Summary
Bu iletişim kuralının amacı Arabidopsis thaliana fidan cotyledons içindeki kümelenmiş stoma bantlı daldırma tedavi şeker içeren orta solüsyonu tarafından teşvik ve kloroplast gibi hücre içi yapılar dikkat göstermektir ve confocal kullanarak kümelenmiş guard hücrelerdeki mikrotübüller mikroskobu lazer.
Abstract
Stomatal hareketi fotosentez ve terleme için gerekli olan bitki gaz Satım aracılık eder. Stomatal açılış ve kapanış önemli bir artış tarafından yapılır ve muhafız hücre içinde sırasıyla azaltmak. İyonları ve su servisi taşımacılığı gardiyan hücreleri ve daha büyük komşu epidermal hücre arasındaki stomatal hareketi sırasında gerçekleştiğinden bitki stoma bantlı aralıklı dağıtım stomatal hareket için en uygun bir dağıtım olarak kabul edilir. Stoma bantlı aralıklı desen perturbing için deneysel sistemleri aralığı desen'ın önemi incelemek yararlıdır. Aralıklı stomatal dağılımı ile ilişkili birkaç anahtar genlerin kimliklerini teşhis ettik ve bu genlerin değiştirerek kümelenmiş stoma bantlı deneysel olarak bağlı olmak. Alternatif olarak, kümelenmiş stoma bantlı Ayrıca genetik değişiklik yapmadan eksojen tedaviler tarafından bağlı olmak. Bu makalede, daldırma tedavi Sükroz içeren orta solüsyonu tarafından Arabidopsis thaliana fidan içinde kümelenmiş stoma bantlı için bir basit indüksiyon sistemi açıklanmaktadır. Bizim Yöntem kolay ve doğrudan transgenik ya da mutant satır için geçerli değildir. Daha büyük kloroplast sükroz kaynaklı kümelenmiş gardiyan hücreleri hücre biyolojik damgasını sunulmaktadır. Buna ek olarak, kortikal mikrotübüller temsilcisi bir confocal mikroskopik görüntüsünü kümelenmiş guard hücre hücre içi gözlem bir örnek olarak gösterilir. Kortikal mikrotübüller radyal yönünü kümelenmiş gardiyan hücreleri Denetim koşulları aralıklı guard hücrelerde olduğu gibi korunur.
Introduction
Bitki stoma fotosentez ve terleme için gaz değişimi için temel bir organdır ve iyon tahrik alımı ve serbest bırakmak-in su ile muhafız hücrelerde önemli değişiklikler stomatal hareketi sağlanır. Mikroskop altında sapları ve yaprakları yüzeylerde stoma bantlı aralıklı dağıtım desen gözlemleyebilirsiniz. Stoma bantlı aralıklı bu dağıtım gardiyan hücreleri ve epidermal hücre1,2komşu arasında iyon ve su değişimi tarafından düzenlenen stomatal hareket yardım kabul edilir. Deneysel Indüksiyon Sistemleri için kümelenmiş stoma bantlı önemini stoma bantlı aralıklı dağılımının araştırılması için yararlıdır.
Bu kayma stoma bantlı kümeleme guard hücre farklılaşma3,4 veya kimyasal bileşik5ile tedavi için anahtar genlerin genetik modifikasyonu ile indüklenen bildirilmiştir. Biz de daldırma tedavi orta solüsyonu sukroz, glikoz, dahil olmak üzere şeker ile desteklenmiş ve fruktoz stomatal Arabidopsis thaliana fidan6cotyledons içinde kümeleme neden bildirdi. Yeni hücre meristemoids ve epidermal hücrelerin ayıran duvarları içinde azaltılmış callose sükroz çözüm daldırma tedavi hücre duvarı, sızıntı engelleyen olumsuz etkileyen düşündüren sükroz tedavi cotyledon epidermisin içinde gözlenen ve Ektopik eylem epidermal guard hücre farklılaşması (Örneğin transkripsiyon faktörleri) bitişik doğru için anahtar gen ürünlerinin6hücreler. Benzer bir mekanizma gsl8/chor mutantlar7,8üzerine çalışmalar önerildi. Deneysel sistemimiz Sükroz içeren orta çözüm kullanarak kümelenmiş stoma bantlı tekrarlanabilir indüksiyon için oldukça kolay ve ucuz. Organelleri ve sitoiskeleti kümelenmiş guard floresan işaretleri bu etiket hücre içi yapılar9, ifade transgenik satırlarına uygulandığında hücreleri gibi hücre içi yapılar araştırmak için de kullanılabilir 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. % 3 Sükroz içeren 1/2 Murashige-Skoog orta çözüm hazırlanması
- 1.1 g Murashige Skoog orta tuzları ve 15 g sükroz bir ölçek için ekleyin.
- 490 mL distile su ilave edilerek de bir heyecan çubuğunu kullanarak karıştırılır.
- PH KOH kullanarak 5.8 için ayarlayın.
- 500 ml distile su ile sulandırmak ve çözüm orta bir şişe içine aktarın.
- Çözüm (121 ° C, 20 dk) tarafından ısıyla sterilize. Hemen değil kullandıysanız, bu çözüm 4 ° C'de Sterilizasyon sonra tutulabilir.
2. indüksiyon Sükroz içeren tarafından kümelenmiş stoma bantlı orta çözüm daldırma tedavi
- Tohumlar sterilize.
- 500 µL % 5 aktif klor NaClO çözüm ve 1 µL % 10 ekleyerek sterilizasyon çözüm hazırlamak Triton X-100 500 µL steril su için.
- CA. 50 transgenik yerleştirin A. thaliana tohum CT-GFP11 veya GFP-TUB612 gibi floresan bir işaretleyici 1.5 mL tüp içine taşıyor.
- % 70 etanol çözüm ve mix 1 mL de beş kez ters çevirme tarafından ekleyin. 1 dakika bırakın.
- Tohumlar tüpün dibine batacak. Temiz bir bankta yavaşça bir micropipette kullanarak % 70 etanol kaldırın ve 1 mL sterilizasyon çözeltisi ekleyin. De beş kez ters çevirme tarafından mix ve 5 min için bırakın.
- Tohumlar yıkayın. Hala temiz bir bankta aseptik koşullar altında çalışma, yavaşça bir micropipette kullanarak çözüm kaldırın ve 1 mL steril su ekleyin. Bu beş kez tekrarlayın.
- Her şey temiz bir Bank üzerinde 24-şey plaka 1,5 mL steril % 3 Sükroz içeren 1/2 Murashige Skoog orta çözeltisi ekleyin.
- İki sterilize tohum her kuyunun içine ekleyin. Parafilm iki kat kullanarak 24-şey plaka üzerine kapak teyp.
- 14 gün boyunca kuluçkaya ve 24-şey plaka bir büyüme odası seti 23.5 ° C'de 100 µmol m−2 s– 1 beyaz ışık kullanarak bir 12-h/12-h koyu döngüsü ile transfer.
3. mikroskobik gözlem kümelenmiş stoma bantlı
- Yer 30 µL % 3 Sükroz içeren 1/2 Murashige Skoog orta çözüm bir cam slayt merkezi 24-şey tabağa kuyudan (Boyut: 76 × 26 mm, Kalınlık: 1.0-1.2 mm).
- Bir cotyledon bir 14 günlük eski fide diseksiyon makası kullanarak kaldırın. Cotyledon gözlem yüzü yukarı bakacak şekilde çözüm teslimi float.
- Cotyledon numune bizim önceki Yöntem13göre hazırlayın. Esasen, çözümün 30 µL bir cam ortasına yerleştirin (Boyut: 18 × 18 mm, Kalınlık: 0,12-0.17 mm). Cam ters çevirin ve cotyledon üzerinde yavaşça yerleştirin. Fazla tampon hav bırakmayan mendil kullanarak silin.
- Bir örnek bir confocal lazer mikroskop sahneye ayarla ve parlak alan aydınlatma kullanarak gözlem kümelenmiş guard hücrelerini seçer.
- Mikroskop üreticinin yönergelerine uygun fluorescently etiketli hücre içi yapılar confocal görüntüleri elde etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, Sükroz içeren orta solüsyonu içinde A. thaliana fidan stomatal kümeleme inducing basit bir yöntem için protokol sunulmuştur. Kümelenmiş guard hücreleri Sükroz içeren orta çözümde (Şekil 1B) yetiştirilen büyük kloroplast guard (Şekil 1A) denetim sukroz içermeyen koşullarında yetiştirilen hücrelerin daha var. Kloroplast genişleme CT-GFP11, kloroplast stroma marker ve klorofil autofluorescence (Şekil 1C-F), sukroz tedavi nişasta tahıl birikimi sonucunda düşündüren doğrulandı kloroplast üzerinden sükroz çözüm alımı. Buna ek olarak, GFP-TUB612 confocal gözlem kortikal mikrotübüller hücrelerdeki sükroz tedavi kümelenmiş guard, sukroz içermeyen Denetim koşulları (Şekil 2) aralıklı guard hücrelerde bu gibi bile odaklı radyal olduğunu ortaya koydu. Bu gözlemler kümelenmiş guard sükroz kaynaklı hücreler kortikal mikrotübüller ve çevre ipuçları9yanıt stomatal açılış etkinleştirmek için selüloz microfibrils için normal bir yönelim var öneririz.
Resim 1 : Kümelenmiş guard hücrelerinde kloroplast tedavi Sükroz içeren orta çözüm. Parlak alan (A, B), kloroplast stroma işareti CT-GFP (C, D)ve muhafız şekersiz Denetim koşulları (A, C, E) ve % 3 sükroz koşullarda (B, D, F)yetiştirilen hücrelerin klorofil autofluorescence (E, F) görüntüler. Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Kümelenmiş guard hücrelerdeki kortikal mikrotübüller tedavi sükroz çözüm. GFP-TUB6 guard cells şekersiz kontrol (A) ve % 3 sükroz kümelenmiş gardiyan hücreleri ile etiketli kortikal mikrotübüller (B)koşulları. Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz indüksiyon kümelenmiş stoma bantlı protokollerde A. thaliana fidan tarafından daldırma tedavi Sükroz içeren orta solüsyonu ile sundu. Burada gösterildiği gibi bu yöntem çok basit ve hiçbir özel beceri gerektirir ancak verimli bir şekilde kümelenmiş stoma bantlı tetikleyebilir. Gardiyan hücreleri % 45'den fazla kümelenmiş % 3 Sükroz içeren yapmak ile orta çözüm (20'den fazla bağımsız gözlemler ortalama değerler)6. Ayrıca, bu deneysel sistem doğrudan transgenik ya da mutant satırlarına CT-GFP (Şekil 1) veya GFP-TUB6 (resim 2) ifade transgenik hatlarında gösterildiği gibi uygulanabilir. Yalnızca anlık görüntü görüntü görüntüleri burada gösterilir rağmen aynı zamanda stomatal geliştirme sırasında zaman sıralı gözlemler yapmak mümkün olacaktır.
Not stomatal dağıtım için doğrudan ilgili olmayan olayları sükroz çözüm daldırma tedavi tarafından neden olduğu olasılığını dışlayamazsınız bu yüzden bu yöntem bir yapay exogeneous tedavisine dayanır. Aslında, guard hücre kloroplast tedavi (Şekil 1) tarafından büyütülmüş. Bu nişasta tahıl birikimi kloroplast üzerinden sükroz çözüm alımı nedeniyle olabilir. Buna ek olarak, bir küçük stomatal diyafram sükroz aracılı hyperosmotic stres stomatal açılış bastırılmış düşündüren sükroz kaynaklı kümelenmiş gardiyan hücreleri9' da gözlendi. Yine de, kortikal mikrotübüller radyal yönünü (Şekil 2) devam edildi. Ayrıca, kümelenmiş guard hücre stomatal diyafram aralıklı stoma bantlı9durumunda olduğu gibi fusicoccin tedaviye yanıt olarak önemli ölçüde artırır. Böylece, her ne kadar dikkatli bir şekilde bu deneysel model sistem araştırma amaçlarınıza bağlı olarak yararlı olup hakim için gerekli olacaktır, sistemimiz stomatal dağıtım ve yanıt ilişkisi ile ilgili yorum içeren bilgiler sağlar.
Giriş bölümünde de belirtildiği gibi şeker çözüm tedavi sızıntı için komşu epidermal hücrelerin stomatal farklılaşma (Örneğin transkripsiyon faktörleri) için anahtar gen ürünlerinin sonuçlanan hücre duvarı bütünlük düşürebilir. Bu gen ürünlerin sükroz kaynaklı ektopik yerelleştirme kümelenmiş stoma bantlı neden olduğunu tahmin ediyoruz. Ancak, bu çalışma hipotezi moleküler biyolojik delillerle yeterince desteklenmiyor. Tarama şeker-duyarlı mutantlar için şeker çözüm kaynaklı stomatal kümeleme altında yatan moleküler mekanizmaları netleştirmek için umut verici bir şekilde olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Prof. Seiichiro Hasezawa için çalışmalarımız onun tür destek için minnettarız. Bu eser bilim promosyon (JSP'ler) KAKENHgrant 17 K 19380 numaralar ve 18 H 05492, temel bilim araştırma projeleri için bir hibe için Sumitomo temelden numarası 160146 ve Canon vakıf T.H. için vermek için hibe--dan Japonya toplum tarafından desteklenmiştir Bu deneysel sistem K. A. JSP'ler KAKENHgrant numarası 26891006 bir mali destek altında geliştirilmiştir Robbie Lewis, Edanz yazının taslağını düzenlemek için Grup (www.edanzediting.com/ac) yüksek lisans teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D.
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U.
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
