM2B4) y VP1 (MCV VP1 conejo30) para determinar la eficiencia de transfección. En esta etapa, señal nuclear de la LT puede ser visible pero VP1 expresión probablemente no será detectable.
  9. Cuando el plato de 15 cm se convierte en casi confluente (generalmente 5-6 días después de la inicial de la transfección), transferencia de las células en tres platos de 15 cm. Cosechar las células de los platos de 15 cm cuando se vuelven casi confluentes y seguir el protocolo de cosecha de virus a continuación.
    Nota: Opcionalmente realizar control de calidad si tal como se describe en el paso 2.8. La mayoría de las células debe ser MCPyV LT y VP1 positiva en esta etapa.
  10. Para recoger el virus, trypsinize células, girar en 180 x g durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Añadir un volumen de pellet celular de DPBS-Mg (DPBS con 9,5 mM de MgCl2 y 1 x de antibiótico-antimicótico). Luego agregar sulfato de amonio 25 mM (de una solución stock de 1 M pH 9) seguido por 0,5% Tritón X-100 (de una solución madre 10%), 0,1% Benzonase y 0.1% de una DNasa dependiente de ATP. Mezcla bien e incubar a 37 ° C durante la noche.
  11. Incubar la mezcla por 15 min en hielo y añadir volumen 0.17 de 5 M NaCl. Mezclar e incubar en hielo por 15 minutos otra vuelta por 10 min a 12.000 x g en una centrífuga de 4 ° C. Si el sobrenadante no es claro, suavemente invierta el tubo y repita el paso de hilado. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
  12. Resuspender el precipitado con un volumen de DPBS complementado con 0,8 M de NaCl y vuelta otra vez, como se describe en el paso 2.11.
  13. Combine los sobrenadantes del paso 2.11 y 2.12 y girar una vez más como se describe en el paso 2.11.
  14. Pour gradientes de iodixanol en tubos de pared delgada 5 mL polyallomer de enfasis (27%, y 33% y 39%) ~0.7 pasos de mL mediante una jeringa de 3 mL provista de una aguja larga o una pipeta p1000.
  15. Coloque 3 mL de sobrenadante clarificado que contiene el virus en el gradiente de iodixanol preparado.
  16. Vuelta por 3,5 h a 234.000 x g y 16 ° C en un rotor de SW55ti. Ajustar la aceleración y desaceleración a lento.
  17. Después de la ultracentrifugación, recoge 12 fracciones en tubos siliconados (cada fracción es de ~ 400 μL).
  18. Analizar las fracciones de la presencia de virus dsDNA reactivo o Western blot para VP1 (MCV VP1 conejo30). Piscina fracciones gradiente pico dsDNA o contenido de VP1 y caracterizar la población por PCR cuantitativa para el cálculo de los equivalentes de genoma viral31. Almacenar valores de virión MCPyV a-80 ° C.

3. infección

  1. Mantener fibroblastos dérmicos humanos primarios en DMEM con suero de ternera fetal 10%, los de aminoácidos no esenciales 1% y 1% L-glutamina. Al llegar a la confluencia, split 1:4 de fibroblastos sin giro hacia abajo.
    Nota: Para mayor eficiencia de la infección de MCPyV, utilice fibroblastos primarios entre los pasos 5 y 12 que se están dividiendo activamente en el momento de la galjanoplastia.
  2. Para infectar fibroblastos dérmicos humanos, el medio de aspirar y lavar las células con DPBS.
  3. Añadir 1 mL de 0.05% tripsina-EDTA al plato e incubar a 37 ° C durante 5-10 minutos.
  4. Ver bajo el microscopio para asegurarse de que las células se vienen del plato.
  5. Añadir 10 mL de medio DMEM/F12 con EGF, 20 ng/mL bFGF y 3 μm de 20 ng/mL CHIR99021, que estimulan MCPyV infección24, al plato y transfiera la solución de células en un tubo de 15 mL.
  6. Desactivación de las células a 180 x g durante 2 min y descarte el sobrenadante. Resuspender las células en medio DMEM/F12 que contiene 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF y 3μm CHIR99021 en 2-4 x 104 células por mL.
  7. La semilla 200 μL de la suspensión de células complementada con el tipo de colagenasa 1 mg/mL IV en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Descongelar el MCPyV stock de virion en el hielo. Añadir 10 equivalentes de genoma viral9 de viriones MCPyV (calculado en el paso de 2.18) por 1 μl de iodixanol cada 2.500 a 5000 células infectadas.   Toque suavemente al lado de la placa y colocar la placa en la incubadora.
  8. Después de incubación a 37 ° C en 5% CO2 para 48-72 h, añadir 20% FBS a cada pocillo.
  9. Permiten la infección proceder a 37 ° C en 5% CO2 de 72-96 h.

4. inmunofluorescente de tinción

  1. Fijar las células obtenidas en el paso 3.9 con paraformaldehido 3% en PBS durante 20 minutos.
  2. Lavar las células con PBS dos veces.
  3. Incubar las células en buffer de bloqueo/permeabilización (0.5% Tritón X-100, 3% de BSA en PBS filtrada por filtro de 0,22 μm) a temperatura ambiente durante 1 hora.
  4. Incubar las células con los anticuerpos primarios siguientes: ratón monoclonal anti-MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) y el anticuerpo de conejo policlonales anti-MCPyV VP1 (1: 2000), a temperatura ambiente durante 3 horas.
  5. Lavar las células con PBS tres veces.
  6. Incubar las células con anticuerpos secundarios: Fluor 594 cabra anti-ratón IgG (1: 1000) y Fluor 488 cabra anti-IgG de conejo (1: 500) a temperatura ambiente durante 1 hora.
  7. Lavar las células con PBS tres veces.
  8. Contratinción las células con 0.5 μg/mL de DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, diclorhidrato).
  9. Montaje de cubreobjetos de vidrio se desliza y analizar utilizando un microscopio de fluorescencia invertido.

5. In situ de ADN-HCR

Nota: Esta técnica requiere que se siembran las células sobre cubreobjetos. Para ello, las condiciones de infección descritas anteriormente (paso 3) pueden ampliarse para el formato de la placa de 24 pozos.

  1. Fijar las células cultivadas en el cubreobjetos con el 4% PFA en PBS durante 10 minutos lavar los cubreobjetos dos veces con PBS, entonces tratarlos con etanol al 70% para permeabilizar las células a 4 ° C durante la noche.
    Nota: Muestras fijadas pueden permanecer en este estado durante varios días.
  2. Hibridar las muestras reemplazando el etanol con tampón de hibridación de la sonda y incubar por 60 min a TA.
  3. Diluir la sonda (1 μm) (tabla 1) en el hibridación de la sonda solución tampón en dilución 1: 500 30 min antes de finalizar el paso de la hibridación e incubar a 45 ° C.
  4. Al final de las incubaciones, pipetee ~ 10 μL de la mezcla de sonda diluido por cubreobjetos en portaobjetos de microscopio. Lugar el cubreobjetos, celda hacia abajo, en sus respectivas gotas de sonda de hibridación mezcla. Sellar los bordes y las partes posterioras de los cubreobjetos para las diapositivas con una cantidad abundante de pegamento de caucho.
  5. Calentar los portaobjetos con puntas de prueba mayor a 94 ° C por 3 min estableciendo las diapositivas sobre la parte plana de un bloque de calor. Transfiera los portaobjetos a una cámara humidificada e incubar a 45 ° C durante la noche. Para hacer una simple cámara humidificada, ligeramente humedezca toallas de papel estéril con dH2O y el lugar en el fondo de un recipiente de plástico que sella con una Junta de goma.
    Nota: Durante el calentamiento el cemento de goma puede burbujear brevemente. Sin embargo, asegúrese de que el sello no se rompe.
  6. Con cuidado retire el cemento de goma con pinzas y coloque el cubreobjetos celular-lado para arriba detrás en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Lavar los cubreobjetos con tampón de lavado de la sonda a temperatura ambiente tres veces.
  7. Incubar el cubreobjetos en el tampón de amplificación (200 μL en placas de 24 pocillos) a temperatura ambiente 30-60 min.
  8. Mientras tanto, cocer cada una de las dos horquillas de oligonucleótidos marcados reconociendo las puntas de prueba (cuadro 1) en tubos PCR separados calentando a 94 ° C por 90 s y enfriamiento a RT 30 min mientras que la protección de la luz. Mezclar las dos horquillas en tampón de amplificación, cada uno a una dilución de 1:50.
  9. Hacer una superficie para la reacción de amplificación por estirar la película de parafina sobre la cara de una tapa de placa de 24 pozos. Pipetee gotas de 50-100 μl de la mezcla de buffer de horquilla/amplificación en la película de parafina para cada cubreobjetos. Utilice pinzas para extraer cuidadosamente el cubreobjetos de la solución de amplificación previa. Seco el cubreobjetos tocando el borde de una toallita desechable porosa y coloque el lado del celular hacia abajo sobre la gota de amplificación.
  10. Coloque la tapa de la placa con el cubre-objetos en una cámara humidificada e incubar durante una noche a temperatura ambiente en la oscuridad.
  11. Regresar una vez más el cubreobjetos a pozos. Incubar las muestras con 5 x SSCT [5 x cloruro de sodio citrato de sodio (SSC) 0,1% Tween 20 filtrada a través de un filtro de 0,22 μm] que contiene 0,5 μg/mL DAPI por 1 h a RT lavar las muestras dos veces con 5 x SSCT a TA.
  12. Monte el cubreobjetos en portaobjetos de microscopio. Analizar las células y las muestras con un microscopio de fluorescencia invertido de la imagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El protocolo descrito en este manuscrito permitieron el aislamiento de una población casi homogénea de HDFs (figura 1). Según lo demostrado por la coloración inmunofluorescente, casi el 100% de los aislados de las células cutáneas humanas usando las condiciones descritas en este protocolo fueron positivamente mancharon para el colágeno, el vimentin y marcadores de fibroblastos dérmicos yo24, pero negativo para el ser humano marcador de queratinocitos de prepucio K14 (figura 1). La figura 2 muestra el proceso de generación de viriones MCPyV con recombinante MCPyV genoma y una muestra de virus después de la concentración de la ultracentrífuga. Después de visualizar la banda de viriones MCPyV concentrado en la base del gradiente (señalada con una flecha en la figura 2B), se recolectaron 500 fracciones μl y MCPyV qPCR fue realizada para identificar las fracciones de pico. Un ejemplo de los datos de análisis de qPCR se muestra en la figura 2C. En algunos otros experimentos, las muestras fueron también analizadas con Western Blot utilizando un anticuerpo rabbit anti-MCPyV VLP (suplementario Figura 1). La figura 3 muestra imágenes teñidos inmunofluorescentes de HDFs infectados con MCPyV. Cuantificar manualmente las células positivas, contamos por lo menos tres opiniones al azar de cerca de 300 células. Consideramos las células LT positivo, VP1 positivo, o LT tanto VP1 positivo positivo para infección por MCPyV. En los experimentos que se muestra en la figura 3, más del 30% de células son LT positiva y más del 10% son VP1 positivo. Los genomas de MCPyV replicados en las células infectadas se detectaron peces HCR-ADN (figura 4A) y el de pescado inmunofluorescente-HCR-DNA (figura 4B). Mientras los peces HCR-ADN revela la localización de MCPyV ADN presente en la fábrica de replicación (focos) en la figura 4A, los métodos inmunofluorescente-HCR-DNA FISH permite la detección simultánea de ADN MCPyV y LT proteína co localización en la replicación de centros (figura 4B). Las imágenes de los peces inmunofluorescente-HCR-DNA demostraron que esta técnica podría utilizarse para revelar la localización del ADN viral y la proteína viral asociada.

Figure 1
Figura 1 . Fibroblastos dérmicos humanos aislados de prepucio humano neonatal. Las células cutáneas humanas cultivadas en DMEM/F12 suplementado con 10% FBS se tiñeron utilizando anticuerpos contra la vimentina, colágeno I, o queratina 14 (K14). Las células fueron también contratinción con DAPI. Barra de 50 μm. Esta figura fue adaptada de S2 figura de Liu et al., 201624. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Producción de MCPyV virus con genoma viral recombinante. (A) A mapa de plásmido de pR17b (plásmido de genoma de MCPyV). (B) un cuadro representativo de una muestra de virión MCPyV cosecha y purificada de una pendiente. Flecha marca la banda de viriones MCPyV concentrado en la base del gradiente. Número de (C) la copia del genoma viral en cada fracción del gradiente se cuantificó mediante qPCR. Base de gradiente fracciones (números, contando desde la parte superior de la pendiente, se indican en la parte inferior del gráfico). Barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de tres repeticiones técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Fibroblastos dérmicos humanos apoyan robusto MCPyV infección, transcripción, replicación y. Fibroblastos dérmicos aislados de piel humana fueron tratados con MCPyV viriones en DMEM F12 medio con EGF, bFGF, CHIR99021 y colagenasa IV durante dos días. Después de cambiar a medio DMEM/F12 fresco que contiene 20% de FBS para tres días más, las células fueron inmuno-teñido usando los anticuerpos indicados y contratinción con DAPI. Muchas de las células no sólo han expresado altamente LT y VP1 sino también muestran focos de replicación de MCPyV robustos. Esta figura fue adaptada de la figura 3 de Liu et al., 201624. Escala de la barra, 50 m. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Detección de MCPyV en las células infectadas mediante técnicas de pescado. (A) dérmica las células humanas cultivadas en DMEM/F12 con EGF, bFGF, CHIR99021, colagenasa tipo IV fueron tratados con MCPyV para 2 días. Después de cambiar a dulce DMEM/F12 que contiene FBS para 3 días más, las células fueron sometidas a análisis de los pescados de HCR-DNA. Las células fueron también contratinción con DAPI. (B) las células cutáneas humanas cultivan en medio con EGF, bFGF, y CHIR99021 fueron o no tratada (Mock) o había tratado (infectado) con MCPyV como se indica en (A). Las células fueron sometidas a inmuno-FISH usando LT sondas de ADN específicas de MCPyV y el anticuerpo antes de contratinción con DAPI. Sondas de HPV16 se utilizaron como control negativo. Barra de escala, 10 m. Esta figura fue adaptada de la figura 4 de Liu et al., 201624. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre del sondeo Secuencias de
MCPyV sonda 1 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 2 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 3 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 4 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 5 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Prueba de MCPyV 6 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 7 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 8 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 9 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 10 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Punta de prueba HPV 1 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Punta de prueba HPV 2 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Prueba de VPH 3 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Punta de prueba de HPV 4 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Prueba de HPV 5 TAAAA CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tabla 1: Las sondas utilizadas en el estudio.

Supplemental Figure 1
Suplementario Figura 1. Detección de fracciones gradiente Iodixanol MCPyV VP1. Células infectadas MCPyV lisis y sometidas a fraccionamiento gradiente Iodixanol. Base de gradiente fracciones (números, contando desde la parte inferior de la pendiente en este experimento, se indican en la parte superior de la figura) se sometieron a análisis de Western blot para detectar VP1. 10 μl de cada fracción se ajustó a 1 x tinte de carga con una 5% de concentración final de 2-Mercaptoetanol y brevemente se calienta a 65 ° C. Las muestras fueron separadas en un gel de Tris bis 4-12% y borradas en nitrocelulosa. Western Blot se llevó a cabo en TBST con leche descremada en polvo usando un conejo-anti-MCPyV VLP antisuero diluido 1: 5000. El antisuero es disponible bajo petición. El estándar de 50 kDa (que migra de manera similar a los 47 kDa MCPyV VP1 monómero) está marcado con un asterisco. En la imagen se muestra, muestra la reducción fue incompleta y disulfuro-ligado VP1 Multímeros son evidentes. Uso de Ditiotreitol o temperaturas de desnaturalización puede resultar en reducción más completa a la especie de monómero de VP1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Los métodos descritos arriba, incluyendo el aislamiento de fibroblastos dérmicos de tejido de la piel humana, preparación de viriones recombinantes de MCPyV, infección de las células cultivadas, coloración inmunofluorescente y un método sensible de peces adaptado de tecnología HCR, que debe permitir a los investigadores a analizar MCPyV infección27. Uno de los pasos más críticos para lograr MCPyV infección in vitro es la producción de preparaciones de virus de alto título. Utilizando el protocolo para la preparación de recombinantes viriones MCPyV descrito aquí, conseguimos títulos virales de 1012 copias de genoma / mL de solvente11,de idoxanol12. Estos alto-título MCPyV preparados nos permitidos identificar HDFs como el tipo de célula de la piel sólo primario hasta el momento que parece apoyar la infección de MCPyV completa del ciclo24.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos frescos usando el protocolo descrito en este manuscrito nos ha permitido controlar la calidad de las células utilizadas en la infección MCPyV experimentar y asegurar la coherencia de los resultados en células aisladas de diferentes muestras de pacientes. Todos los fibroblastos dérmicos humanos aislados de la piel neonatal deben evaluarse presencia de ADN de MCPyV por qPCR para asegurar la ausencia de MCPyV infección antes del tratamiento con viriones MCPyV recombinantes. Para obtener la máxima eficacia de infección MCPyV, es fundamental utilizar fibroblastos dérmicos humanos recién aislados de prepucio humano neonatal como fibroblastos de pasaje mayores rendimientos más bajos de infección MCPyV. Además, cuando están aisladas en paralelo de muestras de piel de adultos, fibroblastos de las muestras de la piel neonatal habían apoyado mucho mayor MCPyV infección eficiencia24. Nunca hemos probado todas las células disponibles comercialmente para la infección MCPyV. Sin embargo, vemos que ninguna razón específica que comercialmente aislado fibroblastos debe ser inferior que si paso superior en el punto de congelación.

También hemos utilizado el protocolo aquí descrito para aislar fibroblastos dérmicos de otros animales. Por ejemplo, hemos utilizado el protocolo para aislar con éxito fibroblastos dérmicos de ratón (Mus musculus), rata (Rattus norvegicus), musaraña de árbol (Tupaia Belangeri) y macaco de la India macaque macaco (Macaca mulatta)25. Como se observa en las células humanas, los fibroblastos aislados de los chimpancés más jóvenes permitieron infección MCPyV más eficiente en comparación con la de animales mayores25.

En comparación con los tradicionales de pescado, pescado de HCR-ADN es un sencillo, pero método altamente sensible para la detección de genomas virales24,27. Centros de MCPyV de replicación pueden ser detectados fácilmente en los núcleos de las células infectadas como focos punteados muy específicos, con poca o ninguna señal de fondo detectada en las muestras mismo tratadas con una sonda específica (figura 4) de HPV24. En el futuro, el enfoque por lo tanto podría ser explorado para detectar ADN de MCPyV de baja abundancia presente en la piel humana infectada. También podría ser adaptado para vigilar otros virus ADN. Cuando se combina con la tinción inmunofluorescente, inmuno-pescado proporciona un poderoso método para detectar simultáneamente ADN viral y viral proteína o proteínas huésped presentes en las células del mismo (figura 4). Para obtener los mejores resultados utilizando los protocolos descritos aquí, es mejor utilizar muestras recién fijadas para coloración inmunofluorescente y análisis de los pescados de HCR-DNA. Para el análisis de los pescados de HCR-DNA, las sondas y el amplificador deben almacenarse en-80 ° C en alícuotas pequeñas para evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.

Mediante el cultivo celular HDF y el protocolo de infección MCPyV, se analizó las condiciones de crecimiento celular que mejor soportan la replicación, transcripción y entrada de MCPyV en HDFs. Hemos descubierto que el tratamiento de HDFs con factores de crecimiento, tales como EGF, bFGF y la estimulación de la vía de señalización WNT promoción significativamente la infección MCPyV. Perfil de expresión génica revela que, sobre el estímulo de estos factores de crecimiento y la activación de la vía de señalización de WNT, varios genes de la familia de matriz metaloproteinasa (MMP), incluyendo MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 y 13, fueron inducidos robusta. Porque estas enzimas MMP son capaces de degradar las proteínas de matriz extracelular, razonamos que puede estimular la infección MCPyV alteran la matriz extracelular de las células hospedadoras. De hecho, tratar HDFs tipo colagenasa IV, un miembro de la familia de RPP, estimula enérgicamente MCPyV infección (figura 3)24. También defendimos a una gran variedad de compuestos, incluyendo varios inhibidores de la cinasa aprobado por la FDA, para el efecto inhibitorio sobre la infección por MCPyV. Descubrimos que trametinib, un inhibidor de MEK1 y MEK2, inhibe drásticamente MCPyV infección24. Otros pueden utilizar o modificar este sistema de infección como plataforma de descubrimiento de drogas inhibidores de la MCPyV que reducen la carga viral de MCPyV en pacientes immunocompromised.

En Resumen, estos protocolos para lograr la infección altamente eficiente de MCPyV proporcionan una plataforma para aclarar el mal entendido ciclo infeccioso MCPyV y mecanismos oncogénicos inducida por MCPyV en el contexto de la infección viral. Este conjunto de protocolos se podría aplicar en futuros estudios para explorar otros tipos de células humanas MCPyV permisiva y las células originales de MCC, en que incidentales MCPyV infección podría conducir a un desarrollo de tumores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer al Dr. Meenhard Herlyn (Instituto de Wistar) y el Dr. M. Celeste Simón (Universidad de Pennsylvania) reactivos y apoyo técnico. También agradecemos a los miembros de nuestros laboratorios de discusión útil. Este trabajo fue apoyado por las donaciones de institutos nacionales de salud (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 y R01CA142723), la beca de apoyo de centro NCI cáncer (NCI P30 CA016520) y el premio Penn CFAR (P30 AI 045008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

Inmunología e infección número 144 Merkel cell polyomavirus aislamiento fibroblastos dérmicos infección colagenasa IV CHIR99021 tinción inmunofluorescente fluorescencia in situ hibridación reacción en cadena in situ hibridación de la DNA transcripción replicación
Poliomavirus de células de Merkel la infección y la detección
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter