Summary
In diesem Protokoll wir zeigen, wie Astyanax Mexicanus Erwachsene zu züchten, die Larven zu erhöhen, und ganze-Mount Immunohistochemistry auf Post-Larven Fische zu vergleichen die Phänotypen der Oberfläche und Höhle Morphotypen führen.
Abstract
Fluss und Höhle angepasste Populationen von Astyanax Mexicanus zeigen Unterschiede in der Morphologie, Physiologie und Verhalten. Forschung konzentrierte sich auf den Vergleich von adulten Forms hat die genetische Grundlage für einige dieser Unterschiede ergeben. Weniger bekannt ist, über die Unterschiede zwischen der Bevölkerungen bei Post-Larvenstadien (zu Beginn der Fütterung). Solche Studien können Einblick in wie Cavefish bis ins Erwachsenenalter in ihrer natürlichen Umgebung zu überleben. Methoden zum Vergleichen von Post-Larvalentwicklung im Labor erfordern standardisierte Aquakultur und Fütterung Regime. Hier beschreiben wir, wie Fisch auf eine Diät von nährstoffreichen Rädertierchen nicht Rezirkulation Wasser für bis zu zwei Wochen Post Befruchtung zu erhöhen. Wir zeigen, wie Post-Larven Fisch aus diesem Kindergarten-System zu sammeln und ganz-Mount Immunostaining durchführen. Immunostaining ist eine attraktive Alternative zu Transgen Expressionsanalyse für die Untersuchung von Entwicklung und Genfunktion in A. Mexicanus. Die Baumschule-Methode dient auch als ein standard-Protokoll für die Festlegung Dichte abgestimmt Bevölkerung Wachstum zu Erwachsenen.
Introduction
Die mexikanische Tetra ist Astyanax Mexicanus, einer einzigen Art von Fisch, die als Fluss lebende Populationen (Oberfläche Fisch) vorhanden ist und eine Reihe von höhlenbewohnenden Populationen (Cavefish) benannt nach den von die ihnen bewohnten Höhlen (d. h. Tinaja, Molino, Pachón). Eine wachsende Zahl der Forscher verwenden A. Mexicanus , um die genetischen und Entwicklungsstörungen Grundlagen der Verhaltenstherapie1,2,3,4, metabolische5,6 untersuchen ,7,8und morphologischen Evolution9,10,11. Verfügbare Ressourcen für Studien von A. Mexicanus gehören ein Genom sequenziert und annotiert12; Transkriptom-13; Developmental staging Tabelle14; und Methoden für die Zucht von15,16,17, Erstellen von gentechnisch veränderten Pflanzen18, und Gene19bearbeiten. Verbreitung von Zusatztools und aktualisierte Standardprotokolle beschleunigt Wachstum der Forschungsgemeinschaft Cavefish (siehe diese Methoden Sammlung20).
Unser Ziel ist es, um das bestehende Repertoire von Tools hinzufügen, indem Sie eine robuste Methode zur Bewertung von Gen-Aktivität in Situ in Post-Larven A. Mexicanus, in gewissem Sinne zwischen Labors vergleichbar. Es gibt zwei Herausforderungen zur Erreichung dieses Ziels. Erstens gibt es eine Notwendigkeit für standardisierte Regelungen für das Ausbrüten und erhöhen die Fische zwischen Labors, wie Unterschiede in den Parametern wie Fütterung und Dichte beeinflussen Wachstum und Reifung, damit Auswirkungen auf die Aktivität der Gene. Zweitens gibt es eine Notwendigkeit für eine standardisierte aber anpassungsfähige Methode für die Prüfung der Muster der Genaktivität in der Post-Larven Fisch. Wir gehen diesen Fragen hier, Einführung standard Praktiken zum Fisch zu Post-Larvenstadien anheben und eine robuste ganz-Mount Immunhistochemie (IHC) Protokoll für die Beurteilung der Genexpression in A. MexicanusEinführung.
Wir führen zunächst durch natürliche laichen die Fische züchten und befruchtete Eier zu identifizieren. Beschrieben weiter ist, wie man befruchtete Eier (Larven) schlüpfen und übertragen Sie sie auf Kindergarten Container, wo sie sind bei einer Dichte von 20 Fische pro Container für zwei Wochen gedacht ohne Rezirkulation oder das Wasser zu wechseln. Bei 5-Tage Post Befruchtung der Fisch entwickelt, um einen Post-Larvenstadien (nicht mehr mit einer Eigelb-Versorgung) und dienen als eine nährstoffreiche Nahrungsquelle, die keinen täglichen Nachschub benötigen Algen gefüttert Brachionus Plicatilis (Rädertierchen). Diese Methode bietet konsistente Wachstumsparameter für Larven und Post-larvale Entwicklung.
Genfunktion bewerten, demonstrieren wir entfernen die Fische vom Kindergarten Container und vollständig-hängen IHC durchführen. Die IHC-Methode vorgestellt wird von Protokollen entwickelt für den Einsatz mit Danio Rerio21 angepasst und ist wirksam für die Prüfung von Antigenen in allen A. Mexicanus Geweben getestet, einschließlich Gehirn, Darm und Bauchspeicheldrüse. IHC ist eine schnellere Alternative zur Erzeugung transgener Tiere zur Untersuchung der Genexpression und Protein-Lokalisierung. Dieses Protokoll wird für Studien, die darauf abzielen, A. Mexicanus wächst und vergleichen die Phänotypen der Oberfläche Fischen und Cavefish bei Post-Larvenstadien nützlich sein.
Protocol
In diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Harvard Medical School genehmigt.
1. Zucht
Hinweis: Es gibt mehrere veröffentlichten Methoden für die Zucht von15,16,17,20 , die auch bei diesem Schritt genutzt werden kann. Vor der Zucht, sind auf eine 10:14 hell: Dunkel-Zyklus bei 23 ° C und eine Pellet-Diät gefüttert geschlechtsreifer Fische gepflegt (siehe Table of Materials) einmal täglich. Fische können in einem rezirkulierenden System mit mechanische Filtration und UV-Sterilisation gezüchtet. Zucht in statische (Rezirkulation) Panzer auch erreicht werden kann, aber Fisch sollte nicht gelassen werden in einem statischen Tank für mehr als 3 Tage, wie Wasserqualität verschlechtert sich schnell.
- Fisch-fähigen Wasser einen 5 gal Tank einfüllen (entchlort Wasser angepasst: pH = 7.1 + /-2, Leitfähigkeit = 900 +/-150 µS, Temperatur = 23 ° C).
- Geben Sie Kunststoff ineinander greifen (siehe Material) in der Unterseite des Tanks. Wenn in statischen Panzer Zucht, befestigen Sie einen Durchlauferhitzer an der Seite des Tanks. Wenn in einem rezirkulierenden System Zucht, platzieren Sie eine Wasser-Heizung im System Sumpf.
Hinweis: Die Kunststoffgitter verhindert, dass Erwachsene Verzehr von Eiern. - Ort eine weibliche und zwei männliche A. Mexicanus Fische von mehr als 1 Jahr alt in den Tank. Lassen Sie den Fisch für 30 min zu akklimatisieren.
- Stellen Sie die Temperatur der Heizung auf 24 ° C (oder 1 ° C wärmer als die Anfangstemperatur).
- Erhöhen Sie nach 24 Stunden die Temperatur von 1 ° C.
- Erhöhen Sie nach 24 Stunden die Temperatur von 1 ° C. Überprüfen Sie die Tanks täglich für Eier von glänzenden eine Taschenlampe auf den Boden des Tanks. Zurückhalten Sie, die Fische aus der Nahrung in diesem 3-Tages-Zeitraum.
- Wenn laichen nicht nach 3 Tagen induziert wurde, schalten Sie die Heizung und lassen Sie das Wasser wieder auf Raumtemperatur (RT) bevor die Fische mit ihren ursprünglichen Tank.
(2) schlüpfen befruchtete Eier
- Sobald Eier in einem Zucht-Tank identifiziert werden, entfernen Sie die Erwachsene und Kunststoffgitter, und reduzieren Sie das Wasser bis zu einer Tiefe von 10 cm mit einem Becher oder einer Tasse.
Hinweis: Zur Zeit des Laichens abschätzen zu können, verwenden Sie eine Transferpipette, um mehrere Eier in einer Petrischale zu platzieren und sie mit einem Stereomikroskop zu bestimmen, die Bühne14 und der Zeitpunkt der Befruchtung zu schätzen. - Verschieben Sie den Tank in eine praktische Arbeitsfläche und entfernen Sie alle opaken Eier oder Kot, verlassen nur die durchscheinende, fruchtbaren Eier im Tank.
Hinweis: Die Anzahl der befruchteten Eier kann zu diesem Zeitpunkt erfasst werden. - Füllen Sie der Tank mit Fisch Wasser (siehe Punkt 1.1) und Tank ca. 6-7 Tropfen Methylenblau hinzufügen, da das Wasser füllt.
Hinweis: Die Endkonzentration von Methylenblau ist etwa 1,5 ppm. - Fügen Sie eine Heizung und Aquarium Bubbler (verbunden mit einer Luftpumpe mit einem Regler) in den Tank.
- Legen Sie die Heizung auf 24 ° C und passen Sie die Airstream-Regler um einen sanften Strom von Luftblasen zu produzieren.
- Setzen Sie einen Deckel auf den Tank um die Wassertemperatur zu halten.
Hinweis: Die Eier sollten Schraffur innerhalb von 24 h zum Laichen mal anfangen.
3. Übertragung der geschlüpften Larven zu Kindergarten Container
- 20 g Salz zugeben (siehe Material) auf 8 L von Fisch-Ready Wasser (siehe Punkt 1.1) und rühren, bis aufgelöst. Füllen Sie jede 1,5 L Baumschule Behälter (siehe Material) mit 1 L Wasser bereit.
- Verwenden Sie eine Transferpipette geschlüpfte Larven in vorbereiteten Kinderzimmer Container bei einer Dichte von 20 Fische pro Container zu bewegen.
Hinweis: Eine Stirnlampe kann nützlich sein, zu lokalisieren und die geschlüpften Larven zu übertragen. - Nachdem alle sichtbaren geschlüpften Larven entfernt haben, Regen Sie das Wasser in den Tank durch Rühren und/oder die Kanten und Ecken des Behälters mit der Pipette Wasserstrahlen hineinblasen.
Hinweis: Dies wird helfen, Larven zu offenbaren, die beim ersten Durchgang wurden verfehlt. - Entsorgen Sie ungenutzte Larven in diesem Stadium unter Beachtung der Richtlinien von Office Labor Wohlfahrt (OLAW). Hinzufügen von Natriumhypochlorit in den Tank, eine Endkonzentration von 6,15 % zu erreichen. Warten Sie mindestens 5 min vor dem Gießen in den Ausguss.
- Beschriften Sie jedes Kinderzimmer Behälter mit dem Datum und der Zeitpunkt der Befruchtung. Kindergarten Container täglich sehen und weiterhin Toten Larven zu entfernen.
4. Vorbereitung der Rädertierchen basierende Fischfutter
- Weitere Informationen auf den Erhalt von Rädertierchen Tabelle der Materialien . Folgen Sie die referenzierte Protokoll zum Einrichten, pflegen und ernten Rädertierchen22.
- Bereiten Fisch Lebensmittel durch Zugabe von 3 mL der Algen-Mischung (siehe Tabelle der Materialien), 1 L des geernteten Rädertierchen. Diese Mischung wird direkt an die Kindergarten-Container als eine Versorgung mit Lebensmitteln hinzugefügt werden.
5. Fütterung von Post-larval Fish
- Wenn die Fische, dass 5 Tage post-Düngung (Dpf), fügen Sie 3 mL Fischfutter (vorbereitet in Schritt 4.2 hinzu) jeder Kindergarten Container. Die optimale Dichte Rädertierchen in dichten Gruppen an den Ecken der Baumschule Behälter sichtbar, und weniger sichtbar sollte in der Mitte des Behälters. Fügen Sie zusätzliche Rädertierchen Mischung, bis die entsprechende Dichte erreicht ist.
- Überprüfen Sie die Behälter täglich auf das Vorhandensein von Rädertierchen und fügen Sie mehr hinzu, wenn die Konzentration aufgebraucht wird. Weiterhin Toten Larven zu entfernen.
- Wenn Fische 14 Dpf erreichen, verschieben Sie sie in einen Behälter mit einem umlaufenden System bei einer Dichte von 5 Fische/L Wasser passen.
Hinweis: Die Anzahl der Überlebenden nach dem Larvenstadium Fische kann zu diesem Zeitpunkt erfasst werden.
6. vollständig-hängen Immunohistochemistry Post-Larven Fische
- Entfernen Sie nach dem Larvenstadium Fisch der gewünschten Etappe von Nahrung für 24 h durch das Gießen der Baumschule Behälter, die Fische durch eine Nylon mesh Sieb und platzieren das Sieb in ein Gefäß mit Wasser sauber Fisch-Ready (siehe Punkt 1.1).
Hinweis: Es ist erforderlich, alle Speisen zu entfernen. Selbst kleine Mengen an Nahrung im Darm sind Auto-fluoreszierende und Bildgebung zu beeinflussen. - Sammeln und die Fische einzuschläfern.
Hinweis: Die Euthanasie-Protokoll sollten OLAW Richtlinien befolgen, und durch Ihre institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt werden. Wir haben festgestellt, dass Tricaine allein nicht Post-Larven Fische einzuschläfern, und die Fische beginnen sich zu bewegen, bei der Übertragung von Tricaine auf Fixiermittel, wenn die Fische nicht auch auf Eis gehalten werden.- Bereiten Sie Tricaine Lösung in ein Becherglas 1 L entionisiertem Wasser 0,4 g Tricaine-S und 0,8 g Natriumbicarbonat hinzufügen, und legen Sie es auf dem Eis.
- Gießen Sie das Wasser mit den Fischen durch ein Sieb Nylon, die Fische zu sammeln. Vorsichtig Tauchen Sie das Sieb im eiskalten Tricaine Lösung und lassen Sie es für 10 min auf Eis.
- Die euthanasierten Fische zu beheben.
- Verwenden Sie eine Transferpipette mit einer abgeschnittenen Spitze den Fisch auf einem konischen Rohr übertragen.
- Entfernen Sie die Tricaine-Lösung mit einer Transferpipette und ersetzen mit Fixiermittel. Inkubieren Sie mit Schaukeln.
Hinweis: Fixiermittel und Fixierung Zeit muss anhand der Antikörper verwendet ermittelt werden. 10 % Formalin-Lösung (4 % Formaldehyd, siehe Materialien) über Nacht bei 4 ° C ist ausreichend für die Antikörper, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
Achtung: Formalin ist giftig und brennbar. Tragen Sie persönlichen Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel und Splash Schutzbrille) und Griff in eine chemische Kapuze. Lösungen mit Formalin müssen als Sondermüll entsorgt werden. - Verwenden Sie eine Transferpipette, um entfernen Sie vorsichtig das Fixiermittel, ohne die Fische zu stören. Fügen Sie 3 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung-Triton Lösung [PBS mit 0,1 % Triton (PBST), finden Sie unter Materialien] und 15 min bei RT mit rockigen inkubieren.
- Entfernen Sie PBST zu und ersetzen Sie durch frisches PBST und inkubieren Sie für 15 min. Wiederholen Sie dieses "waschen" eine zusätzliche Zeit.
Hinweis: Fisch kann in PBS mit 0,02 % Natriumazid bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.
- Durchführen Sie vollständig-hängen Immunostaining.
- Bereiten Sie 50 mL Lösung [PB-0.5% Triton X, 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA), 1 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 0,02 % Natriumazid, 5 % Esel Serum] zu blockieren.
Achtung: Natriumazid und DMSO sind giftig. Persönlicher Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel und Splash Schutzbrille) sollten beim behandeln verwendet werden. Alle Lösungen sollten als Sondermüll entsorgt werden. - Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Fische auf eine 4 mL-Glasflasche mit Schraubverschluss Kappe zu übertragen. Verwenden Sie eine Transferpipette der PBST entfernen und hinzufügen 3 mL Lösung blockiert. Inkubation für 1 h bei RT mit Schaukeln.
- Verwenden Sie eine Transferpipette die blockierende Lösung entfernen und hinzufügen Primärantikörper in blocking-Lösung verdünnt. Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren.
Hinweis: zum Beispiel hinzufügen 1: 250 Verdünnung von Anti-HuC/HuD neuronalen Protein Maus monoklonaler Antikörper (siehe Tabelle der Materialien für eine Liste von Antikörpern, die erfolgreich in A. Mexicanusverwendet wurden). Bei diesem Schritt beizufügen eine Reihe von Fisch mit keine primären Antikörper hinzugefügt. Volumen des Antikörpers sollte ausreichen, um decken Sie die Fische und lassen für Agitation. - Waschen Sie den Fisch 3 Mal mit PBST, wie in Schritt 6.3.4 beschrieben. Ersetzen Sie PBST mit sekundären Antikörper blockieren Lösung verdünnt und Inkubation über Nacht bei RT mit Agitation.
Hinweis: Optimale primäre und sekundäre Antikörper-Konzentrationen, Inkubationszeit und Inkubationstemperatur sollte für jeden Antikörper bestimmt werden. Über Nacht bei RT war effektiv für die Antikörper, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt. - Waschen Sie den Fisch 3 Mal mit PBST, bei jedem Waschen dauert 15 min, wie in Schritt 6.3.4 beschrieben.
- Übertragen Sie den Fisch auf PBS für kurzfristige Lagerung bevor mit sezieren, Montage, oder schneiden den Fisch.
- Bereiten Sie 50 mL Lösung [PB-0.5% Triton X, 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA), 1 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 0,02 % Natriumazid, 5 % Esel Serum] zu blockieren.
Representative Results
Tabelle 1 zeigt Erfolg von Zucht Oberfläche Fische und Tinaja, Molino und Pachón Cavefish in statischen Zucht Becken in einem Jahr. Oberfläche und Pachón laicht mit befruchteten Embryonen immer produziert geschlüpft Larven, während Molino und Tinaja erfolglos einige Zeit (2/6 und 2/18 Veranstaltungen laichen nicht geschlüpfte Larven bzw. produzieren). Es gibt Unterschiede in der Kupplung Größe, das Alter der Eltern Fische zugeschrieben werden nicht angezeigt wird. Tabelle 2 zeigt die Gesamtzahl der geschlüpften Larven resultierend aus einer laichen Veranstaltungen, und das Alter der Eltern Fische. Im Allgemeinen fanden wir, dass die Oberfläche Fische produzieren die größte Anzahl von Larven pro Spawn (durchschnittlich 1.550 ± 894, n = 5), gefolgt von Pachón (durchschnittliche 879 ± 680, n = 6), Tinaja (durchschnittliche 570 ± 373, n = 11), und Molino (durchschnittlich 386 ± 276, n = 3). Die Anzahl der Larven produziert wird in der Regel mehr als pro-Experiment oder für Wachstum zu Erwachsenen erforderlich sind. Wir in der Regel 6-18 Kindergarten Container (120-360 Larven) und die restlichen Fische einzuschläfern.
Um den Erfolg des Protokolls Kindergarten messen verzeichneten wir die Anzahl der geschlüpften Larven und Überlebenden nach dem Larvenstadium Fisch aus erfolgreichen Laichen Veranstaltungen. Tabelle 3 zeigt die Daten von 1 Monat der Zucht im Umluftbetrieb Panzer und enthält die Anzahl der Larven auf Kindergarten-Container, die bis 14 Dpf überlebt übertragen. In diesem Monat reichte die Überlebensrate von 41-81 Prozent in 65-293 Fisch pro Einwohner für Experimente oder Wachstum zu Erwachsenen zur Verfügung.
Um festzustellen, ob ganze-Mount Immunostaining erfolgreich ist, verglichen wir die Fluoreszenz der Proben inkubiert mit Primärantikörper für diejenigen mit nur Sekundärantikörper inkubiert. Das Fluoreszenzsignal ist nur sichtbar in den Fischen mit Primärantikörper inkubiert. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um erfolgreich beschriften Neuronen10 (Abbildung 1) und Zellen der Bauchspeicheldrüse6 in Phasen bis zu 12,5 Dpf in beiden Oberfläche und Höhle Morphotypen.
Abbildung 1: Neuron Kennzeichnung. Vollständig-hängen Immunostaining von A. Mexicanus. Bild von 12,5 Dpf Oberfläche Fischen (ein) und Pachón Cavefish (b). Bild von der mittleren Körperregion [geschlüpften gelben Umriss angezeigt (a) und (b)] Oberfläche Fische (c) und Pachón Cavefish (d) gebeizt mit Pan-neuronale Antikörper (Hu). (e) Confocal Bild einer Region von der Oberfläche Fischen Darm zeigen enterische Neurone (Hu) und deren Projektionen (Schimmelpilzschäden Tubulin). Für dieses Bild war Darm seziert und montiert im Medium mit DAPI um die Kerne zu beflecken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Bevölkerung | Versuche | laichen Veranstaltungen | Kupplungen |
| Oberfläche | 94 | 23 | 23 |
| Molino | 110 | 6 | 4 |
| Pachón | 167 | 13 | 13 |
| Tinaja | 242 | 18 | 16 |
Tabelle 1: Zusammenfassung der Daten aus einem Jahr der Zucht A. Mexicanus in statischen Panzer. Anzahl der Zucht versucht, durch Veranstaltungen, laichen und Anzahl der Ereignisse, die erzeugt Laichen geschlüpften Larven.
| Bevölkerung | Eltern Alter | geschlüpften Larven |
| Oberfläche | 1 Jahr | 989 |
| Oberfläche | 1 Jahr | 1050 |
| Oberfläche | 3 Jahre | 2214 |
| Oberfläche | 3 Jahre | 432 |
| Oberfläche | 3 Jahre | 1768 |
| Oberfläche | 4 Jahre | 2852 |
| Pachón | 1 Jahr | 1194 |
| Pachón | 1 Jahr | 1933 |
| Pachón | 1,5 Jahre | 371 |
| Pachón | 3 Jahre | 480 |
| Pachón | 4 Jahre | 1190 |
| Pachón | 4 Jahre | 110 |
| Tinaja | 9 Monate | 259 |
| Tinaja | 9 Monate | 253 |
| Tinaja | 10 Monate | 1100 |
| Tinaja | 11 Monate | 857 |
| Tinaja | 1 Jahr | 713 |
| Tinaja | 1 Jahr | 853 |
| Tinaja | 1 Jahr | 542 |
| Tinaja | 1,5 Jahre | 360 |
| Tinaja | 1,5 Jahre | 58 |
| Tinaja | 1,5 Jahre | 1100 |
| Tinaja | 4 Jahre | 185 |
| Molino | 2,5 Jahre | 460 |
| Molino | 2,5 Jahre | 619 |
| Molino | 3 Jahre | 81 |
Tabelle 2: ungefähre Alter der Frau und Zahl der geschlüpften Larven von Laich Einzelveranstaltungen aus den angegebenen Populationen von A. Mexicanus.
| Bevölkerung | Versuche | laichen Veranstaltungen | Kupplungen | Gelegegrösse | Larven ins Kinderzimmer Tassen | nach dem Larvenstadium Fisch am 14dpf | Überleben (%) |
| Oberfläche | 4 | 3 | 2 | 576 & 1728 | 360 | 174 | 48 |
| Molino | 4 | 2 | 1 | 228 | 159 | 65 | 41 |
| Tinaja | 4 | 1 | 1 | 1952 | 175 | 93 | 53 |
| Pachón | 4 | 1 | 1 | 1696 | 360 | 293 | 81 |
Tabelle 3: Zusammenfassung der Daten von einem Monat A. Mexicanus in einem umlaufenden System und erhöhen die Larven Zucht. Anzahl der Versuche, was Zucht Kupplungen laichen Veranstaltungen, die geschlüpfte Larven, durchschnittliche Anzahl der Larven pro Gelege, Larven übertragen für den Kindergarten Container und Post-Larven Fische im Kindergarten Container nach 14 Tagen produziert.
Discussion
Vergleich der Genaktivität zwischen Oberfläche und Höhle erfordert A. Mexicanus sorgfältig kontrollierten Umweltparameter und Methoden, die in Laboratorien repliziert werden können. Unser Protokoll für die Anhebung A. Mexicanus bietet konsistente Nährstoffgehalt während der Post-Larvalentwicklung. Im Anschluss an diese Fütterung kann Genfunktion souverän zwischen Populationen mit dem robusten Immunhistochemie Protokoll präsentieren wir verglichen werden. Hier besprechen wir die Bedeutung dieser Methode sowie seine Grenzen und zukünftige Anwendungen.
Um Dichte abgestimmt Wachstum zu erreichen, fanden wir, dass nach dem Larvenstadium Fisch ohne Rezirkulation Wasser für zwei Wochen im 1,5 L Container auf eine Diät von Rädertierchen angehoben werden kann. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Fische auf einem umlaufenden System zu erhöhen; Rädertierchen müssen jedoch täglich hinzugefügt werden, Ausgleich für die verlorenen durch den Tank-Abfluss. Frisch geschlüpfte Artemia -Nauplien werden häufig als Nahrungsquelle in der Aquakultur verwendet, aber wir fanden, dass die Verwendung von Rädertierchen hat erhebliche Vorteile, einschließlich: reduzierter Preis, verbesserte Biosicherheit, konsequente Ernährung und bessere Wasserqualität (siehe unten).
Erstens sind die wöchentlichen Kosten in Verbrauchsmaterialien 4 Dollar für Rädertierchen, im Vergleich zu 14 Dollar für Artemia. Über Biosicherheit, Rädertierchen sind unter kontrollierten Bedingungen im Labor angehoben, während Artemia werden gesammelt, aus der Natur und natürlichen Schwankungen in mikrobiellen oder Erreger Inhalt23. Darüber hinaus sind die Nährstoffzusammensetzung der Artemia Nauplien ökologisch entschlossen und daher unvereinbar. Nauplien gedeihen auf ihre eigenen Energiespeicher nach dem schlüpfen; Sie verlieren schnell Nährwert, wie sie sich entwickeln und optimal zu den Fischen innerhalb einiger Stunden gefüttert werden sollten. Artemia beginnen Fütterung an 12 Haus nach dem Schlupf, auf die das erste Mal, das sie ernährungsphysiologisch angereichert werden konnte; in diesem Stadium sind sie zu groß für 5 Dpf Fisch konsumieren geworden. Im Vergleich dazu fressen Rädertierchen kontinuierlich marine Mikroalgen, was zu hohen Nährstoffgehalt unabhängig davon, wann die Rädertierchen geerntet werden. Rädertierchen sind viel kleiner als Artmeia Nauplien (160 vs. 400 µm), so dass sie leichter für die Fische zu erfassen und zu schlucken. Nach dem Larvenstadium Oberfläche Fisch und Cavefish verbrauchen Rädertierchen in ähnlichen Mengen vorschlagen keinen Unterschied in der Bevorzugung oder Fähigkeit, die Rädertierchen10zu erfassen.
Schließlich beginnen Artemia Nauplien sterben in frischem Wasser mehrere Stunden nach eingeführt. Gefressenes Nauplien werden schwächer, die Wasserqualität rapide abnimmt, wenn sie nicht manuell entfernt werden. Entfernen von Toten Artemia ist zeitraubend und gefährlich für Post-Larven Fische, die sind nicht viel größer als Artemia und möglicherweise versehentlich entfernt oder verletzt. Rädertierchen können auf unbestimmte Zeit in den Kindergarten-Containern zu leben und Essen zu den Fischen jederzeit ohne Beeinträchtigung der Wasserqualität deutlich.
Während mit Rädertierchen, wie eine Nahrungsquelle erhebliche Vorteile hat, die Rädertierchen Lager, Algen halten das Kultursystem täglich hinzugefügt werden muss. Dies kann mit einem Futterautomaten, die flüssigen Algen in den Rädertierchen Kultur Behälter verzichtet (siehe Tabelle der Materialien). Rädertierchen müssen auch aus diesem Set-up alle 24-48 Stunden geerntet werden, um die Gesundheit der Kultur zu erhalten. Forscher, die Fische sehr selten (einmal jährlich, zum Beispiel) züchten und befassen sich nicht mit Vergleiche zwischen den Populationen an Post-Larvenstadien bevorzugen Artemia als Nahrungsquelle, da die verkapselten Embryonen jederzeit ausgebrütet werden können.
Es wird empfohlen, die Kontrollnummer des schraffierten und Überlebenden Larven der Erfolgskontrolle von Schlupf und das Wachstum. Wenn die meisten Embryonen oder Larven sterben, kann es durch bakterielle oder Pilzinfektionen Verschmutzung sein. Es wird empfohlen, die Wasserqualität des Fisch-Ready Wassers zu überwachen und keine Ausrüstung mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Kindergarten Container können wiederverwendet werden, nachdem sie gereinigt und sterilisiert werden. Um das Risiko einer Erkrankung zu minimieren, ist es auch entscheidend für jede Tote Fische aus den Kindergarten Behältern zu entfernen und Rädertierchen vor 5 Dpf nicht hinzufügen, wenn die Fische anfangen zu essen.
A. Mexicanus sind geschlechtsreif ca. ein Jahr alt. Dies ist eine Einschränkung für die Erzeugung von transgenen A. Mexicanus im Vergleich zu Danio Rerio (Zebrafisch), die bei 10-12 Wochen24züchten zu können. Immunhistochemie (IHC) ist eine alternative Methode, Genexpression und Protein Lokalisierung zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll kann bei jedem Schritt angepasst und Antigene in jedem Gewebe des Interesses erkennen verwendet werden. Es ist wichtig, beachten jedoch, dass einige Gewebe möglicherweise schwieriger zu visualisieren in Oberfläche Fische durch Pigmentierung (eine Barriere, die in nichtpigmentierte Cavefish nicht vorhanden ist), welche die Interpretation vergleichender Studien beeinflussen können. Um dieses potentielle Problem zu beheben, kann Oberflächen Fisch Pigment nach der Fixierung mit 3 % Wasserstoffperoxid gebleicht werden.
IHC erfordert erfolgreiche Gewebe Fixierung, blockieren und Antikörper eindringen. Methoden für jeden je nach Gewebe und Protein des Interesses. Das Fixiermittel und Fixierung Mal muss Zellarchitektur beibehalten, unter Beibehaltung der Antigen-Epitop. Für dieses Protokoll wir verwenden eine vernetzende Fixativ (Paraformaldehyd) und Weglassen einer denaturierenden Fixativ (z. B. Methanol oder Aceton). Wir fanden, dass Inkubation in Aceton Antikörper Signal für neuronale und Pankreas Marker vermindert. Die blockierende Schritt unbedingt Antikörper aus der Bindung auf Nichtziel-Proteine im Gewebe zu verhindern. Diese Methode verwendet eine Kombination aus normalen Serum (5 %) und BSA (0,2 %) in der blockierenden Lösung. Die blockierende Lösung enthält Antikörper und Proteine, die an reaktiven Zentren auf Proteine im Gewebe, Verminderung der unspezifischen Bindung der primären und sekundären Antikörper binden.
Um Antikörper Marktdurchdringung zu erreichen, muss das Gewebe permeabilized. Dies lässt sich mit Reinigungsmitteln oder denaturierenden Lösungsmittel aber muss optimiert werden, um die Antigen-Epitop zu bewahren. Unser Protokoll verwendet eine Kombination von Triton und Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Triton und DMSO sind jeweils während der Sperrung und Antikörper Inkubationszeit Schritte bei Konzentrationen von 0,5 % und 1 % enthalten. Mit dieser Konzentration, haben wir beobachtet Färbung im Gehirn, Bauchspeicheldrüse, Darm und Muskeln, was darauf hindeutet, dass es wahrscheinlich effektiver für die Durchdringung aller Gewebe ist. Fischgröße kann eindringen auch beeinflusst werden. Dieses Protokoll wurde nicht auf Fische, die größer als 14 Tage alt (ca. 7 mm in der Länge) getestet. Um Fleckenbildung zu beheben, empfiehlt es sich, die Fixierung, blockieren und Antikörper eindringen Schritte ändern. Es ist auch wichtig, die Reihenfolge Erhaltung die Immunogen mit A. Mexicanus Proteins des Interesses unter Verwendung der verfügbaren Genom-25zu untersuchen.
A. Mexicanus ist ein hervorragendes Modell, Entwicklung zu untersuchen, wie Populationen der gleichen Art, die in völlig unterschiedlichen Umgebungen entwickelt haben im Labor direkt verglichen werden können. Standard Tierhaltung Protokolle, sowohl innerhalb als auch zwischen Labors, sind für das Verständnis der biologischen Unterschiede zwischen Oberfläche Fisch und Cavefish. Unsere Artikel stellt eine Methode zur Entwicklung und Genaktivität in Post-Larven Fische ausgesetzt, stetiges Wachstumsparameter zu untersuchen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- JoVE. Current methods in Astyanax mexicanus research. , Available from: https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018).
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Reed Mariculture Culturing Rotifers in Small Systems (Home or Lab). , Available from: http://reedmariculture.com/support_rotifers_culturing.php (2018).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
- Cave fish assembly and gene annotation. , Available from: http://useast.ensembl.org/Astyanax_mexicanus/Info/Annotation (2018).
