Summary
이 프로토콜의 목표는 포함 하는 설탕 중간 솔루션으로 집중 치료에 의해 애기 thaliana 묘 cotyledons 클러스터 stomata를 유도 하는 방법 및 엽록체와 같은 세포내 구조를 관찰 하는 방법 그리고 confocal를 사용 하 여 클러스터 된 가드 셀에 microtubules 레이저 현미경 검사 법.
Abstract
Stomatal 운동 중재 공장 가스 교환, 광합성과 증발을 위해 필수적 이다. Stomatal 열고 닫는 중요 한 증가 의해 달성 되 고 각각 가드 셀 볼륨 감소. 때문에 이온과 물의 셔틀 수송 가드 셀과 큰 이웃 상피 세포 간의 stomatal 운동 하는 동안, 식물 stomata의 간격된 분포 stomatal 움직임을 위해 최적의 배포를 간주 됩니다. Stomata의 간격된 패턴 perturbing에 대 한 실험 시스템은 간격 패턴의 의미를 검사 하는 데 유용 합니다. 간격된 stomatal 배포와 관련 된 몇 가지 핵심 유전자 확인 되었습니다, 그리고 클러스터 stomata를 실험적으로이 유전자를 변경 하 여 유도 될 수 있다. 또는 클러스터 stomata 또한 유전 수정 없이 exogenous 치료에 의해 유도 될 수 있다. 이 문서에서는, 우리 자당 포함 된 중간 솔루션으로 집중 치료에 의해 클러스터 stomata 애기 thaliana 묘 목에 대 한 간단한 유도 시스템을 설명합니다. 우리의 방법은 간단 하 고 유전자 변형 또는 돌연변이 라인에 직접 적용 합니다. 더 큰 엽록체 자당 유도 된 클러스터 가드 셀의 셀 생물 학적 특징으로 표시 됩니다. 또한, 대뇌 피 질의 microtubules의 대표적인 confocal 현미경 이미지 클러스터 된 가드 세포의 세포내 관찰의 예제로 표시 됩니다. 대뇌 피 질의 microtubules의 레이디얼 방향 간격된 가드 셀 제어 조건에서와 같이 클러스터 된 가드 셀에 유지 됩니다.
Introduction
공장 stoma는 광합성과 증발, 가스 교환에 대 한 필수적인 기관 이다 그리고 stomatal 운동 이온 기반 통풍 관 및 물의 출시를 통해 감시 세포에 중요 한 변화에 의해 수행 됩니다. 현미경, 우리는 나뭇잎과 줄기의 표면에는 stomata의 간격된 분포 패턴을 관찰할 수 있다. Stomata의이 간격된 분포 stomatal 운동, 가드 셀과 표 피 세포1,2이웃 간의 이온 그리고 물 교류에 의해 규제 됩니다 있도록 간주 됩니다. 클러스터 된 stomata에 대 한 실험 유도 시스템은 stomata의 간격된 분포의 중요성을 조사 하는 데 유용 합니다.
그것은 그 stomata의 공간 클러스터링 유도 될 수 있다 감시 세포 감 별 법3,4 또는5화학 복합 치료에 대 한 핵심 유전자의 유전 수정에 의해 보고 되었습니다. 우리는 또한 중간 솔루션으로 집중 치료 설탕 자당, 포도 당를 포함 하 여 보충 및과 당 발생 stomatal 클러스터링 cotyledons 애기 thaliana 묘6의에서 보고 했다. 자당 솔루션 집중 치료는 누설을 방지 하는 세포 벽을 부정적인 영향을 제안 자당 취급 떡 표 피에서 감소 callose meristemoids와 표 피 세포를 분리 하는 새로운 세포 벽에 관찰 하 고 표 피 인접으로 가드 세포 분화 (예: 녹음 방송 요인)에 대 한 주요 유전자 제품의 소성 행동6세포. 비슷한 메커니즘은 gsl8/쵸 돌연변이7,8에 대 한 연구에서 제안 했다. 자당 포함 된 중간 솔루션을 사용 하 여 클러스터 된 stomata의 재현 유도 대 한 우리의 실험 시스템은 매우 간단 하 고 저렴 한. 그것은 또한 세포 및 표현 형광 마커 그 레이블 세포내 구조9, 유전자 변형 라인에 적용 될 때 클러스터 된 가드 셀에 골격 같은 세포내 구조를 조사 하 사용할 수 있습니다. 10.
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Protocol
1. 3% 자당 포함 된 1/2 重 Skoog 중간 솔루션의 준비
- 비 커에 1.1 g 重 Skoog 중간 소금의 고 자당의 15 g을 추가 합니다.
- 490 mL 증류수를 추가 하 고 잘 저 어 막대를 사용 하 여 혼합.
- 코를 사용 하 여 5.8에 pH를 조정 합니다.
- 500 mL 증류수와 묽 게 하십시오 그리고 중간 병으로 솔루션을 전송.
- 압력가 마로 소독 (121 ° C, 20 분) 하 여 솔루션을 소독. 즉시 사용 하지이 솔루션 살 균 후 4 ° C에서 보관 될 수 있습니다.
2. 유도 자당을 포함 하 여 클러스터 된 Stomata의 중간 솔루션 집중 치료
- 씨앗을 소독.
- 5% 활성 염소 NaClO 솔루션의 500 µ L 10%의 1 µ L을 추가 하 여 살 균 솔루션 준비 500 µ L 살 균 물 트라이 톤 X-100.
- 장소 ca. 50 유전자 변형 A. thaliana 씨앗 1.5 mL 튜브에 CT GFP11 등 GFP TUB612 형광 마커를 들고.
- 잘 5 번을 반전 하 여 70% 에탄올 솔루션와 섞어 1 mL를 추가 합니다. 1 분 동안 둡니다.
- 씨는 튜브의 하단 싱크대 것입니다. 깨끗 한 벤치에 부드럽게 micropipette를 사용 하 여 70% 에탄올을 제거 하 고 살 균 솔루션의 1 mL을 추가. 5 번을 반전 하 여 잘 혼합 하 고 5 분 동안 둡니다.
- 씨앗을 씻어. 여전히 깨끗 한 벤치에 무 균 조건 하에서 작동, 부드럽게 micropipette를 사용 하 여 솔루션을 제거 하 고 살 균 물의 1 mL을 추가. 5 번이이 단계를 반복 합니다.
- 깨끗 한 벤치에 24-잘 접시의 각 우물을 소독된 3% 자당 포함 된 1/2 重 Skoog 중간 솔루션의 1.5 mL를 추가 합니다.
- 각 음에 두 소독된 씨앗을 추가 합니다. Parafilm의 두 레이어를 사용 하 여 24-잘 접시에 뚜껑 테이프.
- 100 µmol m−2의 − 1 흰색 빛을 사용 하 여 12/12-h 빛 어두운 주기와 성장 챔버 세트 23.5 ° C에서 24-잘 접시를 전송 하 고 14 일에 품 어.
3. 클러스터 된 Stomata의 현미경 관찰
- 3% 자당 포함 된 1/2 重 Skoog 중간 솔루션의 유리 슬라이드 중심에 24-잘 접시의 우물에서 장소 30 µ L (크기: 76 × 26 mm, 두께: 1.0-1.2 m m).
- 해가 위를 사용 하 여 14 일 된 묘에서 한 떡을 제거 합니다. 관찰 면이 솔루션 방울에는 떡을 부동.
- 우리의 이전 방법13에 따라 떡 견본을 준비 합니다. 기본적으로, 커버 유리의 센터에 솔루션의 30 µ L를 배치 (크기: 18 × 18 m m, 두께: 0.12-0.17 m m). 뒤집어서 커버 유리를 부드럽게는 떡에 넣습니다. 보풀이 티슈를 사용 하 여 초과 버퍼를 닦아내십시오.
- 공초점 레이저 현미경의 스테이지 표본을 설정 하 고 밝은 분야 조명을 사용 하 여 관찰에 대 한 클러스터 된 가드 셀을 선택 합니다.
- Confocal 현미경 제조업체의 지침에 따라 붙일 이라는 세포내 구조 이미지를 취득 합니다.
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Representative Results
여기, A. thaliana 묘에 자당 포함 된 중간 솔루션 stomatal 클러스터링 유도의 간단한 방법에 대 한 프로토콜 제시 하고있다. 자당 포함 된 중간 솔루션 (그림 1B) 성장 클러스터 된 가드 셀 가드 셀 자당 무료 제어 조건 (그림 1A)에서 성장 보다 더 큰 엽록체 있다. 엽록체의 확대와 CT GFP11, 엽록체 스트로 마 마커, 엽록소 autofluorescence (그림 1C-F), 자당 치료에서 전 분 곡물 축적 결과 제안 확인 됐다 고 엽록체를 통해 자당 솔루션 이해. 또한, GFP TUB612 의 confocal 관찰 대뇌 피 질의 microtubules 광선도 자당 치료 클러스터 된 가드 셀, 자당 무료 제어 조건 (그림 2)에서 간격된 가드 셀에 같은 지향 했다 밝혔다. 이러한 관측 클러스터 된 가드 자당 유도 된 세포는 대뇌 피 질의 microtubules 및 환경 신호9응답에서 stomatal 개통 수 있도록 셀 루 로스 microfibrils에 대 한 정상적인 방향 제안.
그림 1 : 클러스터 된 가드 세포에 엽록체 자당 포함 된 중간 솔루션으로 치료. 밝은 분야 (A, B), 엽록체 스트로 마 마커 CT GFP (C, D), 및 설탕 무료 제어 조건 (A, C, E) 및 3% 자당 조건 (B, D, F)에서 성장 하는 가드 세포의 엽록소 autofluorescence (E, F) 이미지. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 클러스터 된 가드 셀에 대뇌 피 질의 microtubules 자당 솔루션 취급. GFP-TUB6 설탕 무료 제어 (A) 에서 guard cells 및 3% 자당에서 클러스터 된 가드 셀으로 표시 하는 대뇌 피 질의 microtubules 조건 (B). 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 제시한 클러스터 stomata의 유도 대 한 프로토콜 A. thaliana 묘에 자당 포함 된 중간 솔루션으로 집중 치료. 다음과 같이,이 방법은 매우 간단 하 고 없는 전문된 기술이 필요로 하지만 효율적으로 클러스터 stomata를 일으킬 수 있다. 가드 셀의 45% 이상 3% 자당 포함 된 클러스터는 중간 솔루션 (20 개 이상의 독립적인 관측의 평균 값)6. 또한,이 실험 시스템 적용할 수 있는 직접 유전자 변형 또는 돌연변이 라인 유전자 변형 라인 표현 CT-GFP (그림 1) 또는 GFP-TUB6 (그림 2)와 같이. 비록만 스냅숏 이미지는 여기에 표시 됩니다, 그것은 또한 stomatal 개발 하는 동안 시간 연속 관측을 수행할 수 것입니다.
참고 우리 자당 솔루션 집중 치료에 의해 stomatal 유통에 직접 관련 되지 않는 현상 발생 가능성을 제외 수 없습니다 그래서이 방법은 인공 exogeneous 치료에 기반 합니다. 사실, 가드 세포 엽록체 치료 (그림 1)에 의해 확대 됩니다. 자당 솔루션 도입 통해 엽록체에서에서 전 분 곡물 축적으로 인해 수 있습니다. 또한, 작은 stomatal 조리개 클러스터 된 가드 셀 자당 유도 된9, 자당 중재 hyperosmotic 스트레스 stomatal 개통 억제 제안에 관찰 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 대뇌 피 질의 microtubules의 레이디얼 방향 (그림 2)를 유지 했다. 또한, 클러스터 된 가드 셀 stomatal 조리개 간격된 stomata9의 경우 fusicoccin 치료에 크게 증가합니다. 따라서,이 실험 모델 시스템은 연구 목적에 따라 유용 여부를 신중 하 게 판단 해야 하는 것입니다, 하지만 우리의 시스템 stomatal 분포와 응답 사이의 관계에 관한 통찰력 있는 정보를 제공할 것 이다.
소개에서 설명 했 듯이, 설탕 솔루션 치료 stomatal 차별화 (예: 녹음 방송 요인)을 인접 한 표 피 세포에 대 한 주요 유전자 제품의 누설의 결과로 세포 벽 무결성을 줄일 수 있습니다. 이러한 유전자 제품의 자당 유도 된 소성 지역화 하면 클러스터 stomata는 가정 합니다. 그러나,이 작업 가설 분자 생물학적 증거에 의해 충분히 지원 되지 않습니다. 설탕을 구분 하지 않는 돌연변이 대 한 심사 설탕 솔루션 유도 stomatal 클러스터링 기본 분자 메커니즘을 명확히 하는 유망한 방법을 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 우리의 일의 그의 종류 지원을 위한 교수 Seiichiro Hasezawa에 감사입니다. 이 작품은 과학 진흥 (JSP) KAKENHgrant 숫자 17 K 19380 18 H 05492, 기본적인 과학 연구 프로젝트에 대 한 보조금은 스미 토모 재단에서 부여 번호 160146, 및 캐논 재단 남에 대 한 일본 사회에서 교부 금에 의해 지원 되었다 이 실험적인 시스템 K. a JSP KAKENHgrant 번호 26891006에서에서 재정 지원 아래 개발 되었다 우리는 로비 루이스, MSc, 원고의 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac)에서 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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