Summary
Neste protocolo, demonstramos como Astyanax mexicanus adultos se reproduzem, levantar as larvas e executar toda a montagem imuno-histoquímica na pós larval peixe para comparar os fenótipos de superfície e caverna morfotipos.
Abstract
Rio e caverna-adaptado de populações de Astyanax mexicanus mostram diferenças em morfologia, fisiologia e comportamento. Pesquisa focada em comparar formas adultas revelou a base genética de algumas destas diferenças. Menos é sabido sobre como as populações diferem em fases pós larvas (no início da alimentação). Tais estudos podem fornecer a introspecção como cavefish sobreviver a idade adulta em seu ambiente natural. Métodos para comparar o desenvolvimento pós-larva em laboratório necessitam de aquicultura padronizada e regimes de alimentação. Aqui descrevemos como criar peixes em uma dieta de rotíferos nutriente-ricos em não-recirculação de água para até fertilização post de duas semanas. Demonstramos como coletar peixes pós-larvas deste sistema de berçário e executar toda a montagem immunostaining. Immunostaining é uma alternativa atraente para a análise da expressão do transgene para investigar o desenvolvimento e função do gene na . mexicanus. O método de viveiro também pode ser usado como um protocolo padrão para estabelecer populações densidade-combinados para crescimento em adultos.
Introduction
O tetra mexicano, Astyanax mexicanus, é uma única espécie de peixe que existe como populações naturais do Rio (peixe de superfície) e um número de populações de caverna-moradia (cavefish) chamado para as cavernas que habitam (i.e., Tinaja, Molino, Pachón). Um número crescente de pesquisadores está usando a. mexicanus para investigar as bases genéticas e do desenvolvimento comportamental1,2,3,4, metabólica5,6 ,7,8e evolução morfológica9,10,11. Recursos disponíveis para estudos da . mexicanus incluem um genoma sequenciado e anotado12; transcriptoma13; tabela do desenvolvimento preparo14; e métodos para criação de16,de15,17, criando transgenics18e edição de genes19. Disseminação de ferramentas adicionais e atualizados protocolos padrão irá acelerar o crescimento da comunidade de pesquisa cavefish (ver estes métodos coleção20).
Nosso objetivo é adicionar ao repertório existente de ferramentas, fornecendo um método robusto para avaliar o gene atividade em situ no pós larval a. mexicanus, de uma forma comparável entre laboratórios. Existem dois desafios para alcançar este objetivo. Em primeiro lugar, há uma necessidade de regimes padronizados para incubação e levantando o peixe entre laboratórios, como diferenças em parâmetros tais como a alimentação e a densidade afeta crescimento e maturação, assim, afetar a atividade do gene. Em segundo lugar, há uma necessidade de um método padronizado ainda adaptável pela análise de padrões de atividade do gene no peixe pós larval. Podemos solucionar esses problemas aqui, estabelecendo práticas padrão para criar peixes para estágios pós-larvas e apresentando um robusto conjunto de montagem imuno-histoquímica (IHC) protocolo para avaliar a expressão gênica na . mexicanus.
Primeiramente, demonstramos como criar o peixe através de desova natural e identificar ovos fertilizados. Próximo descrito é como chocar ovos fertilizados (larvas) e transferi-los para recipientes de berçário, onde eles são mantidos em uma densidade de 20 peixes por contêiner por duas semanas sem recirculação ou trocando a água. Na fertilização post de 5 dias, os peixes desenvolveram para pós larvas estágios (já não ter um fornecimento de gema) e são fornecidos alimentados com algas Brachionus plicatilis (rotíferos) como uma fonte de alimento rico em nutrientes que não exigem a reposição diária. Este método fornece parâmetros de crescimento consistente para o desenvolvimento larval e pós larval.
Para avaliar a função dos genes, demonstramos como remover os peixes de recipientes de berçário e executar toda a montagem IHC. O método IHC apresentado é adaptado de protocolos desenvolvidos para uso com Danio rerio21 e é eficaz para examinar antígenos em todos os tecidos a. mexicanus testados, incluindo o cérebro, intestino e pâncreas. IHC é uma alternativa mais rápida para a geração de animais transgénicos para análise de expressão gênica e a localização da proteína. O presente protocolo será útil para estudos que visam crescer a. mexicanus e comparando os fenótipos de peixe de superfície e cavefish em fases pós larvas.
Protocol
Os procedimentos descritos ao longo deste protocolo foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) na Harvard Medical School e institucional Cuidado Animal.
1. criação de animais
Nota: Existem vários métodos publicados à reprodução15,16,17,20 , que também poderia ser usada neste passo. Antes da criação de animais, peixes adultos são mantidos em um 10:14 luz: escuro ciclo a 23 ° C e alimentados com uma dieta de pelota (ver tabela de materiais) uma vez por dia. Peixes podem ser criados em um sistema de recirculação com filtragem mecânica e esterilização UV. Reprodução também pode ser realizada em reservatórios estáticos (não-recirculação), mas o peixe não deve ser deixado em um tanque de estático por mais de 3 dias, como a qualidade da água degrada-se rapidamente.
- Encher um tanque de 5 galões com água de peixe pronto (cloro água ajustada para: pH = 7,1 + /-2, condutividade = 900 + /-150 µS, temperatura = 23 ° C).
- Coloque o plástico malha (ver materiais) na parte inferior do tanque. Se a criação em tanques estáticos, apor um aquecedor de água ao lado do tanque. Se a reprodução em um sistema de recirculação, coloque um aquecedor de água do cárter do sistema.
Nota: O engranzamento plástico impede que adultos consumindo ovos. - Lugar uma fêmea e dois machos a. mexicanus peixe de mais de 1 ano de idade para o tanque. Permitir que o peixe se adaptar por 30 min.
- Defina a temperatura do aquecedor de 24 ° C (ou 1 ° C mais quente que a temperatura inicial).
- Após 24 h, aumentar a temperatura de 1 ° C.
- Após 24 h, aumentar a temperatura de 1 ° C. Verificar se os tanques diariamente para ovos brilha uma lanterna para o fundo do tanque. Reter o peixe de alimentos durante este período de 3 dias.
- Se desova não tem sido induzido após 3 dias, desligue o aquecedor e permitir que a água voltar à temperatura ambiente (RT) antes de mover o peixe para o seu tanque original.
2. incubação fertilizado ovos
- Uma vez identificados os ovos em um tanque de reprodução, remova a adultos e engranzamento plástico e reduzir a água a uma profundidade de 10 cm, usando um copo ou xícara.
Nota: Para estimar o tempo de desova, use uma pipeta de transferência para colocar vários ovos em um prato de Petri e visualizá-las com um microscópio para determinar o estágio14 e estimar o tempo de fertilização. - Mover o tanque para uma superfície de trabalho conveniente e remover qualquer opacos ovos ou fezes, deixando só os ovos translúcidos, fértil no tanque.
Nota: O número de ovos férteis pode ser gravado neste momento. - Encha o tanque com peixe-pronto (consulte a etapa 1.1) de água e adicionar 6-7 gotas de azul de metileno ao tanque, como a água enche.
Nota: A concentração final de azul de metileno é aproximadamente 1,5 ppm. - Adicione um aquecedor e o borbulhador de aquário (anexado a uma bomba de ar, com um regulador) para o tanque.
- Definir o aquecedor de 24 ° C e ajuste o regulador de fluxo de ar para produzir um fluxo suave de bolhas.
- Coloque uma tampa do tanque para ajudar a manter a temperatura da água.
Nota: Os ovos devem começar a incubação dentro de 24h da época reprodutora.
3. transferência de larvas hachuradas para recipientes de berçário
- Adicionar 20 g de sal (ver materiais) para 8 L de peixe pronto (consulte a etapa 1.1) de água e mexa até dissolver. Encha cada recipiente de berçário de 1,5 L (ver materiais) com 1 L de água preparada.
- Use uma pipeta de transferência para mover hachuradas larvas em recipientes de viveiro preparado em uma densidade de 20 peixes por recipiente.
Nota: Um farol que pode ser útil para localizar e transferir as larvas hachuradas. - Depois de retirado todas as larvas hachuradas visíveis, agite a água no tanque por agitação e/ou soprar jatos de água nas bordas e cantos do tanque com a pipeta.
Nota: Isto vai ajudar a revelar as larvas que foram perdidas na primeira passagem. - Descarte de larvas não utilizadas nesta fase usando as diretrizes do escritório de bem-estar laboratório (OLAW). Adicione o hipoclorito de sódio ao tanque para obter uma concentração final de 6.15%. Espere pelo menos 5 min antes de derramar na pia.
- Etiquete cada recipiente de berçário com a data e hora de fertilização. Ver os recipientes berçário diariamente e continuar a remover qualquer larvas mortas.
4. preparação de comida de peixe Rotifera-baseado
- Consulte Tabela de materiais para informação sobre obtenção de rotíferos. Siga o protocolo referenciado para configurar, manter e rotíferos22da colheita.
- Preparar peixes alimentos adicionando-se 3 mL de mistura de algas (ver Tabela de materiais) para 1 L de rotíferos colhidos. Esta mistura será adicionada diretamente para os recipientes de berçário como um suprimento de alimentos.
5. alimentação de peixes pós-larvas
- Quando os peixes são 5 dias pós fertilização (dpf), adicione 3 mL de comida de peixe (preparada na etapa 4.2) para cada recipiente de berçário. A densidade ideal, rotíferos devem ser visível em grupos densos nos cantos dos recipientes de berçário e menos aparente no centro do recipiente. Adicione a mistura de Rotifera adicionais até que chegou-se a densidade adequada.
- Verificar os recipientes diariamente para a presença de rotíferos e adicionar mais se a concentração fica empobrecida. Continue a remover qualquer larvas mortas.
- Quando o peixe atingir 14 dpf, movê-los para um tanque com um sistema de recirculação em uma densidade de 5 peixes por litro de água.
Nota: O número de sobrevivência pós-larval peixe pode ser gravado neste momento.
6. toda a montagem imuno-histoquímica do peixe pós-larvas
- Remover peixes pós-larvas da fase desejada de comida para 24h derramando o recipiente de berçário contendo os peixes através de nylon malha filtro e colocar o filtro em um recipiente com água limpa peixe pronto (consulte a etapa 1.1).
Nota: É essencial para remover todos os alimentos. Mesmo pequenas quantidades de alimentos no intestino são autofluorescente e irão influenciar a imagem latente. - Coletar e eutanásia o peixe.
Nota: O protocolo de eutanásia deve seguir diretrizes OLAW e ser aprovado pelo seu Comité de uso e cuidado institucional do Animal. Observamos que tricaina sozinha não eutanásia peixe pós-larva, e o peixe começa a se mover quando transferidos de metanosulfonato de fixador, se os peixes não são também mantidos no gelo.- Preparar tricaina solução em um béquer adicionando 0,4 g de tricaina-S e 0,8 g de bicarbonato de sódio para 1 litro de água deionizada e colocá-lo no gelo.
- Despeje a água que contém os peixes através de um filtro de malha de nylon para recolher os peixes. Delicadamente mergulhe o filtro na solução de tricaina gelada e deixá-lo no gelo por 10 min.
- Conserte o peixe euthanized.
- Use uma pipeta de transferência com uma dica de corte para transferir os peixes para um tubo cônico.
- Remover a solução tricaina com uma pipeta de transferência e substituir com fixador. Incube com balanço.
Nota: Fixador e fixação de tempo deve ser determinado com base no anticorpo usado. solução de formalina 10% (4% de formol, veja materiais) durante a noite a 4 ° C é adequada para os anticorpos listados na Tabela de materiais.
Atenção: O formol é tóxico e inflamável. Usar equipamento de proteção individual (luvas, jaleco e óculos de mergulho) e manipular em uma capa de química. Soluções que contenham formol devem ser eliminadas como resíduos perigosos. - Use uma pipeta de transferência para remover cuidadosamente o fixador sem perturbar os peixes. Adicionar 3 mL de fosfato tamponado solução salina-Tritão [PBS com 0.1% Triton (PBST), Ver os materiais] e incube por 15 min em RT com balanço.
- PBST de remover e substituir com PBST fresco e incube por 15 min. Repita este "lavar" uma vez adicional.
Nota: Os peixes podem ser armazenados em PBS contendo 0,02% de azida de sódio a 4 ° C durante várias semanas.
- Execute toda a montagem immunostaining.
- Prepare-se 50 mL de solução [PB-0.5% Triton X, 0,2% albumina de soro bovino (BSA), 1% dimetilsulfóxido (DMSO), 0,02% de azida de sódio, 5% de soro de burro] de bloqueio.
Cuidado: Azida de sódio e DMSO são tóxicos. Equipamento de proteção individual (luvas, jaleco e óculos de mergulho) deve ser usado quando estiver manipulando. Todas as soluções devem ser eliminadas como resíduos perigosos. - Use uma pipeta de transferência para transferir os peixes para um frasco de vidro de 4 mL com tampa de rosca-top. Use uma pipeta de transferência para remover o PBST e adicionar 3 mL de solução de bloqueio. Incube durante 1 h a RT com balanço.
- Use uma pipeta de transferência para remover a solução de bloqueio e adicionar o anticorpo primário, diluído em solução de bloqueio. Incube durante uma noite em temperatura ambiente com agitação.
Nota: por exemplo, adicionar a diluição de 1: 250 de proteína Neuronal Mouse Monoclonal anticorpo anti-HuC/HuD (ver Tabela de materiais para obter uma lista de anticorpos que têm sido utilizados com sucesso na . mexicanus). Um conjunto de peixes com nenhum anticorpo primário adicionado deve ser incluído neste passo. Volume de anticorpo deve ser suficiente para cobrir o peixe e permitir a agitação. - Lave o peixe 3 vezes com PBST conforme descrito na etapa 6.3.4. Substituir o PBST com anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio e incubar durante a noite a RT com agitação.
Nota: Concentrações do anticorpo primário e secundário, tempo de incubação e temperatura de incubação devem ser determinados para cada anticorpo. Pernoite na RT foi eficaz para os anticorpos listados na Tabela de materiais. - Lave o peixe 3 vezes com PBST, com cada lavagem dura 15 min, conforme descrito na etapa 6.3.4.
- Transfira o peixe para PBS para armazenamento a curto prazo, antes de prosseguir com a dissecar, montagem, ou corte o peixe.
- Prepare-se 50 mL de solução [PB-0.5% Triton X, 0,2% albumina de soro bovino (BSA), 1% dimetilsulfóxido (DMSO), 0,02% de azida de sódio, 5% de soro de burro] de bloqueio.
Representative Results
A tabela 1 mostra o sucesso durante um ano de reprodução de peixes de superfície e cavefish Tinaja, Molino e Pachón nos tanques de reprodução estática. Superfície Pachón desova com embriões fertilizados sempre produzidos dos ovos as larvas, enquanto Molino e Tinaja tiveram sucesso algum tempo (2/6 e 2/18 eventos de desova não produzem larvas hachuradas, respectivamente). Há variação no tamanho da embreagem que não aparece para ser atribuído à idade do peixe pai. A tabela 2 mostra o número total de larvas hachuradas resultantes de alguns dos eventos de desova e a idade do peixe pai. Em geral, achamos que o peixe de superfície produzir o maior número de larvas por desova (média ± 1.550 894, n = 5), seguido por Pachón (média ± 879 680, n = 6), Tinaja (média ± 570 373, n = 11) e Molino (média ± 386 276, n = 3). O número de larvas produzidas é normalmente mais do que são necessários por experiência ou de crescimento em adultos. Normalmente montamos 6-18 recipientes de berçário (120-360 larvas) e abater o peixe restante.
Para medir o sucesso do protocolo de berçário, registramos o número de larvas hachuradas e peixe pós-larvas sobreviventes de eventos bem sucedidos de desova. A tabela 3 mostra dados de 2 meses de criação em tanques de recirculação e inclui o número de larvas transferidas para recipientes de berçário que sobreviveram aos 14 dpf. Durante este mês, a taxa de sobrevivência variou de 41-81 por cento, resultando em 65-293 peixes disponíveis por população para experiências ou crescimento em adultos.
Para determinar se immunostaining toda a montagem é bem sucedido, comparamos a fluorescência das amostras incubadas com anticorpo primário para aqueles incubado com anticorpo secundário apenas. O sinal fluorescente só é visível no peixe incubado com anticorpo primário. Nós usamos este protocolo para rotular os neurônios10 (Figura 1) e células pancreáticas6 em fases até 12.5 dpf em ambos superfície e caverna morfotipos com êxito.
Figura 1: neurônio rotulando. Toda a montagem imunocoloração de a. mexicanus. Imagem de 12,5 dpf superfície peixe (um) e Pachón cavefish (b). Imagem da região mid-corpo [hachurado contorno amarelo mostrado no (a) e (b)] de peixes de superfície (c) e Pachón cavefish (d) corados com anticorpo pan-neuronal (Hu). imagem de uma região de neurônios entéricos apresentando intestino de peixes de superfície (Hu) e suas projeções (tubulina acetilada) (e), Confocal. Para esta imagem, o intestino foi dissecado para fora e montado em meio contendo DAPI para manchar os núcleos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| população | tentativas | eventos de desova | embreagens |
| superfície | 94 | 23 | 23 |
| Molino | 110 | 6 | 4 |
| Pachón | 167 | 13 | 13 |
| Tinaja | 242 | 18 | 16 |
Tabela 1: Resumo dos dados de um ano de reprodução A. mexicanus em reservatórios estáticos. Número de reprodutores de tentativas, resultantes de eventos, de desova e número de eventos que produziu de desova larvas recém-eclodidas.
| população | idade do pai | hachurada larvas |
| superfície | 1 ano | 989 |
| superfície | 1 ano | 1050 |
| superfície | 3 anos | 2214 |
| superfície | 3 anos | 432 |
| superfície | 3 anos | 1768 |
| superfície | 4 anos | 2852 |
| Pachón | 1 ano | 1194 |
| Pachón | 1 ano | 1933 |
| Pachón | 1,5 anos | 371 |
| Pachón | 3 anos | 480 |
| Pachón | 4 anos | 1190 |
| Pachón | 4 anos | 110 |
| Tinaja | 9 meses | 259 |
| Tinaja | 9 meses | 253 |
| Tinaja | 10 meses | 1100 |
| Tinaja | 11 meses | 857 |
| Tinaja | 1 ano | 713 |
| Tinaja | 1 ano | 853 |
| Tinaja | 1 ano | 542 |
| Tinaja | 1,5 anos | 360 |
| Tinaja | 1,5 anos | 58 |
| Tinaja | 1,5 anos | 1100 |
| Tinaja | 4 anos | 185 |
| Molino | 2,5 anos | 460 |
| Molino | 2,5 anos | 619 |
| Molino | 3 anos | 81 |
Tabela 2: aproximar a idade feminina e número de larvas hachuradas de eventos individuais de desova de populações indicados de A. mexicanus.
| população | tentativas | eventos de desova | embreagens | tamanho da embreagem | as larvas transferidas para copos de berçário | pós-larva peixe na 14dpf | sobrevivência (%) |
| superfície | 4 | 3 | 2 | 576 & 1728 | 360 | 174 | 48 |
| Molino | 4 | 2 | 1 | 228 | 159 | 65 | 41 |
| Tinaja | 4 | 1 | 1 | 1952 | 175 | 93 | 53 |
| Pachón | 4 | 1 | 1 | 1696 | 360 | 293 | 81 |
Tabela 3: Resumo dos dados de um mês da . mexicanus de reprodução em um sistema de recirculação e levantando as larvas. Número de tentativas, resultantes de reprodução desova eventos, embreagens que produziu larvas hachuradas, número médio de larvas por embreagem, larvas transferidas para os contêineres de berçário e pós-larvas peixes presentes no contentor de berçário após 14 dias.
Discussion
Comparando a atividade do gene entre a superfície e a caverna a. mexicanus requer parâmetros ambientais cuidadosamente controlados e métodos que podem ser replicados através de laboratórios. Nosso protocolo para disparar a. mexicanus fornece consistente conteúdo nutricional durante o desenvolvimento pós larval. Após este regime alimentar, função do gene pode ser comparada com confiança entre populações usando o protocolo de imuno-histoquímica robusto que apresentamos. Aqui vamos discutir a importância desse método, bem como suas limitações e aplicações futuras.
Para atingir a densidade correspondente crescimento, encontramos que peixe pós larval pode ser levantada sem recirculação de água para duas semanas em recipientes de 1,5 L, em uma dieta de rotíferos. Este protocolo também pode ser usado para criar peixes em um sistema de recirculação; no entanto, rotíferos devem ser adicionados diariamente para compensar aqueles perdidos na saída do tanque. Náuplios de Artemia recém eclodidos são comumente usados como fonte de alimento na aquicultura, mas achamos que usar rotíferos tem vantagens consideráveis, incluindo: reduzido preço, biossegurança melhorada, nutrição consistente e melhor qualidade da água (veja abaixo).
Em primeiro lugar, o custo semanal em consumíveis é 4 dólares por rotíferos, comparados a 14 dólares para Artemia. Sobre Biossegurança, rotíferos são gerados em laboratório sob condições controladas, enquanto Artemia são coletados na natureza e sujeitos a variação natural em microbiana ou patógeno Sumário23. Além disso, a composição de nutrientes de náuplios de Artemia são ambientalmente determinado e, portanto, inconsistente. Náuplios prosperam em suas próprias lojas da energia após a eclosão; Eles rapidamente perdem o valor nutritivo como eles desenvolvem e idealmente devem ser alimentados com os peixes dentro de algumas horas. Artemia começam a alimentar-se na casa 12 pós-incubação, representando a primeira vez que eles poderiam ser nutricionalmente enriquecidos; no entanto, nesta fase eles tornaram-se demasiado grandes para 5 peixes dpf consumir. Em comparação, rotíferos continuamente se alimentam de microalgas marinhas, resultando em alto índice nutriente independentemente quando os rotíferos são colhidos. Rotíferos são muito menores do que os náuplios de Artmeia (160 x 400 mícrons), tornando-os mais fácil para o peixe capturar e engolir. Cavefish e peixes de superfície pós-larvas consomem rotíferos em quantidades semelhantes, sugerindo que não há diferença na preferência ou capacidade de capturar os rotíferos10.
Finalmente, náuplios de Artemia começam a morrer, em água doce, várias horas depois de ser apresentado. Restos de náuplios irão decair, diminuindo rapidamente a qualidade da água, se eles não são removidos manualmente. Remover o morto Artemia é demorado e perigoso para peixes pós larvas que não são muito maiores que as da artemísia e podem ser acidentalmente removido ou feridos. Rotíferos podem viver indefinidamente no contentor de berçário e prestação de alimentos aos peixes em todos os momentos sem afetar significativamente a qualidade da água.
Enquanto usar rotíferos como fonte de alimento tem benefícios consideráveis, para manter as algas de estoque, Rotifera deve ser adicionado ao sistema de cultura diariamente. Isto pode ser conseguido com um alimentador automático que dispensa algas líquidas dentro do recipiente de cultura Rotifera (ver Tabela de materiais). Rotíferos devem também ser colhidos este set-up a cada 24-48 horas para manter a saúde da cultura. Pesquisadores que criam peixe muito raramente (uma vez por ano, por exemplo) e não estão preocupados em fazer comparações entre as populações no pós larvas estágios podem preferir Artemia como fonte de alimento, uma vez que os embriões encysted podem ser aquecidos a qualquer momento.
Recomendamos que o número de larvas hachuradas e sobreviventes para monitorar o sucesso da incubação e crescimento de rastreamento. Se a maioria dos embriões ou larvas morrer, pode ser devido à contaminação bacteriana ou fúngica. Recomenda-se monitorar a qualidade da água da água a peixe pronto e esterilizar todos os equipamentos com etanol a 70%. Recipientes de berçário podem ser usados novamente depois que eles são limpos e esterilizados. Para minimizar o risco de doença, é também fundamental para remover qualquer peixe morto de recipientes de berçário e não adicionar rotíferos antes dpf 5, quando os peixes começam a comer.
A. mexicanus são sexualmente maduros em cerca de um ano de idade. Esta é uma limitação para a geração de transgénicos a. mexicanus comparado com Danio rerio (zebrafish) que são capazes de se reproduzir em 10-12 semanas24. Imuno-histoquímica (IHC) é um método alternativo para investigar a expressão dos genes e a localização da proteína. O protocolo descrito aqui pode ser adaptado a cada passo e usado para detectar antígenos em qualquer tecido de interesse. É importante observar, no entanto, que alguns tecidos podem ser mais difíceis de Visualizar em peixes de superfície devido à pigmentação (uma barreira que não existe em unpigmented cavefish), que podem influenciar a interpretação de estudos comparativos. Para resolver esse problema potencial, superfície peixe pigmento pode ser branqueado após fixação usando 3% de peróxido de hidrogênio.
IHC requer fixação de tecidos bem sucedidos, bloqueio e penetração de anticorpo. Métodos para cada variam dependendo do tecido e da proteína de interesse. O fixador e fixação de tempo deve preservar a arquitetura cell, mantendo o epítopo do antígeno. Para este protocolo, podemos usar um fixador do cross-linking (paraformaldeído) e omitir um fixador de desnaturação (como metanol ou acetona). Nós achamos que a incubação em acetona diminuída sinal de anticorpo para marcadores neuronais e do pâncreas. A etapa de bloqueio é essencial para evitar anticorpos de ligação às proteínas não-alvo no tecido. Este método usa uma combinação de soro normal (5%) e BSA (0,2%) na solução de bloqueio. A solução de bloqueio contém anticorpos e proteínas que se ligam aos locais reativos em proteínas no tecido, diminuindo a ligação não-específica dos anticorpos primários e secundários.
Para atingir a penetração do anticorpo, o tecido deve ser permeabilizado. Isto pode ser conseguido com detergentes ou solventes de desnaturação, mas deve ser otimizado para preservar o epítopo do antígeno. Nosso protocolo usa uma combinação de Triton e dimetil sulfóxido (DMSO). Triton e DMSO são incluídos durante as etapas de incubação bloqueando e anticorpos em concentrações de 0,5% e 1%, respectivamente. Usando esta concentração, temos observado a coloração no cérebro, pâncreas, intestino e músculo, sugerindo que é provável eficaz para penetração em todos os tecidos. Tamanho dos peixes também pode influenciar a penetração. Este protocolo não foi testado em peixes maiores que 14 dias de idade (aproximadamente 7 mm de comprimento). Para solucionar problemas de mancha, é aconselhável alterar as etapas de penetração de fixação, bloqueio e anticorpo. Também é importante examinar a conservação da sequência do antígeno com a proteína a. mexicanus de interesse usando o genoma disponíveis25.
A. mexicanus é um excelente modelo para investigar a evolução como populações da mesma espécie que evoluíram em ambientes drasticamente diferentes podem ser comparadas diretamente no laboratório. Protocolos padrão de criação, tanto dentro como entre laboratórios, são essenciais para a compreensão das diferenças biológicas entre os peixes de superfície e cavefish. Nosso artigo fornece um método para examinar o desenvolvimento e a atividade do gene em pós larvas peixes expostos aos parâmetros de crescimento consistente.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por concessões do National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
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