Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist zu zeigen, wie induzieren gruppierte Spaltöffnungen in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer zuckerhaltigen Lösung für mittlere und intrazelluläre Strukturen wie Chloroplasten beobachten und Mikrotubuli in der gruppierten Schließzellen mit konfokale laser-Mikroskopie.
Abstract
Stomata Bewegung vermittelt Gasaustausch Pflanze, die für die Photosynthese und Transpiration ist. Stomata öffnen und Schließen erfolgt durch eine deutliche Steigerung und Abnahme bzw. Guard Zellvolumen. Da shuttle-Transport von Ionen und Wasser während der Stomata Bewegung zwischen Schließzellen und größeren benachbarten Epidermiszellen erfolgt, gilt die Abstand Verteilung der Pflanze Spaltöffnungen eine optimale Verteilung für die Stomata Bewegung. Experimentelle Systeme für sind der Abstand Musters der Spaltöffnungen sind nützlich, um den Abstand Muster Bedeutung zu prüfen. Mehrere wichtige Gene verbunden mit dem Abstand Stomata Vertrieb wurden identifiziert und gruppierte Spaltöffnungen experimentell durch die Veränderung dieser Gene induziert werden können. Gruppierte Spaltöffnungen können alternativ auch durch exogene Behandlungen ohne gentechnische Veränderung induziert werden. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Induktionssystem für gruppierte Spaltöffnungen in Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer Saccharose-haltige Mittel Lösung. Unsere Methode ist einfach und unmittelbar zu transgenen oder mutierten Linien. Größere Chloroplasten werden als biologische Zelle Markenzeichen der Saccharose-induzierte gruppierten Schließzellen vorgestellt. Darüber hinaus ist ein repräsentatives konfokale mikroskopische Bild der kortikalen Mikrotubuli der intrazellulären Beobachtung von gruppierten Schließzellen exemplarisch dargestellt. Die radiale Ausrichtung der kortikalen Mikrotubuli wird in gruppierten Schließzellen wie angeordneten Schließzellen in Kontrolle Bedingungen beibehalten.
Introduction
Die Pflanze Stoma ist ein wesentliches Organ für Gasaustausch für Photosynthese und Transpiration und Stomata Bewegung wird durch Veränderungen im Schließzellen durch Ionen-gesteuerte Aufnahme und Abgabe von Wasser erreicht. Unter dem Mikroskop können wir beobachten, ein Abstand Verteilungsmuster von Spaltöffnungen auf der Oberfläche der Blätter und Stängel. Dieser Abstand Verteilung der Spaltöffnungen wird als Stomata Bewegung helfen, die von Wasser und Ionen-Austausch zwischen den Schließzellen und den angrenzenden Epidermiszellen1,2geregelt ist. Experimentellen Induktion Systeme für gruppierte Spaltöffnungen eignen sich für die Untersuchung der Bedeutung der Abstand Verteilung der Spaltöffnungen.
Es wurde berichtet, dass räumliche Bündelung von Spaltöffnungen durch gentechnische Veränderung von Schlüsselgene für Guard Zelle Differenzierung3,4 oder Behandlung mit einer chemischen Verbindung5induziert werden kann. Wir haben auch berichtet, dass Immersion Behandlung mit einer mittleren Lösung mit Zucker Saccharose, Glukose, einschließlich ergänzt und Fruktose verursacht Stomata clustering in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge6. Reduzierte Kallose in neue Zellwänden, die Trennung von Meristemoids und Epidermiszellen beobachtet in der Saccharose behandelt Keimblattes Epidermis, was darauf hindeutet, dass Saccharose Lösung eintauchen Behandlung wirkt sich negativ auf die Zellwand, die verhindert das Auslaufen und ektopische Wirkung der Schlüssel-Genprodukte für Guard-Zell-Differenzierung (z. B. Transkriptionsfaktoren) gegenüber angrenzenden epidermalen Zellen6. Ein ähnlicher Mechanismus wurde von Studien über die gsl8/Chor Mutanten7,8vorgeschlagen. Unsere Experimentiersystem für reproduzierbare Induktion von gruppierten Spaltöffnungen mit Saccharose-haltige Mittel Lösung ist ganz einfach und billig. Es kann auch verwendet werden, zu untersuchen, intrazelluläre Strukturen wie Organellen und dem Zytoskelett in die gruppierten Schließzellen bei transgenen Linien mit dem Ausdruck fluoreszierenden Marker, dass Label intrazellulären Strukturen9, 10.
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Protocol
1. Vorbereitung von 3 % Saccharose-haltige 1/2 Murashige-Skoog mittlere Lösung
- Hinzu kommt ein Becherglas 1,1 g Murashige Skoog mittlere Salze und 15 g Saccharose.
- 490 mL destilliertem Wasser und mischen Sie gut mit einer rühren.
- Stellen Sie den pH-Wert auf 5,8 mit KOH.
- Bis 500 mL mit destilliertem Wasser verdünnen und die Lösung in eine mittlere Flasche übertragen.
- Sterilisieren Sie die Lösung durch Autoklavieren (121 ° C, 20 min). Wenn nicht sofort verwendet, kann diese Lösung nach der Sterilisation bei 4 ° C aufzubewahren.
(2) Induktion von gruppierten Spaltöffnungen von Saccharose-haltige Mittel Lösung eintauchen Behandlung
- Sterilisieren Sie die Samen.
- Bereiten Sie die Sterilisation Lösung durch Zugabe von 500 µL 5 % Aktivchlor NaClO Lösung und 1 µL 10 % Triton x-100, 500 µL sterilem Wasser.
- Legen Sie ca. 50 transgenen A. Thaliana Samen tragen einen fluoreszierenden Marker wie CT-GFP11 oder GLP-TUB612 in eine 1,5-mL-Tube.
- Fügen Sie 1 mL 70 % igen Ethanol Lösung und Mischung gut durch fünf mal umdrehen. Lassen Sie für 1 Minute.
- Der Samen werden auf den Boden des Röhrchens sinken. Auf einer sauberen Werkbank vorsichtig entfernen Sie das 70 % Ethanol mit einer Mikropipette und fügen Sie 1 mL der Lösung der Sterilisation. Mischen Sie gut durch fünf mal umdrehen und 5 min warten.
- Waschen Sie die Samen. Entfernen Sie die Lösung mit einer Mikropipette arbeiten noch unter aseptischen Bedingungen an einer sauberen Werkbank, sanft und geben Sie 1 mL sterilem Wasser hinzu. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf Mal.
- 1,5 mL sterilisiert 3 % Saccharose-haltige 1/2 Murashige Skoog mittlere Lösung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte auf einer sauberen Werkbank hinzugeben.
- Fügen Sie zwei sterilisierte Samen in jede Vertiefung. Kleben Sie den Deckel auf die 24-Well-Platte mit zwei Schichten von Parafilm.
- Übertragen Sie 24-Well-Platte zu einem Wachstum Kammer Satz bei 23,5 ° C mit einem 12-h/12-h-hell-dunkel-Zyklus mit 100 µmol m−2 s−1 weißes Licht zu und inkubieren Sie für 14 Tage.
3. mikroskopische Beobachtung der gruppierten Spaltöffnungen
- Platz 30 µL 3 % Saccharose-haltige 1/2 Murashige Skoog mittlere Lösung aus einem Brunnen 24-Well-Platte in der Mitte des einen Objektträger (Größe: 76 × 26 mm, Dicke: 1,0-1,2 mm).
- Entfernen Sie ein Keimblatt aus 14 Tage alten Sämling mit sezierenden Schere. Schweben Sie mit der Beobachtung Seite nach oben auf das Drop-Lösung den Keimblättern.
- Die Samenlappen Probe nach unserer vorherigen Methode13vorbereiten. Im wesentlichen stellen 30 µL der Lösung auf die Mitte von einem Deckglas (Größe: 18 × 18 mm, Dicke: 0.12-0,17 mm). Umdrehen Sie das Deckglas und legen Sie sie sanft auf den Keimblättern. Überschüssigen Puffer mit einem fusselfreien Tuch abwischen.
- Ein Exemplar auf der Bühne von einem konfokalen Laser-Mikroskop und wählen Sie gruppierte Schließzellen für Beobachtung mit Hellfeld-Beleuchtung.
- Konfokale Bilder von Eindringmittel gekennzeichneten intrazellulären Strukturen gemäß Anweisungen des Herstellers Mikroskop zu erwerben.
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Representative Results
Hier wurde das Protokoll für eine einfache Methode der Induktion Stomata clustering mit Saccharose-haltige Mittel Lösung in A. Thaliana Sämlinge vorgestellt. Die gruppierten Schließzellen in Saccharose-haltige Mittel Lösung (Abbildung 1B) angebaut haben größere Chloroplasten als Schließzellen in Saccharose free Control Bedingungen (Abb. 1A) angebaut. Die Erweiterung der Chloroplasten bestätigte mit CT-GFP11, Chloroplast Stroma Marker und Chlorophyll Autofluoreszenz (Abbildung 1C-F), was darauf hindeutet, dass Stärke Korn Akkumulation in Saccharose Behandlung führte die Chloroplasten über Saccharose Lösung Aufnahme. Darüber hinaus ergab konfokale Beobachtung der GFP-TUB612 , dass kortikale Mikrotubuli radial ausgerichteten sogar in Saccharose behandelt gruppierten Schließzellen, wie jene in Abständen Schließzellen in Saccharose free Control Bedingungen (Abbildung 2). Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Saccharose-induzierte gruppierten Schließzellen haben eine normale Ausrichtung für kortikale Mikrotubuli und Cellulose-Mikrofibrillen Stomata öffnen als Reaktion auf ökologische Hinweise9zu aktivieren.
Abbildung 1 : Chloroplasten in gruppierten Schließzellen mit Saccharose-haltige Mittel Lösung behandelt. Hellfeld (A, B), Chloroplast Stroma Marker CT-GLP (C, D)und Chlorophyll Autofluoreszenz (E, F) Bilder der Schließzellen in zuckerfreien Kontrolle (A, C, E) und 3 % Saccharose Bedingungen (B, D, F)angebaut. Skalieren von Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Kortikale Mikrotubuli in gruppierten Schließzellen behandelt mit Saccharoselösung. Kortikale Mikrotubuli beschriftet mit GFP-TUB6 der Guard cells in die Zucker-freien Kontrolle (A) und gruppierten Schließzellen in 3 % Saccharose Bedingungen (B). Skalieren von Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir haben Protokolle für die Induktion von gruppierten Spaltöffnungen in A. Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer Saccharose-haltige Mittel Lösung vorgelegt. Wie hier gezeigt, diese Methode ist sehr einfach und erfordert keine spezielle Fähigkeit aber effizient gruppierte Spaltöffnungen induzieren kann. Mehr als 45 % der Schließzellen sind mit 3 % Saccharose-haltige Cluster mittlere Lösung (Mittelwerte von mehr als 20 unabhängige Beobachtungen)6. Darüber hinaus kann dieses experimentelle System direkt zu transgenen oder mutierten Zeilen angewendet werden, wie für transgene Linien mit dem Ausdruck CT-GLP (Abbildung 1) oder GLP-TUB6 (Abbildung 2) gezeigt. Obwohl nur Schnappschüsse hier gezeigt werden, wäre es auch Zeit-sequentielle Beobachtungen während der Stomata Entwicklung durchführen möglich.
Beachten Sie, dass diese Methode auf eine Behandlung mit künstlichen exogene basiert, so dass wir nicht die Möglichkeit ausschließen, die Phänomene, die nicht direkt mit der Stomata Verteilung zusammenhängen von Saccharose Lösung eintauchen Behandlung verursacht werden. In der Tat sind Guard Zelle Chloroplasten durch die Behandlung (Abbildung 1) vergrößert. Dies kann aufgrund der Stärke Korn Ansammlung der Chloroplasten über Saccharose Lösung Aufnahme sein. Darüber hinaus wurde eine kleinere Stomata Blende beobachtet in der Saccharose-induzierte gruppierten Schließzellen9, was darauf hindeutet, dass Saccharose-vermittelten Hyperosmotic Stress Stomata öffnen unterdrückt. Dennoch blieb die radiale Ausrichtung der kortikalen Mikrotubuli (Abbildung 2). Darüber hinaus erhöht die Stomata Blende die gruppierten Schließzellen in Reaktion auf die Fusicoccin Behandlung, wie im Falle der angeordneten Spaltöffnungen9. Obwohl es notwendig sein wird, genau zu beurteilen, ob dieses experimentelle Modellsystem abhängig von Ihrer Forschungszwecke nützlich ist, würde unser System so aufschlussreiche Informationen über Beziehungen zwischen Stomata Verteilung und Antwort bieten.
Wie in der Einleitung erwähnt, kann Zucker Lösung Behandlung die Zellwand Integrität, was Durchsickern von Schlüssel-Genprodukte zur Stomata Differenzierung (z. B. Transkriptionsfaktoren) angrenzenden Epidermiszellen verringern. Wir davon ausgehen, dass die Saccharose-induzierte ektopische Lokalisierung dieser Gen-Produkte gruppierte Spaltöffnungen bewirkt. Allerdings ist diese Arbeitshypothese von molekularen biologischen Beweise nicht ausreichend unterstützt. Screening für Zucker-unempfindliche Mutanten wäre ein vielversprechender Weg, die molekularen Mechanismen, die Zucker Lösung-induzierte Stomata clustering zu klären.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, Prof. Seiichiro Hasezawa für seine freundliche Unterstützung unserer Arbeit. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Japan Society unterstützt, für die Promotion of Science (JSPS) KAKENHgrant 17K 19380 Zahlen und 18 H 05492, der Sumitomo-Foundation für einen Zuschuss für grundlegende Wissenschaft Forschungsprojekte, Anzahl 160146 und die Canon Foundation t.h gewähren. Dieses experimentelle System wurde unter eine finanzielle Unterstützung von der JSPS KAKENHgrant Nummer 26891006, K. A. entwickelt. Wir bedanken uns bei Robbie Lewis, MSc, aus Edanz Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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