Summary
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को प्रदर्शित करने के लिए कैसे एक शर्करा युक्त माध्यम समाधान के साथ विसर्जन उपचार द्वारा Arabidopsis थालियाना अंकुरों के cotyledons में संकुल stomata प्रेरित करने के लिए और कैसे intracellular संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए इस तरह chloroplasts और फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी का उपयोग संकुल गार्ड कोशिकाओं में microtubules.
Abstract
Stomatal आंदोलन मध्यस्थता संयंत्र गैस विनिमय, जो प्रकाश संश्लेषण और transpiration के लिए आवश्यक है. Stomatal खोलने और बंद एक महत्वपूर्ण वृद्धि द्वारा पूरा कर रहे है और गार्ड सेल मात्रा में कमी, क्रमशः । क्योंकि आयनों और पानी की शटल परिवहन stomatal आंदोलन के दौरान रक्षक कोशिकाओं और बड़ा पड़ोसी एपिडर्मल कोशिकाओं के बीच होता है, संयंत्र stomata के स्थान पर वितरण stomatal आंदोलन के लिए एक इष्टतम वितरण माना जाता है । perturbing के लिए प्रायोगिक प्रणालियों stomata के स्थान पैटर्न रिक्ति पैटर्न के महत्व की जांच करने के लिए उपयोगी होते हैं । कई प्रमुख अंतरिक्ष stomatal वितरण के साथ जुड़े जीन की पहचान की गई है, और संकुल stomata प्रयोगात्मक इन जीन फेरबदल द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, संकुल stomata भी आनुवंशिक संशोधन के बिना exogenous उपचार द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । इस लेख में, हम एक सुक्रोज-युक्त माध्यम समाधान के साथ विसर्जन उपचार द्वारा Arabidopsis थालियाना अंकुर में संकुल stomata के लिए एक सरल प्रेरण प्रणाली का वर्णन । हमारे विधि आसान है और सीधे ट्रांसजेनिक या उत्परिवर्ती लाइनों के लिए लागू है । बड़ा chloroplasts सुक्रोज-प्रेरित संकुल रक्षक कोशिकाओं के एक सेल जैविक बानगी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । इसके अलावा, cortical microtubules के एक प्रतिनिधि फोकल माइक्रोस्कोपी छवि संकुल रक्षक कोशिकाओं के intracellular अवलोकन का एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है । cortical microtubules के रेडियल अभिविन्यास नियंत्रण की स्थिति में अंतरिक्ष गार्ड कोशिकाओं में के रूप में संकुल गार्ड कोशिकाओं में बनाए रखा है.
Introduction
संयंत्र stoma प्रकाश संश्लेषण और transpiration के लिए गैस विनिमय के लिए एक आवश्यक अंग है, और stomatal आंदोलन आयन के माध्यम से गार्ड कोशिकाओं में महत्वपूर्ण परिवर्तन द्वारा पूरा किया है, और पानी की रिहाई संचालित । एक खुर्दबीन के नीचे, हम पत्तियों और तनों की सतहों पर stomata के एक स्थान पर वितरण पैटर्न का पालन कर सकते हैं । stomata के इस स्थान पर वितरण stomatal आंदोलन, जो आयन और गार्ड कोशिकाओं और पड़ोसी एपिडर्मल कोशिकाओं1,2के बीच पानी के आदान प्रदान द्वारा विनियमित है मदद करने के लिए माना जाता है । संकुल stomata के लिए प्रायोगिक प्रेरण प्रणालियों stomata के स्थान पर वितरण के महत्व की जांच के लिए उपयोगी होते हैं ।
यह बताया गया है कि stomata के स्थानिक clustering गार्ड सेल भेदभाव3,4 या एक रासायनिक यौगिक5के साथ उपचार के लिए महत्वपूर्ण जीन के आनुवंशिक संशोधन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । हम यह भी बताया कि सुक्रोज, ग्लूकोज सहित शर्करा के साथ पूरक एक मध्यम समाधान के साथ विसर्जन उपचार, और फ्रुक्टोज कारण stomatal clustering में cotyledons Arabidopsis थालियाना अंकुर6. नई कोशिका दीवारों में कम callose meristemoids और एपिडर्मल कोशिकाओं को अलग सुक्रोज-इलाज cotyledon एपिडर्मिस में मनाया गया था, सुझाव है कि सुक्रोज समाधान विसर्जन उपचार नकारात्मक कोशिका दीवार को प्रभावित करता है, जो रिसाव को रोकता है और गार्ड सेल भेदभाव के लिए प्रमुख जीन उत्पादों की अस्थानिक कार्रवाई (उदाहरण के लिए संलेखन कारकों) आसंन एपिडर्मल कोशिकाओं6की ओर । एक ऐसी ही व्यवस्था gsl8/चौर म्यूटेंट7,8पर अध्ययन से सुझाया गया था । सुक्रोज युक्त मध्यम समाधान का उपयोग संकुल stomata के reproducible प्रेरण के लिए हमारी प्रायोगिक प्रणाली काफी आसान और सस्ता है । यह भी ऐसे organelles के रूप में intracellular संरचनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और संकुल रक्षक कोशिकाओं में cytoskeleton फ्लोरोसेंट मार्करों कि लेबल intracellular9संरचनाओं व्यक्त ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए आवेदन किया, 10.
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Protocol
1. तैयारी 3% सुक्रोज-युक्त 1/2 Murashige-Skoog मध्यम समाधान
- एक यूरिन के लिए Murashige-Skoog मीडियम साल्ट और 15 ग्राम सुक्रोज के १.१ ग्राम जोड़ें ।
- आसुत पानी की ४९० मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से एक बार हलचल का उपयोग कर मिश्रण ।
- ५.८ KOH का उपयोग करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
- आसुत जल के साथ ५०० मिलीलीटर को पतला और एक मध्यम बोतल में समाधान हस्तांतरण ।
- autoclaving (१२१ डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) द्वारा समाधान निष्फल । अगर तुरंत इस्तेमाल नहीं किया, यह समाधान नसबंदी के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ।
2. संकुल Stomata के सुक्रोज-युक्त मध्यम समाधान विसर्जन उपचार द्वारा प्रेरण
- बीज निष्फल ।
- ५०० µ l को जोड़कर नसबंदी समाधान तैयार करना 5% सक्रिय क्लोरीन NaClO समाधान और 1 µ l के 10% ट्राइटन X-१०० से ५०० µ l बाँझ पानी.
- ca. ५० ट्रांसजेनिक a. थालियाना एक १.५-एमएल ट्यूब में सीटी-GFP11 या GFP-TUB612 जैसे एक फ्लोरोसेंट मार्कर ले जाने के बीज प्लेस ।
- ७०% इथेनॉल समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें और पांच बार पलटने से अच्छी तरह से मिश्रण । 1 मिनट के लिए छोड़ दें ।
- बीज ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक जाएगा । एक साफ पीठ पर, धीरे से ७०% इथेनॉल एक micropipette का उपयोग कर हटा दें, और नसबंदी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें । पांच बार पलटने से अच्छी तरह मिलाएं और 5 मिनट के लिए छोड़ दें ।
- बीज धो लें । अभी भी एक स्वच्छ पीठ पर अपूतित शर्तों के तहत काम कर रहे, धीरे से एक micropipette का उपयोग कर समाधान निकालें, और बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें । इस चरण को पांच बार दोहराएं ।
- १.५ मिलीलीटर की निष्फल 3% सुक्रोज-युक्त 1/2 Murashige-Skoog मध्यम समाधान एक साफ बेंच पर एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं के लिए जोड़ें ।
- प्रत्येक कुआं में दो निष्फल बीज डालें । parafilm के दो परतों का उपयोग कर 24-well प्लेट पर ढक्कन टेप ।
- 24-well प्लेट एक 12-h/12-h के साथ २३.५ ° c पर सेट वृद्धि चैंबर के लिए स्थानांतरण १०० µmol एम− 2 एस− 1 सफेद प्रकाश और 14 दिनों के लिए मशीन का उपयोग कर ।
3. संकुल Stomata का सूक्ष्म अवलोकन
- प्लेस 30 µ एल के 3% सुक्रोज-युक्त 1/2 Murashige-Skoog एक गिलास स्लाइड के केंद्र पर 24 अच्छी तरह से प्लेट की एक अच्छी तरह से मध्यम समाधान (आकार: ७६ × 26 मिमी, मोटाई: 1.0-1.2 मिमी) ।
- एक 14 दिन पुराने कीट कैंची का उपयोग कर अंकुर से एक cotyledon निकालें । समाधान ड्रॉप पर ऊपर का सामना करना पड़ अवलोकन पक्ष के साथ cotyledon फ्लोट ।
- हमारे पिछले विधि13के अनुसार cotyledon नमूना तैयार करें । मूलतः, एक कवर ग्लास के केंद्र पर समाधान के 30 µ एल जगह (आकार: 18 × 18 मिमी, मोटाई: 0.12-0.17 मिमी) । कवर गिलास उल्टा मुड़ें और इसे धीरे cotyledon पर रखें । एक लिंटर से मुक्त ऊतक का उपयोग कर अतिरिक्त बफर पोंछ ।
- एक फोकल लेजर माइक्रोस्कोप के मंच पर एक नमूना सेट और उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग कर अवलोकन के लिए संकुल रक्षक कोशिकाओं का चयन करें ।
- माइक्रोस्कोप निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लोरोसेंट बला intracellular संरचनाओं के फोकल छवियों का अधिग्रहण ।
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Representative Results
यहाँ, एक थालियाना अंकुर में सुक्रोज युक्त मध्यम समाधान के साथ stomatal clustering उत्प्रेरण की एक सरल विधि के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है । संकुल रक्षक कोशिकाओं सुक्रोज-युक्त मध्यम समाधान में उगाया (चित्रा 1ख) सुक्रोज-मुक्त नियंत्रण शर्तों (चित्रा 1ए) में उगाया रक्षक कोशिकाओं की तुलना में बड़ा chloroplasts है । chloroplasts की वृद्धि सीटी-GFP11, एक chloroplast स्ट्रोमा मार्कर के साथ की पुष्टि की थी, और क्लोरोफिल autofluorescence (चित्रा 1सी-एफ), सुझाव है कि सुक्रोज उपचार में स्टार्च अनाज संचय के परिणामस्वरूप chloroplasts वाया सुक्रोज समाधानी. इसके अलावा, GFP के फोकल अवलोकन-TUB612 से पता चला कि cortical microtubules रेडियल सुक्रोज में भी उंमुख थे संकुल रक्षक कोशिकाओं का इलाज किया, सुक्रोज में अंतरिक्ष गार्ड कोशिकाओं में उन लोगों की तरह मुक्त नियंत्रण शर्तों (चित्रा 2) । इन टिप्पणियों का सुझाव है कि सुक्रोज-प्रेरित संकुल रक्षक कोशिकाओं cortical microtubules और फाइबर microfibrils के लिए एक सामांय अभिविंयास है पर्यावरण cues9के जवाब में stomatal खोलने को सक्षम करने के लिए ।
चित्रा 1 : संकुल रक्षक कोशिकाओं में Chloroplasts सुक्रोज युक्त मध्यम समाधान के साथ इलाज किया । उज्ज्वल क्षेत्र (ए, बी), chloroplast स्ट्रोमा मार्कर सीटी-GFP (सी, डी), और क्लोरोफिल autofluorescence (ई, एफ) रक्षक कोशिकाओं की छवियां चीनी मुक्त नियंत्रण की स्थिति में हो ( ए, सी, ई) और 3% सुक्रोज शर्तों (बी, डी, एफ)। स्केल बार्स = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : संकुल रक्षक कोशिकाओं में Cortical microtubules सुक्रोज समाधान के साथ इलाज किया । Cortical microtubules ने शुगर फ्री कंट्रोल (ए) और संकुल गार्ड कोशिकाओं में 3% सुक्रोज शर्तों (बी)में गार्ड कोशिकाओं के GFP-TUB6 के साथ बला की । स्केल बार्स = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हम एक सुक्रोज-युक्त माध्यम समाधान के साथ विसर्जन उपचार द्वारा एक. थालियाना अंकुर में संकुल stomata की प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । जैसा कि यहां दिखाया गया है, इस विधि बहुत सरल है और कोई विशेष कौशल की आवश्यकता है, लेकिन कुशलतापूर्वक संकुल stomata प्रेरित कर सकते हैं । गार्ड कोशिकाओं से अधिक ४५% 3% सुक्रोज-युक्त मध्यम समाधान (20 से अधिक स्वतंत्र टिप्पणियों का मतलब मान) के साथ संकुल रहे हैं6. इसके अलावा, इस प्रायोगिक प्रणाली सीधे ट्रांसजेनिक या उत्परिवर्ती लाइनों के रूप में सीटी-GFP (चित्रा 1) या GFP-TUB6 (चित्रा 2) एक्सप्रेस ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए दिखाया के लिए लागू किया जा सकता है । केवल स्नैपशॉट छवियाँ यहाँ दिखाए गए हैं, यद्यपि यह भी stomatal विकास के दौरान समय-क्रमिक अवलोकन करने के लिए संभव होगा ।
ध्यान दें कि इस विधि एक कृत्रिम exogeneous उपचार पर आधारित है, इसलिए हम संभावना है कि सीधे stomatal वितरण से संबंधित नहीं है सुक्रोज समाधान विसर्जन उपचार के कारण होते है बाहर नहीं कर सकते । दरअसल, गार्ड सेल chloroplasts (चित्रा 1) के इलाज से बढ़े हैं । यह सुक्रोज समाधान के माध्यम से chloroplasts में स्टार्च अनाज संचय के कारण हो सकता है । इसके अलावा, एक छोटे stomatal एपर्चर सुक्रोज-प्रेरित संकुल रक्षक कोशिकाओं9में मनाया गया था, सुझाव है कि सुक्रोज मध्यस्थता hyperosmotic तनाव दबा stomatal खोलने. फिर भी, cortical microtubules के रेडियल अभिविन्यास (चित्रा 2) बनाए रखा गया था । इसके अलावा, संकुल रक्षक कोशिकाओं के stomatal एपर्चर काफी fusicoccin उपचार के जवाब में बढ़ जाती है, के रूप में अंतरिक्ष stomata9के मामले में । इस प्रकार, हालांकि यह ध्यान से ंयायाधीश आवश्यक होगा कि इस प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली अपने अनुसंधान प्रयोजनों के आधार पर उपयोगी है, हमारी प्रणाली व्यावहारिक stomatal वितरण और प्रतिक्रिया के बीच संबंधों के विषय में जानकारी प्रदान करेगा ।
के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, चीनी समाधान उपचार कोशिका दीवार अखंडता कम हो सकता है, stomatal भेदभाव के लिए प्रमुख जीन उत्पादों के रिसाव में जिसके परिणामस्वरूप (प्रतिलेखन कारकों) आसंन एपिडर्मल कोशिकाओं को । हम मानते है कि इन जीन उत्पादों की सुक्रोज प्रेरित अस्थानिक स्थानीयकरण संकुल stomata का कारण बनता है । तथापि, इस कार्य परिकल्पना पर्याप्त आणविक जैविक सबूत के द्वारा समर्थित नहीं है । चीनी के लिए स्क्रीनिंग असंवेदनशील म्यूटेंट एक होनहार तरीका आणविक चीनी समाधान अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट stomatal clustering प्रेरित होगा ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम अपने काम के अपने तरह के समर्थन के लिए प्रो Seiichiro Hasezawa के लिए आभारी हैं । यह काम विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (JSPS) KAKENHgrant संख्या 17K19380 और 18H05492, बुनियादी विज्ञान अनुसंधान परियोजनाओं अनुदान संख्या १६०१४६ के लिए एक अनुदान के लिए सुमितोमो फाउंडेशन से, और कैंयन फाउंडेशन T.H. करने के लिए यह प्रायोगिक प्रणाली JSPS KAKENHgrant संख्या २६८९१००६ से कश्मीर के एक वित्तीय सहायता के अंतर्गत विकसित की गई थी. हम Edanz समूह (www.edanzediting.com/ac) से रोबी लुईस, एमएससी, धंयवाद पांडुलिपि के एक मसौदे के संपादन के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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