Summary
Målet med denne protokol er at vise hvordan man fremkalde grupperet spalteåbninger i kimbladene af Arabidopsis thaliana stiklinger af fordybelse behandling med en sukker-holdige medium løsning og hvordan man observere intracellulære strukturer som grønkorn og mikrotubuli i de grupperede guard celler ved hjælp af Konfokal laser mikroskopi.
Abstract
Spalteåbningernes bevægelse medierer plante gasudveksling, der er nødvendig for fotosyntese og transpiration. Spalteåbningernes åbning og lukning er gennemført af en betydelig stigning og fald i vagt cellevolumen, henholdsvis. Fordi shuttle transport af ioner og vand opstår mellem guard celler og større tilstødende epidermale celler under spalteåbningernes bevægelighed, anses fordelte fordelingen af plante spalteåbninger en optimal fordeling til spalteåbningernes bevægelse. Eksperimentelle systemer for forstyrrende fordelte mønster af spalteåbninger er nyttigt at undersøge afstand mønster betydning. Flere vigtige gener forbundet med den fordelte spalteåbningernes distribution er blevet identificeret og grupperet spalteåbninger kan være eksperimentelt fremkaldt ved at ændre disse gener. Alternativt kan grupperet spalteåbninger også induceret af eksogene behandlinger uden genetisk modifikation. I denne artikel beskriver vi en simpel induktion system for grupperet spalteåbninger i Arabidopsis thaliana frøplanter ved nedsænkning behandling med en mellemlang løsning, der indeholder saccharose. Vores metode er nem og direkte anvendelige til transgene eller mutant linjer. Større kloroplaster er præsenteret som en celle biologiske kendetegnende for saccharose-induceret grupperet guard celler. Derudover er et repræsentativt Konfokal mikroskopisk billede af kortikale mikrotubuli vist som et eksempel på intracellulære observation af grupperet guard celler. Den radiale orientering af kortikale mikrotubuli bevares i klynger guard celler som fordelte guard celler i kontrol betingelser.
Introduction
Plante stomien er et vigtigt organ for gasudveksling for fotosyntese og transpiration, og spalteåbningernes bevægelse opnås ved væsentlige ændringer i vagt celler gennem ion-drevet optagelse og udtømning af vand. Under et mikroskop, kan vi iagttage en fordelte fordeling mønster af spalteåbninger på flader af blade og stængler. Denne afstand distribution af spalteåbninger anses for at hjælpe spalteåbningernes bevægelse, som er reguleret af ion og vand udveksling mellem guard celler og omkringliggende epidermale celler1,2. Eksperimentelle induktion systemer for grupperet spalteåbningerne er nyttige for at undersøge betydningen af fordelte fordelingen af spalteåbninger.
Det er blevet rapporteret, at rumlig klynger af spalteåbninger kan være fremkaldt ved genetisk modifikation af centrale gener for vagt celle differentiering3,4 eller behandling med et kemisk stof5. Vi rapporterede også, at nedsænkning behandling med en mellemlang løsning suppleres med sukker herunder saccharose, glucose, og fructose forårsaget spalteåbningernes klyngedannelse i kimbladene Arabidopsis thaliana frøplanter6. Reduceret callose i nye cellevægge adskiller meristemoids og epidermal celler blev observeret i saccharose-behandlede Kimblad epidermis, tyder på at saccharose løsning fordybelse behandling negativt påvirker cellevæg, der forhindrer udslip og ektopiske handling af centrale genprodukter guard celle differentiering (fx transkriptionsfaktorer) mod tilstødende epidermale celler6. En lignende ordning blev foreslået fra undersøgelser på gsl8/chor mutanter7,8. Vores eksperimentel system for reproducerbare induktion af grupperet spalteåbninger ved hjælp af saccharose-holdige medium løsning er ganske nemt og billigt. Det kan også bruges til at undersøge intracellulære strukturer som organeller og cytoskeleton i klyngeform guard celler når de påføres transgene linjer udtrykker fluorescerende markører at etiketten intracellulære strukturer9, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af 3% saccharose-holdige 1/2 Murashige-Skoog Medium opløsning
- Tilføje 1,1 g Murashige-Skoog medium salte og 15 g saccharose til et bægerglas.
- Tilføj 490 mL destilleret vand og bland godt ved hjælp af et rør bar.
- PH indstilles til 5.8 ved hjælp af KOH.
- Fortyndes til 500 mL med destilleret vand og opløsningen overføres til en mellemstore flaske.
- Sterilisere løsningen ved autoklavering (121 ° C, 20 min). Hvis ikke anvendes straks, kan denne løsning opbevares ved 4 ° C efter sterilisation.
2. induktion af grupperet spalteåbninger af saccharose-holdige Medium løsning fordybelse behandling
- Sterilisere frøene.
- Forbered sterilisation løsning ved at tilføje 500 µL af 5% aktivt chlor NaClO løsning og 1 µL af 10% Triton X-100 til 500 µL sterilt vand.
- Anbring ca. 50 transgene A. thaliana frø bærer en fluorescerende markør såsom CT-normal god landbrugspraksis11 eller normal god landbrugspraksis-TUB612 ind i et 1,5-mL-rør.
- Der tilsættes 1 mL af 70% ethanol opløsning og bland godt ved at invertere fem gange. Orlov i 1 minut.
- Frøene vil synke til bunden af røret. På en ren bænk, forsigtigt fjerne de 70% ethanol ved hjælp af en mikropipette, og tilsættes 1 mL sterilisation. Bland godt ved invertering af fem gange og henstår i 5 min.
- Vask frøene. Stadig arbejder under aseptiske forhold på en ren bænk, forsigtigt fjerne løsningen ved hjælp af en mikropipette, og der tilsættes 1 mL sterilt vand. Gentag dette trin fem gange.
- Tilsættes 1,5 mL steriliseret 3% saccharose-holdige 1/2 Murashige-Skoog medium til hver brønd med en 24-godt plade på en ren bænk.
- Tilføje to steriliseret frø i hver brønd. Tape låget på 24-godt pladen ved hjælp af to lag af parafilm.
- Overføre 24-godt pladen til en vækst kammer sæt på 23,5 ° C med en 12-Hansen/12 lys-mørke cyklus ved hjælp af 100 µmol m−2 s1 hvidt lys og Inkuber i 14 dage.
3. mikroskopisk Observation af grupperet spalteåbninger
- Sted 30 µL af 3% saccharose-holdige 1/2 Murashige-Skoog medium løsning fra et godt af 24-godt pladen på midten af et glas dias (størrelse: 76 × 26 mm, tykkelse: 1.0-1.2 mm).
- Fjerne en Kimblad fra en 14 dage gamle sætteplante bruger dissekere saks. Flyde Kimblad med observation side opad på løsning drop.
- Forberede Kimblad modellen efter vores tidligere metode13. Det væsentlige, placere 30 µL af opløsningen på midten af et cover glas (størrelse: 18 × 18 mm, tykkelse: 0,12-0,17 mm). Drej dækslet glas hovedet og placere den på Kimblad forsigtigt. Aftørre overskydende buffer ved hjælp af en fnugfri serviet.
- Indstil et eksemplar på scenen af en Konfokal laser mikroskop og vælg grupperet guard celler til observation ved lysfelt belysning.
- Erhverve Konfokal billeder af fluorescently mærket intracellulære strukturer ifølge mikroskop producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her, er protokol for en simpel metode til overtalelse spalteåbningernes klynger med saccharose-holdige medium løsning i A. thaliana frøplanter blevet præsenteret. De grupperede guard celler dyrkes i saccharose-holdige medium løsning (figur 1B) har større grønkorn end vagt celler dyrkes i saccharose-gratis kontrol betingelser (figur 1A). Udvidelsen af grønkorn blev bekræftet med CT-normal god landbrugspraksis11, grønkornets stroma markør og klorofyl autofluorescence (figur 1C-F), hvilket tyder på at saccharose behandling resulterede i stivelse korn ophobning i den kloroplaster via saccharose løsning optagelse. Derudover viste Konfokal observation af normal god landbrugspraksis-TUB612 , kortikale mikrotubuli var radialt orienterede selv i saccharose-behandlede grupperet guard celler, som dem i fordelte guard celler i saccharose-gratis kontrol betingelser (figur 2). Disse observationer tyder på at de saccharose-induceret grupperet guard celler har en normal orientering for kortikale mikrotubuli og cellulose microfibrils at aktivere spalteåbningernes åbning i reaktion på miljømæssige stikord9.
Figur 1 : Grønkorn i klyngeform guard celler behandles med saccharose-holdige medium løsning. Lysfelt (A, B), grønkornets stroma markør CT-normal god landbrugspraksis (C, D), og klorofyl autofluorescence (E, F) billeder af guard celler dyrkes i sukker-fri kontrol betingelser (A, C, E) og 3% saccharose betingelser (B, D, F). Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Kortikale mikrotubuli i klyngeform guard celler behandles med rørsukkeropløsning. Kortikale mikrotubuli mærket med normal god landbrugspraksis-TUB6 af guard cells i sukker-fri kontrol (A) og grupperet guard celler i 3% saccharose betingelser (B). Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har præsenteret protokoller for induktion af grupperet spalteåbninger i A. thaliana frøplanter af fordybelse behandling med en mellemlang løsning, der indeholder saccharose. Som vist her, denne metode er meget enkel og kræver ingen specielle færdigheder, men effektivt kan fremkalde grupperet spalteåbningerne. Mere end 45% af guard celler er grupperet med 3% saccharose-holdige medium løsning (middelværdier af mere end 20 uafhængige observationer)6. Desuden, denne eksperimentelle system kan direkte anvendes til transgene eller mutant linjer som vist for transgene linjer udtryk for CT-normal god landbrugspraksis (figur 1) eller normal god landbrugspraksis-TUB6 (figur 2). Selv om kun snapshot billeder er vist her, ville det også være muligt at udføre tid-sekventielle observationer under spalteåbningernes udvikling.
Bemærk, at denne metode er baseret på en kunstig exogeneous behandling, så vi ikke kan udelukke muligheden for, at fænomener, der ikke er direkte relateret til den spalteåbningernes fordeling er forårsaget af saccharose løsning fordybelse behandling. Faktisk er guard celle kloroplaster udvidet ved behandling (figur 1). Dette kan være på grund af stivelse korn ophobning i grønkornene via saccharose løsning optagelse. Derudover blev en mindre spalteåbningernes blænde observeret i saccharose-induceret grupperet guard celler9, tyder på, at saccharose-medieret hyperosmotic stress undertrykt spalteåbningernes åbning. Ikke desto mindre, den radiale orientering af kortikale mikrotubuli blev opretholdt (figur 2). Spalteåbningernes blænden guard-celleområde grupperet øger desuden svar på fusicoccin behandling, som i tilfælde af fordelte spalteåbninger9. Således, selv om det vil være nødvendigt at nøje vurdere, om denne eksperimentelle modelsystem er nyttige afhængigt af din forskningsformål, vores system ville give indsigtsfulde oplysninger om forholdet mellem spalteåbningernes distribution og svar.
Som nævnt i indledningen, kan sukker løsning behandling mindske cellevæg integritet, hvilket resulterer i udsivning af nøglen genprodukter for spalteåbningernes differentiering (fx transkriptionsfaktorer) til tilstødende epidermale celler. Vi antager, at den saccharose-induceret ektopisk lokalisering af disse genprodukter, der forårsager klynger spalteåbninger. Men denne arbejdshypotese er ikke tilstrækkeligt understøttes af molekylære biologiske beviser. Screening for sukker-ufølsom mutanter ville være en lovende måde at præcisere de molekylære mekanismer bag sukker løsning-induceret spalteåbningernes klyngedannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Prof. Seiichiro Hasezawa hans venlige støtte til vores arbejde. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP'ER) KAKENHgrant numre 17K 19380 og 18 H 05492, fra Sumitomo instituttet for et tilskud til grundlæggende videnskab forskningsprojekter give nummer 160146, og The Canon Foundation T.H. Denne eksperimentelle system blev udviklet under en finansiel støtte fra JSP'ER KAKENHgrant antal 26891006 til K. A. Vi takker Robbie Lewis, MSc, fra Edanz gruppe (www.edanzediting.com/ac) til at redigere et udkast af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
