Summary
本方案的目的是论证如何通过含糖培养基溶液浸泡处理诱导拟南芥幼苗子叶聚集气孔, 以及如何观察叶绿体等细胞内结构和微管在聚集保护细胞使用共聚焦激光显微镜。
Abstract
气孔运动介导植物气体交换, 这是光合作用和蒸腾作用所必需的。气孔开口和关闭分别是通过保护细胞体积的显著增加和减少来完成的。由于在气孔运动过程中, 离子和水的穿梭迁移发生在保护细胞和较大的相邻表皮细胞之间, 因此植物气孔的间隔分布被认为是气孔运动的最佳分布。改变气孔间距图案的实验系统有助于检验气孔间距图案的意义。几个关键基因与间隔气孔分布已被确定, 聚集气孔可以通过改变这些基因实验诱导。另外, 外源性处理也可以诱导聚集气孔, 而不进行基因改造。本文介绍了一种简单的拟南芥幼苗聚集气孔的诱导系统, 该系统采用含蔗糖介质溶液浸没处理。我们的方法简单, 直接适用于转基因或突变线。较大的叶绿体被认为是蔗糖诱导的聚集保护细胞的细胞生物学特征。此外, 皮质微管的一个具有代表性的共聚焦显微图像显示为聚集保护细胞的细胞内观察的一个例子。在控制条件下, 在聚集保护细胞中保持皮质微管的径向方向, 就像在间隔的保护细胞中一样。
Introduction
植物气孔是光合作用和蒸腾作用气体交换的重要器官, 气孔运动是通过离子驱动的吸水和释放来实现的。在显微镜下, 我们可以观察到在叶片和茎的表面上气孔的间隔分布模式。气孔的这种间隔分布被认为有助于气孔运动, 这是由离子和水交换之间的保护细胞和邻近的表皮细胞1,2。聚集气孔的实验诱导系统可用于研究气孔间隔分布的重要性。
据报道, 保护细胞分化 3、4或使用化合物5处理的关键基因的基因修饰可以诱导气孔的空间聚集.我们还报告说, 浸泡治疗与中等溶液补充糖, 包括蔗糖, 葡萄糖, 果糖引起气孔聚集在拟南芥幼苗的子叶 6.在蔗糖处理的子叶表皮中观察到分离子列表和表皮细胞的新细胞壁中的钙质减少, 这表明蔗糖溶液浸泡治疗对细胞壁有负面影响, 从而防止了细胞壁的泄漏, 并防止了细胞壁的渗漏。保护细胞分化 (如转录因子) 对邻近表皮细胞的关键基因产物的异位作用6。通过对gsl8/突变体7、8的研究, 提出了类似的机制。我们的利用含蔗糖介质溶液对聚集气孔进行重复诱导的实验系统是一种相当简单、廉价的实验系统。它也可以用来研究细胞内的结构, 如细胞器和细胞骨架聚集保护细胞时, 应用于转基因线表达荧光标记, 标签细胞内结构9,10个。
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Protocol
1. 3% 含液半毛拉希盖-skoog 培养基溶液的制备
- 在烧杯中加入1.1 克的 murashige-skoog 中盐和15克蔗糖。
- 加入490毫升蒸馏水, 用搅拌吧搅拌均匀。
- 使用 koh 将 ph 值调整到5.8。
- 用蒸馏水稀释至500毫升, 并将溶液转移到中等瓶子中。
- 通过高压灭菌对溶液进行灭菌 (121°c, 20分钟)。如果不立即使用, 此溶液在灭菌后可保持在4°c。
2. 含蔗糖介质溶液浸入法诱导聚集型气孔
- 对种子进行消毒。
- 加入500μl 的5% 活性氯 naco 溶液和1μl 的 10% triton x-100 至500μl 无菌水, 制备灭菌液。
- 将携带荧光标记 (如 ct-gfp11或 gfp-tub612)的荧光标记的大约50个转基因 a. thaliana 种子放入 1.5 ml 管中.
- 加入1毫升的70% 乙醇溶液, 通过反转五次进行良好的混合。离开1分钟。
- 种子会沉到管子的底部。在干净的长凳上, 使用微型移液器轻轻去除70% 的乙醇, 并加入1毫升的灭菌溶液。通过反转五次, 搅拌均匀, 离开5分钟。
- 把种子洗干净。仍在无菌条件下在干净的工作台上工作, 使用微移液器轻轻去除溶液, 并添加1毫升无菌水。重复此步骤五次。
- 在干净的长凳上的24孔板的每口井中加入1.5 毫升消毒的3% 含半村志-斯库格介质溶液。
- 在每口井中加入两个消毒种子。用两层副体将盖子贴在24孔板上。
- 将24孔板转移到设定在23.5°c 的生长室, 采用 100μmol m−2-1 白光进行 12-h-–2-1白光, 孵育 14天.
3. 星团瘤的显微观察
- 将含有半 murashige-skoog 介质溶液的30% 升放入玻璃滑块的中心 (尺寸: 76x26 毫米, 厚度: 1.0-1.2 mm)。
- 用解剖剪刀从14天的幼苗中取出子叶。漂浮子叶与观察侧面朝上的溶液下降。
- 根据我们以前的方法13制备子叶标本。本质上, 将溶液的30μl 放置在盖板玻璃的中心 (尺寸: 18x18 mm, 厚度: 0.12-0.17 mm)。将盖板玻璃倒置, 轻轻地将其放置在子叶上。使用无绒毛组织擦拭多余的缓冲液。
- 在共聚焦激光显微镜的舞台上设置一个标本, 并选择聚集保护单元, 使用明亮的现场照明进行观察。
- 根据显微镜制造商的说明, 获取荧光标记的细胞内结构的共聚焦图像。
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Representative Results
本文提出了一种简单的方法, 在a. thaliana幼苗中, 用含蔗糖的介质溶液诱导气孔聚集的方法。在含蔗糖的介质溶液中生长的聚集保护细胞 (图 1b) 的叶绿体大于在无蔗糖控制条件下生长的保护细胞 (图 1a)。叶绿体的扩大得到了叶绿体标记 ct-gfp11和叶绿素自体荧光 (图 1c-f) 的证实, 表明蔗糖处理导致淀粉颗粒积累。通过蔗糖溶液吸收叶绿体。此外, gff-tub612的共聚焦观察显示, 即使在经过蔗糖处理的聚集保护细胞中, 皮质微管也是径向定向的, 就像在无蔗糖控制条件下的间隔保护细胞中的皮质微管一样 (图 2)。这些观察表明, 蔗糖诱导的聚集保护细胞对皮质微管和纤维素微纤维有一个正常的方向, 使气孔打开, 以响应环境线索9。
图 1: 用含蔗糖的培养基溶液处理的聚集保护细胞中的叶绿体.明亮的场(a, b)、叶绿体基质标记 ct-gfp (c, d)和叶绿素自荧光 (e, f) 在无糖控制条件下生长的保护细胞图像 ( a、c、e )和3% 蔗糖条件下 (b, d, f)。刻度条 = 10μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 用蔗糖溶液处理的聚集保护细胞中的皮质微管.在无糖对照 ( a)和3% 蔗糖条件下 (b)的保护细胞用 gff-tub6 标记的皮质微管。刻度条 = 10μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
我们提出了用含蔗糖介质溶液浸没处理诱导刺五幼苗聚集气孔的方案。如图所示, 这种方法是非常简单的, 不需要专门的技能, 但可以有效地诱导聚集气孔。超过45% 的保护细胞聚集在3% 含蔗糖的介质溶液中 (平均值超过20个独立观察)6。此外, 该实验系统可直接应用于转基因或突变线, 如表达 ct-gfp (图 1) 或 gfp-tub6 (图 2) 所示。虽然这里只显示快照图像, 但也可以在气孔发育过程中执行时间顺序观测。
请注意, 这种方法是基于人工外质治疗, 所以我们不能排除的可能性, 与气孔分布没有直接关系的现象是由蔗糖溶液浸泡治疗引起的。事实上, 保护细胞叶绿体通过治疗扩大 (图 1)。这可能是由于淀粉颗粒通过蔗糖溶液的吸收在叶绿体中积累。此外, 在蔗糖诱导的聚集保护细胞9中观察到较小的气孔孔, 提示蔗糖介导的高渗应力抑制气孔开口。然而, 皮质微管的径向方向保持不变 (图 2)。此外, 聚集保护细胞的气孔显著增加, 以响应 fusicoccin 治疗, 如间隔气孔9的情况。因此, 尽管有必要根据您的研究目的仔细判断此实验模型系统是否有用, 但我们的系统将提供有关气孔分布和反应之间关系的有见地的信息。
如导言所述, 糖溶液治疗可能会降低细胞壁完整性, 导致用于气孔分化的关键基因产品 (如转录因子) 泄漏到邻近的表皮细胞。我们假设这些基因产物的蔗糖诱导的异位定位会导致聚集气孔。然而, 这一工作假设并没有得到分子生物学证据的充分支持。筛选不含糖的突变体将是澄清糖溶液诱导气孔聚集的分子机制的一种很有希望的方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢长泽一郎教授对我们工作的善意支持。这项工作得到了日本科学促进会 kakenh给定 17 kh给定和18H05492 的赠款、住友基金会为基础科学研究项目赠款提供的第160.146 笔赠款和佳能基金会向 t. h. h. 提供的赠款。这一实验系统是在 jps kakenh给定号26891006至 k. a. 的财政支持下开发的。我们感谢来自 edanz group (www.edanzediting.com/ac) 的 r比robis, msc 编辑了手稿草稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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