Summary
Ce protocole vise à démontrer comment induire des stomates en cluster dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana en traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du sucre et observer des structures intracellulaires tels que les chloroplastes et les microtubules dans les cellules stomatiques en cluster à l’aide de confocal laser microscopie.
Abstract
Stomates mouvement intervient dans les échanges gazeux plante, qui est essentiel pour la photosynthèse et la transpiration. Stomates d’ouverture et de fermeture sont réalisées par une augmentation significative et diminuent du volume de cellules de garde, respectivement. Navette de transport des ions et l’eau se produit entre les cellules de garde et de plus grandes cellules épidermiques voisines durant le mouvement stomatique, la distribution espacée des stomates de la plante est considérée comme une distribution optimale de mouvement stomatique. Des systèmes expérimentaux pour perturber le modèle espacé des stomates sont utiles pour examiner l’importance de l’enchaînement d’espacement. Plusieurs gènes clés associées à la distribution de stomates espacée ont été identifiés, et les stomates en cluster peuvent être induites expérimentalement en altérant ces gènes. Alternativement, des stomates en cluster peuvent être également induites par les traitements exogènes sans modification génétique. Dans cet article, nous décrivons un système simple induction pour cluster stomates chez Arabidopsis thaliana plantules par traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du saccharose. Notre méthode est simple et directement applicables aux lignes transgéniques ou mutants. Plus gros chloroplastes sont présentés comme une caractéristique biologique cellulaire des cellules de garde en cluster induite par le saccharose. En outre, une image microscopique confocale représentative des microtubules corticaux est montrée comme un exemple d’observation intracellulaire des cellules de garde en cluster. L’orientation radiale des microtubules corticaux est maintenue dans les cellules de garde en cluster comme des cellules stomatiques espacés dans des conditions de contrôle.
Introduction
La stomie de plante est un organe essentiel pour l’échange de gaz pour la photosynthèse et la transpiration, et déplacement stomatique est réalisé par des changements significatifs dans les cellules de garde par adoption pilotée par l’ion et une sortie d’eau. Au microscope, on peut observer un modèle de distribution espacés de stomates sur les surfaces des feuilles et des tiges. Cette répartition espacée des stomates est considérée pour aider le mouvement stomatique, qui est régi par échange d’ions et l’eau entre les cellules de garde et les voisins des cellules épidermiques1,2. Systèmes d’induction expérimentale de stomates en cluster sont utiles pour étudier l’importance de la distribution espacée de stomates.
Il a été signalé que le regroupement spatial des stomates peut être induit par une modification génétique des gènes principaux pour la différentiation de cellules de garde3,4 ou un traitement avec un composé chimique5. Nous avons également rapporté que traitement d’immersion avec une solution moyenne additionné de sucres y compris le saccharose, glucose, et fructose causé stomatique clustering dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana 6. Réduit de callose dans nouvelles parois séparant les méristémoïdes et les cellules épidermiques a été observée dans l’épiderme de cotylédon imprégnées de saccharose, ce qui suggère que le saccharose solution immersion traitement affecte négativement la paroi cellulaire, ce qui empêche les fuites et action ectopique des produits des gènes clés pour la différenciation des cellules de garde (par exemple les facteurs de transcription) vers adjacentes épidermique cellules6. Un mécanisme similaire a été proposé d’études sur les gsl8/chor des mutants7,8. Notre système expérimental pour l’induction reproductible des stomates en cluster à l’aide de la solution moyenne contenant du saccharose est assez facile et bon marché. Il peut également être utilisé pour étudier les structures intracellulaires comme les organites et le cytosquelette dans les cellules stomatiques cluster lorsqu’il est appliqué à des lignées transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents cette étiquette structures intracellulaires9, 10.
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Protocol
1. préparation de la Solution moyen 3 % contenant du saccharose 1/2 Murashige-Skoog
- Ajouter 1,1 g de sels milieu Murashige-Skoog et 15 g de saccharose dans un bécher.
- Ajouter 490 mL d’eau distillée et mélanger bien à l’aide d’une barre de remuer.
- Ajuster le pH de 5,8 à l’aide de KOH.
- Diluer dans 500 mL d’eau distillée et transvaser la solution dans une bouteille moyenne.
- Stérilisez la solution par autoclavage (121 ° C, 20 min). Si ne pas utilisée immédiatement, cette solution peut-être être conservée à 4 ° C après la stérilisation.
2. induction des stomates en cluster par contenant du saccharose Solution moyenne Immersion traitement
- Stériliser les graines.
- Préparer la solution de stérilisation en ajoutant 1 µL de 10 % et de 500 µL de 5 % de chlore actif NaClO solution Triton X-100 à 500 µL d’eau stérile.
- Placez env. 50 transgéniques a. thaliana seeds transportant un marqueur fluorescent comme CT-GFP11 ou12 de la GFP-TUB6 dans un tube de 1,5 mL.
- Ajouter 1 mL de solution d’éthanol à 70 % et mélanger bien en inversant les cinq fois. Laissez pendant 1 min.
- Les graines vont couler au fond du tube. Sur un banc propre, Retirez doucement l’éthanol à 70 % à l’aide d’une micropipette et ajouter 1 mL de solution de stérilisation. Bien mélanger en retournant cinq fois et laisser pendant 5 min.
- Laver les graines. Toujours travailler dans des conditions aseptiques sur un banc propre, Retirez doucement la solution à l’aide d’une micropipette et ajouter 1 mL d’eau stérile. Répétez cette opération cinq fois.
- Ajouter 1,5 mL de stérilisé contenant du saccharose 1/2 Murashige-Skoog moyenne solution à 3 % dans chaque puits d’une plaque de 24 puits sur un banc propre.
- Ajouter deux graines stérilisées dans chaque puits. Scotchez le couvercle sur la plaque 24 puits à l’aide de deux couches de parafilm.
- Transférer la plaque 24 puits à un ensemble de chambre de croissance à 23,5 ° C avec un cycle lumière-obscurité de h-12 h/12 100 µmol m−2 s−1 blanc lumière et incuber pendant 14 jours.
3. microscopique Observation des stomates en cluster
- Place 30 µL de 1/2 3 % de sucrose-contenante Murashige-Skoog solution moyenne provenant d’un puits de la plaque 24 puits au centre d’une lame de verre (taille : 76 x 26 mm, épaisseur : 1,0 à 1,2 mm).
- Retirer un cotylédon un semis âgés de 14 jours à l’aide de ciseaux de dissection. Flotter le cotylédon avec le côté d’observation vers le haut sur la goutte de la solution.
- Préparer le spécimen de cotylédon selon notre méthode précédente13. Essentiellement, placez 30 µL de la solution sur le centre d’un couvercle en verre (taille : 18 × 18 mm, épaisseur : 0,12-0,17 mm). Retournez le couvercle en verre et placez-le délicatement sur les cotylédons. Essuyer l’excès de tampon à l’aide d’un chiffon non pelucheux.
- Définir un spécimen sur la scène d’un microscope confocal laser et sélectionnez les cellules de garde en cluster pour l’observation à l’aide d’éclairement lumineux zone.
- Acquérir des images confocales de structures intracellulaires fluorescent étiquetés conformément aux instructions du fabricant du microscope.
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Representative Results
Ici, le protocole pour une simple méthode d’induction de stomates clustering avec contenant du saccharose de la solution moyenne chez les plantules d’a. thaliana a été présenté. Les cellules stomatiques cluster cultivés en solution moyenne contenant du saccharose (Figure 1B) ont des chloroplastes plus grandes que les cellules stomatiques cultivés dans des conditions de contrôle sans sucrose (Figure 1A). L’élargissement des chloroplastes a été confirmée avec CT-GFP11, un marqueur du stroma des chloroplastes et chlorophylle autofluorescence (Figure 1A-C), ce qui suggère que saccharose traitement conduit à l’accumulation grains d’amidon dans le absorption des chloroplastes par solution de sucrose. En outre, confocale observation de GFP-TUB612 a révélé que les microtubules corticaux étaient même radialement orientées en saccharose en cluster garde les cellules traitées, comme celles dans les cellules de garde espacés dans des conditions de contrôle sans sucrose (Figure 2). Ces observations suggèrent que les cellules de garde en cluster induite par le saccharose ont une orientation normale pour les microtubules corticaux et des microfibrilles de cellulose pour permettre une ouverture stomatique en réponse aux signaux environnementaux9.
Figure 1 : Chloroplastes dans des cellules de garde en cluster traitement avec une solution contenant du saccharose moyenne. Champ lumineux (A, B), marqueur de stroma du chloroplaste CT-GFP (C, D)et (la chlorophylle autofluorescence E, F) des images de cellules stomatiques cultivés en conditions de saccharose de conditions (A, C, E) et 3 % sans sucre témoins (B, D, F). Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les microtubules corticaux en cluster des cellules stomatiques traitement avec une solution de saccharose. (B)les conditions des microtubules corticaux étiquetés avec GFP-TUB6 de guard cells dans contrôle sans sucre (A) et des cellules de garde en cluster à 3 % de saccharose. Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous avons présenté des protocoles pour l’induction des stomates en cluster dans les semis d’a. thaliana par traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du saccharose. Comme indiqué ici, cette méthode est très simple et ne nécessite aucun compétences spécialisées, mais peut induire efficacement les stomates en cluster. Plus de 45 % des cellules stomatiques sont groupés avec 3 % contenant du saccharose solution moyenne (valeurs moyennes de plus de 20 observations indépendantes)6. En outre, ce système expérimental peut être directement appliqué aux lignes transgéniques ou mutantes comme indiqué pour les lignées transgéniques exprimant CT-GFP (Figure 1) ou GFP-TUB6 (Figure 2). Bien que seules les images de capture instantanée sont affichées ici, il serait également possible d’effectuer des observations temps séquentiel au cours du développement de stomates.
Notez que cette méthode est basée sur un traitement artificiel exogènes, donc nous ne pouvons pas exclure la possibilité que les phénomènes qui ne sont pas directement liées à la distribution de stomates sont causées par le traitement de saccharose solution d’immersion. En fait, les chloroplastes des cellules de garde ont été agrandies par le traitement (Figure 1). Cela pourrait être dû à l’accumulation de grains d’amidon dans l’absorption de solution chloroplastes via le saccharose. En outre, une plus petite ouverture des stomates a été observée dans le sucrose induite par les cellules de garde en cluster9, ce qui laisse supposer que le stress hyperosmotique induite par le saccharose supprimée ouverture stomatique. Néanmoins, l’orientation radiale des microtubules corticaux persistait (Figure 2). En outre, l’ouverture des stomates des cellules stomatiques cluster augmente de manière significative en réponse à un traitement fusicoccine, comme dans le cas des stomates espacés de9. Ainsi, bien qu’il sera nécessaire de soigneusement juger si ce système de modèle expérimental est utile selon vos besoins de recherche, notre système fournirait des informations concernant la relation entre la répartition stomatique et réponse.
Tel que mentionné dans l’Introduction, la solution de sucre traitement pourrait diminuer l’intégrité de la paroi cellulaire, et fuite de produits de gènes clés pour la différenciation stomatique (par exemple les facteurs de transcription) de cellules épidermiques adjacentes. Nous supposons que la localisation ectopique induite par le saccharose des produits de ces gènes provoque des stomates en cluster. Toutefois, cette hypothèse de travail n’est pas suffisamment étayée par des preuves biologiques moléculaires. Dépistage des mutants insensibles à sucre serait une voie prometteuse pour clarifier les mécanismes moléculaires sous-jacents sucre induite par la solution de clustering stomatique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à m. Seiichiro Hasezawa pour son soutien de notre travail. Ce travail a été prise en charge par des subventions de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) KAKENHgrant numéros 17K 19380 18 H 05492, de la Fondation Sumitomo une subvention pour des projets de recherche scientifique fondamentale accorder nombre 160146 et la fondation de Canon à T.H. Ce système expérimental a été développé sous un soutien financier à partir du nombre de pages jsp KAKENHgrant 26891006 à K. A. Nous remercions Robbie Lewis, M.Sc., du groupe Edanz (www.edanzediting.com/ac) pour l’édition d’un projet du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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