I denne protokol, vi viser, hvordan opdrætte Astyanax mexicanus voksne, hæve larverne, og udføre hele-mount Immunhistokemi på post larve fisk at sammenligne fænotyper af overfladen og hule morphotypes.
Floden og grotte-tilpasset populationer af Astyanax mexicanus viser forskelle i morfologi, fysiologi og adfærd. Forskning fokuseret på sammenligne voksen former har afsløret det genetiske grundlag for nogle af disse forskelle. Mindre er kendt om hvordan befolkningen er forskellige på post larve stadier (i starten af fodring). Sådanne studier kan give indsigt i hvordan cavefish overleve gennem voksenalderen i deres naturlige miljø. Metoder til at sammenligne post larve udvikling i laboratoriet kræver standardiserede akvakultur og fodring regimer. Her beskriver vi hvordan man hæve fisk på en diæt af næringsrige hjuldyr i ikke-recirkulerende vand i op til to uger post befrugtning. Vi demonstrere, hvordan indsamler post larve fisk fra denne børnehave system og udføre hele-mount immunfarvning. Immunfarvning er et attraktivt alternativ til transgen udtryk analyse for at undersøge udviklingen og genfunktion i A. mexicanus. Metoden børnehave kan også bruges som en standardprotokol for etablering af tæthed-matchede befolkninger for vækst til voksne.
Den mexicanske tetra Astyanax mexicanus, er en enkelt arter af fisk, der findes som river-bolig populationer (overflade fisk) og en række hulen-boligen populationer (cavefish) opkaldt efter de huler, de bebor (dvs., Tinaja, Molino, Pachón). Et stigende antal forskere bruger A. mexicanus til at undersøge de genetiske og udviklingsmæssige baser adfærdsmæssige1,2,3,4, metabolisk5,6 ,7,8, og morfologiske evolution9,10,11. Tilgængelige ressourcer til undersøgelser af A. mexicanus omfatter en sekventeret og kommenteret genom12; transkriptom13; udviklingsmæssige midlertidige tabel14; og metoder for avl15,16,17, oprette transgenics18, og redigere gener19. Formidling af yderligere værktøjer og opdaterede standardprotokoller vil accelerere vækst af Fællesskabets cavefish forskning (Se denne metoder samling20).
Vores mål er at tilføje til det eksisterende repertoire af værktøjer ved at give en robust metode til vurdering af gene aktivitet i situ i post larve A. mexicanus, på en måde, der er sammenlignelige mellem laboratorier. Der er to udfordringer for at nå dette mål. Først, der er behov for standardiseret regimer rugeæg og hæve fisk mellem laboratorier, som forskelle i parametre såsom fodring og tæthed påvirker vækst og modning, derved påvirker genaktivitet. Andet er der behov for en standardiseret endnu fleksibel metode til at undersøge mønstre af genaktivitet i post larve fisk. Vi løser disse problemer her, etablere standard praksis for at hæve fisk til post larve faser og indføre en robust hele-mount Immunhistokemi (IHC) protokol for at vurdere genekspression i A. mexicanus.
Vi viser først, hvordan at avle fisk gennem naturlig gydning og identificere befrugtede æg. Beskrevet næste er, hvordan man luge befrugtede æg (larver) og overføre dem til børnehave beholdere, hvor de er vedligeholdt med en tæthed på 20 fisk per container for to uger uden recirkulerende eller ændre vandet. På 5-dages post befrugtning, fisk har udviklet til post larve faser (ikke længere at have en æggeblomme forsyning) og leveres alger-fed Brachionus plicatilis (hjuldyr) som en næringsrig mad kilde, der ikke kræver daglig genbestilling. Denne metode giver ensartet vækst parametre for larver og post larve udvikling.
For at vurdere genfunktion, vise vi hvordan du fjerne fisk fra børnehave containere og udføre hele-mount IHC. Metoden IHC præsenteret er tilpasset fra protokoller udviklet til brug med Danio rerio21 og er effektiv til at undersøge antigener i alle A. mexicanus væv testet, herunder hjernen, tarmen og bugspytkirtlen. IHC er et hurtigere alternativ til generering af transgene dyr undersøgelse af genekspression og protein lokalisering. Denne protokol vil være nyttig for undersøgelser rettet mod voksende A. mexicanus og sammenligning fænotyper overflade fisk og cavefish på post larve stadier.
Sammenligne genaktivitet mellem overfladen og cave kræver A. mexicanus nøje kontrolleret miljøparametre og metoder, der kan genskabes på tværs af laboratorier. Vores protokol for at hæve A. mexicanus giver konsekvent ernæringsmæssige indhold under post larve udvikling. Efter denne fodring regime, kan genfunktion sammenlignes trygt mellem befolkninger ved hjælp af robust Immunhistokemi protokollen præsenterer vi. Her kan vi diskutere betydningen af denne metode samt dens begrænsninger og fremtidige applikationer.
For at opnå tæthed-matchede vækst, fandt vi, at efter larve fisk kan hæves uden recirkulerende vand i to uger i 1,5 L containere på en diæt af hjuldyr. Denne protokol kan også bruges til at hæve fisk på en recirkulerende system; dog skal hjuldyr tilføjes dagligt til at kompensere for de mistede gennem tank udstrømning. Nyklækkede Artemia nauplii er almindeligt anvendt som en fødekilde i akvakultur, men vi fandt, at bruge hjuldyr har betydelige fordele, herunder: reduceret pris, forbedret biosikkerhed, konsekvent ernæring og bedre vandkvalitet (se nedenfor).
Først, den ugentlige omkostningerne i forbrugsvarer er 4 dollars for hjuldyr, i forhold til 14 dollars for Artemia. Med hensyn til biosikkerhed, hjuldyr er rejst i laboratorium under kontrollerede forhold, mens Artemia er indsamlet fra naturen og underlagt naturlig variation i mikrobiel eller patogen indhold23. Derudover er den ernæringsmæssige sammensætning af Artemia nauplii miljømæssigt målrettet og derfor inkonsekvent. Nauplii trives på deres egen energi butikker efter klækning; de miste hurtigt næringsværdi som de udvikle og bør optimalt fodres til fisk i flere timer. Artemia begynde fodring på 12 hus efter udklækning, der repræsenterer den første gang, at de kunne være ernæringsmæssigt beriget; dog på nuværende tidspunkt er de blevet for stor til 5 dpf fisk til at forbruge. I sammenligning feed hjuldyr løbende på marine mikroalger resulterer i høje næringsstofindhold uanset hvornår hjuldyr er høstet. Hjuldyr er meget mindre end Artmeia nauplii (160 vs 400 mikron), hvilket gør dem lettere for fisk at fange og sluge. Post larve overflade fisk og cavefish forbruge hjuldyr i lignende mængder tyder på nogen forskel i præference eller evnen til at fange hjuldyr10.
Endelig begynde Artemia nauplii at dø i ferskvand flere timer efter at være indført. Uspist nauplii henfalder hurtigt faldende vandkvaliteten, hvis de ikke fjernes manuelt. Fjerner døde Artemia er tidskrævende og farlige for post larve fisk, der er ikke meget større end Artemia og kan være ved et uheld fjernet eller skadet. Hjuldyr kan leve på ubestemt tid i børnehaven containere og levere mad til fisk på alle tidspunkter uden væsentligt påvirker vandkvaliteten.
Mens ved hjælp af hjuldyr, som en fødekilde har betydelige fordele til at opretholde rotifer lager, alger skal føjes til kultur-systemet dagligt. Dette kan opnås med en automatisk arkføder, der dispenserer flydende alger i rotifer kultur beholder (Se Tabel af materialer). Hjuldyr skal også høstes fra dette set-up hver 24-48 timer for at bevare sundheden for kulturen. Forskere, at avle fisk meget sjældent (en gang om året, for eksempel) og er ikke bekymret med sammenligninger mellem befolkninger på post larve stadier kan foretrækker Artemia som en fødekilde, da de encysted embryoer kan blive udklækket til enhver tid.
Vi anbefaler, registrering af antallet af udklækkede og overlevende larver til at overvåge succesen af rugeæg og vækst. Hvis de fleste af embryoner eller larver dør, kan det skyldes bakterie- eller svampeinfektion forurening. Det anbefales at overvåge vandkvaliteten i fisk-klar vand og sterilisere udstyr med 70% ethanol. Børnehave beholdere kan bruges igen, efter at de er rengjort og steriliseret. For at minimere risikoen for sygdom, er det også afgørende for at fjerne eventuelle døde fisk fra børnehave-beholdere og ikke tilføje hjuldyr før 5 dpf, når fisken begynder at spise.
A. mexicanus er kønsmodne omkring et år gammel. Dette er en begrænsning for at skabe transgene A. mexicanus i forhold til Danio rerio (zebrafisk) der er i stand til at avle på 10-12 uger24. Immunhistokemi (IHC) er en alternativ metode til at undersøge genekspression og protein lokalisering. Protokollen beskrevet her kan tilpasses på hvert trin og bruges til at afsløre antigener i væv af interesse. Det er vigtigt at bemærke, at nogle væv kan være sværere at visualisere i overflade fisk på grund af pigmentering (en barriere, der ikke findes i unpigmented cavefish), som kan påvirke fortolkningen af sammenlignende undersøgelser. For at imødegå dette potentielle problem, kan overflade fisk pigment være bleget efter fiksering ved hjælp af 3% brintoverilte.
IHC kræver vellykkede væv fiksering, blokering, og antistof penetration. Metoder for hvert varierer afhængigt af de væv og protein af interesse. Fiksativ og fiksering tiden skal bevare celle arkitektur samtidig opretholde antigen epitop. For denne protokol, vi bruger tværbindingsmidler fiksativ (PARAFORMALDEHYD) og udelader en denaturering fiksativ (såsom methanol eller acetone). Vi fandt, at inkubation i acetone formindsket antistof signal for neuronal og pancreas markører. Den blokerende skridt er afgørende for at forhindre antistoffer bindende for ikke-målarter proteiner i vævet. Denne metode bruger en kombination af normale serum (5%) og BSA (0,2%) i den blokerende løsning. Den blokerende løsning indeholder antistoffer og proteiner der binder til reaktive steder på proteiner i væv, faldende ikke-specifik binding af de primære og sekundære antistoffer.
For at opnå antistof penetration, skal være permeabilized væv. Dette kan opnås med rengøringsmidler eller denaturering opløsningsmidler men skal optimeres for at bevare antigen epitop. Vores protokol bruger en kombination af Triton og dimethyl sulfoxid (DMSO). Triton og DMSO er inkluderet i blokering og antistof inkubation skridt i koncentrationer på 0,5% og 1%, henholdsvis. Ved hjælp af denne koncentration, har vi observeret farvning i hjerne, bugspytkirtel, tarm og muskel, tyder på, at det er sandsynligt, effektivt for indtrængning af alle væv. Fisk størrelse kan også påvirke penetration. Denne protokol er ikke blevet testet på fisk, der er større end 14 dage gamle (ca. 7 mm i længden). For at foretage fejlfinding af farvning, anbefales det at ændre fiksering, blokering, og antistof penetration trin. Det er også vigtigt at undersøge sekvens bevarelse af immunogenerne med A. mexicanus protein af interesse ved hjælp af de tilgængelige genom25.
A. mexicanus er en fremragende model til at undersøge udviklingen som de samme arter, som har udviklet sig i dramatisk forskellige miljøer kan sammenlignes direkte i laboratoriet. Standard dyrehold protokoller, både inden for og mellem laboratorier, er nødvendigt for at forstå de biologiske forskelle mellem overflade fisk og cavefish. Vores artikel beskrives en metode til at undersøge udviklingen og genaktivitet i post larve fisk udsættes for konsekvent vækst parametre.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
Antibodies | |||
insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |