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Genetics

बैक्टीरिया पर चयन और विकास के आधार पर Dictyostelium discoideum कोशिकाओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58981
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3, 4,5, 1, 1
1MRC Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 3Cancer Research UK Beatson Institute Glasgow, 4MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 5Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Summary

Dictyostelium discoideum सेल माइग्रेशन, endocytosis, और विकास जैसे जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल जीव है । जीव की उपयोगिता आनुवंशिक हेरफेर की व्यवहार्यता पर निर्भर है । यहां, हम transfect Dictyostelium discoideum कोशिकाओं है कि तरल मीडिया में संवर्धन कोशिकाओं की मौजूदा सीमाओं को दूर करने के लिए तरीके मौजूद हैं ।

Abstract

Dictyostelium discoideum विकास के दौरान सेल भेदभाव प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक पेचीदा मॉडल जीव है, सेल संकेतन, और अंय महत्वपूर्ण सेलुलर जीव विज्ञान प्रश्न । आनुवंशिक रूप से Dictyostelium कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए उपलब्ध प्रौद्योगिकियों अच्छी तरह से विकसित कर रहे हैं । Transfections मुताबिक़ पुनर्संयोजन और सम्मिलनी mutagenesis सहित विभिन्न चयन मार्करों और मार्कर री-साइकलिंग का उपयोग कर किया जा सकता है । यह एक अच्छी तरह से व्याख्या जीनोम द्वारा समर्थित है । हालांकि, इन तरीकों axenic कोशिका तरल संस्कृतियों में बढ़ रही लाइनों के लिए अनुकूलित कर रहे है और गैर axenic जंगली प्रकार की कोशिकाओं है, जो केवल बैक्टीरिया पर फ़ीड को लागू करने के लिए मुश्किल है । उत्परिवर्तनों कि axenic उपभेदों में उपस्थित है परेशान रास संकेतन, अत्यधिक macropinocytosis के कारण खिला के लिए आवश्यक है, और कोशिका प्रवास ख़राब है, जो संकेत transduction और उन उपभेदों में chemotaxis प्रयोगों की व्याख्या को निराधार । पहले आनुवंशिक रूप से हेरफेर गैर axenic कोशिकाओं के प्रयास दक्षता और आवश्यक जटिल प्रायोगिक प्रक्रियाओं का अभाव है । हम एक सरल अभिकर्मक प्रोटोकॉल है कि, पहली बार के लिए, इन सीमाओं पर काबू पाता विकसित किया है । Dictyostelium आणविक आनुवंशिकी के लिए बड़े सुधार की उन श्रृंखला जंगली प्रकार की कोशिकाओं के रूप में आसानी से मानक प्रयोगशाला उपभेदों के रूप में हेरफेर करने की अनुमति । भ्रष्ट संकेत और गतिशीलता प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए फायदे के अलावा, म्यूटेंट कि macropinocytosis आधारित विकास को बाधित अब आसानी से अलग किया जा सकता है. इसके अलावा, पूरे अभिकर्मक कार्यप्रवाह बहुत तेज है, रिकॉमबिनेंट कोशिकाओं है कि दिनों के बजाय हफ्तों में उत्पंन किया जा सकता है के साथ । एक और लाभ यह है कि आणविक आनुवंशिकी और पर्यावरण से हौसले से अलग जंगली प्रकार Dictyostelium नमूनों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है । यह इन शोध क्षेत्रों में उपयोग किए गए दृष्टिकोणों का दायरा बढ़ाने में मदद कर सकता है ।

Introduction

Dictyostelium जीनस मिट्टी रहने वाले सामाजिक अमीबा कि मुख्य रूप से बैक्टीरिया पर फ़ीड कर रहे हैं । जाति Amoebozoa में रखा जा रहा है, प्रजातियों की एक बड़ी संख्या है कि चार अलग पहने1में वर्गीकृत किया जा सकता अलग किया गया है । प्रजातियों Dictyostelium discoideum (discoideum) सेल माइग्रेशन और phagocytosis के रूप में जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल जीव बन गया है । प्रयोगात्मक स्थितियों को नियंत्रित करने और मानकीकरण करने के लिए, axenic कोशिका रेखाओं को विकसित किया गया है जो बैक्टीरिया2के अभाव में जटिल या परिभाषित तरल माध्यमों में वृद्धि करने में सक्षम हैं । विशेष महत्व के Ax2, Ax3, और Ax4 उपभेदों, जो सभी 1970 के दशक में उत्पंन और अंत में एक जंगली अलग NC43से व्युत्पंन थे । आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए उपकरण इन axenic उपभेदों में विकसित किया गया, पहले नॉकआउट में प्रकाशित १९८७4,5में जिसके परिणामस्वरूप । प्रोटोकॉल और विकसित और axenic6,7शर्तों के तहत उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया ।

इन प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए जंगली प्रकार discoideum उपभेदों है कि तरल शोरबा में विकसित करने में सक्षम नहीं है कई प्रयोगशालाओं द्वारा प्रयास किया गया है । हालांकि, यह पूरी तरह से सफल नहीं हो गया है क्योंकि अभिकर्मक प्रोटोकॉल जटिल है और दक्षता की कमी है, के कारण भाग में बैक्टीरिया की क्षमता के लिए एक सिंक के रूप में कार्य करने के लिए चयनित रिएजेंट8,9. एक परिणाम के रूप में, मूलतः discoideum पर सभी आणविक डेटा एक जंगली प्रकार अलग के वंशज से आता है । हम इस सीमा पर काबू पाने और आनुवंशिक रूप से अपने तरल माध्यम में विकसित करने की क्षमता के discoideum कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए एक विधि विकसित करना चाहता था । इस तरह के एक विधि के लिए की जरूरत है कि यह अतीत में ग्रहण किया गया है कि axenic विकास की अनुमति उत्परिवर्तनों मुख्य रूप से तटस्थ थे और कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान ख़राब नहीं किया था अवलोकन द्वारा समझाया जा सकता है । यह अनुमान केवल आंशिक रूप से सही है । सामांय में, वहां दो उल्लेखनीय अंतर हैं; विभिंन पृथक axenic उपभेदों के बीच पहला, और दूसरा, जब इन axenic उपभेदों गैर के साथ तुलना कर रहे है axenic वंय8,9अलग ।

शायद सबसे महत्वपूर्ण कारक है कुंजी axenic जीन, कुल्हाड़ी बी, कि हाल ही में RasGAP NF1 के रूप में पहचान की गई थी । एक RasGAP के रूप में NF1 के प्रमुख समारोह रास गतिविधि3को नियंत्रित करने के लिए है । सभी axenic उपभेदों में एंजाइम का विलोपन अत्यधिक रास बड़ी सक्रिय रास पैच के गठन के रूप में प्रकट गतिविधि की ओर जाता है । इन बढ़े हुए रास पैच प्लाज्मा झिल्ली में PIP3 के संचय के लिए सीसा । उन संयोग PIP3 और सक्रिय रास के धब्बे दिखने एक परिपत्र असंतोष है कि अंततः बंद कर देता है और10macropinosomes के गठन की ओर जाता है के गठन के लिए एक टेंपलेट हैं । परिणाम macropinocytic गतिविधि में अत्यधिक वृद्धि हुई है । Macropinocytosis एक actin-संचालित प्रक्रिया है । या तो macropinosomes या pseudopods के गठन के लिए cytoskeletal घटकों के लिए एक प्रतियोगिता का परिणाम है । कोशिका व्यवहार पर इसका प्रभाव वनस्पति कोशिकाओं के chemotaxis के लगभग पूर्ण रोकथाम में फोलेट११से परिलक्षित होता है. बड़े पैमाने पर बढ़े PIP3 पैच बहुत लगातार कर रहे हैं । यहां तक कि भूखे कोशिकाओं में, PIP3 पैच रहते हैं और pseudopods के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती है, जो शिविर के लिए chemotaxis पर अध्ययन की व्याख्या समस्याओं का कारण बन सकता है.

कुछ मामलों में, NF1 उत्परिवर्तन प्रयोग उपयोगी है । यह हमें एक दूसरी प्रेरणा के लिए एक अभिकर्मक विधि विकसित बैक्टीरियल discoideum कोशिकाओं के विकास के लिए होता है, macropinocytosis दर में वृद्धि के बाद से axenic इस प्रक्रिया के मौलिक पहलुओं की जांच के लिए मूल्यवान कोशिकाओं बनाता है12 . हालांकि, macropinocytosis के लिए आवश्यक जीन में उत्परिवर्तन, जैसे रास और PI3-kinases10, लगभग axenic विकास को समाप्त कर दिया है, यह आवश्यक बनाने के बैक्टीरिया पर विकास के माध्यम से इन कोशिकाओं में हेरफेर । एक और कारण है कि renders बैक्टीरिया आधारित transfections मूल्यवान Dictyostelids के बढ़ते उपयोग के लिए बहु के विकास में सवालों का पता लगाने है सेलुलर13,14, परिजन मांयता15,16, और परोपकारी सेलुलर व्यवहार है, जो मुख्य रूप से नए सिरे से अलग जंगली प्रकार के उपयोग पर निर्भर17अलग । सभी उल्लेख अनुसंधान क्षेत्रों जंगली अलग है, जो गैर axenic और तरल शोरबा में वृद्धि नहीं कर रहे है के आनुवंशिक हेरफेर के लिए कुशल तरीके से सुविधा हो सकती है ।

हमारे प्रोटोकॉल वर्णित सीमाओं पर काबू पाने के लिए अनुमति देते हैं । साथ में ले लिया, बैक्टीरियल हो discoideum कोशिकाओं के साथ आनुवंशिक जोड़तोड़ प्रदर्शन की संभावना सभी Dictyostelium शोधकर्ताओं के लिए लाभ रखती है, भले ही यह तेजी के कारण चयन प्रक्रिया की वृद्धि की गति है axenic मीडिया (10 एच दोहरीकरण समय) में वृद्धि की तुलना में बैक्टीरिया पर अमीबा (4 एच दोहरीकरण समय) की वृद्धि ।

Protocol

1. कोशिकाओं और सामग्री की तैयारी

  1. SorMC बफर वडा
    1. 100x SorMC के १०० मिलीलीटर तैयार करें (MgCl2 और CaCl2सहित सोरेनसेन बफर) बफर को भंग करके २०.३६ ग्राम के KH2पीओ4 (15 मिमी) और ५.४७ जी केएनए 2HPO4· 7 ज2ओ (2mM) में १०० मिलीलीटर की ddH2हे पानी । कमरे के तापमान (आरटी) में समाधान हलचल और डीएच2ओ के साथ १०० मिलीलीटर के लिए मात्रा लाने के लिए ।
      नोट: परिणामी बफ़र 6 का पीएच है और आगे समायोजन की आवश्यकता नहीं है ।
    2. ddH में 1x काम समाधान के १००० मिलीलीटर उत्पादन2ओ जोड़ें ५० µ एल प्रत्येक MgCl2 और CaCl2 के अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए ५० µ मी प्रत्येक । फ़िल्टर एक ०.२२ µm फ़िल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल ।
      नोट: हमेशा MgCl2 और CaCl2 1x बफर करने के लिए 100x स्टॉक समाधान में लवण की वर्षा से बचने के लिए जोड़ें ।
    3. वैकल्पिक रूप से, तैयारकेके 2 बफर (२.२ जी के KH2पीओ4 और ०.७ जी के2HPO4 बफर के 1 एल के लिए) ५० µ एम MgCl2 और ५० µ एम CaCl2 के साथ पूरक (इस के साथ साथ के रूप में भेजा केके2एम सी) । SorMC के बजाय इस बफ़र का उपयोग करें ।
  2. डी. discoideum के लिए खाद्य स्रोत के रूप में बैक्टीरिया की तैयारी
    1. K. aerogenes और inoculate 1 के एक एकल कॉलोनी का प्रयोग करें पौंड के एल-मध्यम (lysogeny शोरबा) । एक 2 L कुप्पी का प्रयोग करें । जीवाणु २२० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने देते हैं ।
      नोट: यदि बैक्टीरिया की बड़ी मात्रा में आवश्यक हैं, 2xTY की तरह अमीर मीडिया का उपयोग करें (खमीर निकालने tryptone माध्यम) या सिसकी (सुपर इष्टतम शोरबा) के बजाय पौंड । मामले में K. aerogenes बैक्टीरिया के उपयोग की अनुमति सुरक्षा प्रतिबंधों के कारण नहीं है, BL21 ई. कोलाई बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. फसल की कोशिकाओं को अगले दिन उंहें कताई नीचे २ ५०० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में ~ ६,६०० एक्स जी पर 20 मिनट के लिए SorMC बफर के ५०० मिलीलीटर के साथ एक बार धो बैक्टीरिया ।
    3. SorMC के 20 मिलीलीटर में गोली स्थगित । एक फोटोमीटर का उपयोग कर आयुध डिपो६०० (६०० एनएम में ऑप्टिकल घनत्व) की जांच करें । लगभग १०० के एक आयुध डिपो६०० के लिए एक ही बफर के साथ पतला ।
      नोट: aerogenes बैक्टीरिया गोली करने के लिए मुश्किल हैं, तो नीचे बैक्टीरिया कताई के लिए एक अपेक्षाकृत उच्च गति खाद्य बैक्टीरिया की हानि से बचने के लिए आवश्यक है । परिणामस्वरूप बैक्टीरियल स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में करने के लिए 4 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है और discoideumके लिए खाद्य स्रोत के रूप में अपनी उपयोगिता को बनाए रखने । 1 L रात भर K. aerogenes पौंड मध्यम में बढ़ी निलंबन आमतौर पर १०० के आसपास के एक आयुध डिपो६०० के 20 मिलीलीटर पैदावार ।
      सावधानी: यह सुनिश्चित करने के लिए कि तैयार बैक्टीरिया K. aerogenesके एक monoculture हैं, एक हुड के अंतर्गत सभी चरण निष्पादित करते हैं ।
  3. H40 electroporation बफर की तैयारी
    1. बफर समाधान के १०० मिलीलीटर तैयार, ddH2हे पानी में HEPES के ०.९५२ जी भंग, और एक 1 मीटर स्टॉक समाधान से १०० µ2 MgCl के एल जोड़ें । अनुमापन के लिए KOH का उपयोग कर 7 पीएच को समायोजित करें । एक ०.२२ µm फ़िल्टर या आटोक्लेव का उपयोग कर बफर निष्फल । एसिड रहित HEPES का प्रयोग करें और सोडियम नमक न डालें ।
  4. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद प्लाज्मिड तैयारी प्रदर्शन और सामग्री की तालिकामें संक्षेप किट का उपयोग कर । तालिका 1में सारांशित plasmids का उपयोग करें ।
    नोट: अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया डीएनए की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है । D. discoideum transfectants के चयन बैक्टीरिया पर बढ़ रही चयन और अभिव्यक्ति कैसेट ड्राइविंग प्रमोटरों के लिए विशिष्ट आवश्यकताओं है (चर्चा देखें) ।
प्लाज्मिड नाम बैक्टीरिया में प्रतिरोध/ Dictyostelium में प्रतिरोध/ टैग
extrachromosomal अभिव्यक्ति plasmids
pDM1203 Ampicilin G418 नहीं
pDM1207 Ampicilin G418 एन-टर्मिनल GFP
pDM1208 Ampicilin G418 एन-टर्मिनल mCherry
pPI159 Ampicilin G418 एन-टर्मिनल mNeon
pPI437 Ampicilin G418 एन-टर्मिनल mScarlet
pPI54 Ampicilin G418 एन-टर्मिनल mTurquoise2
pDM1209 Ampicilin G418 सी-टर्मिनल GFP
pDM1210 Ampicilin G418 सी-टर्मिनल mCherry
pPI143 Ampicilin G418 सी-टर्मिनल mNeon
pPI459 Ampicilin G418 सी-टर्मिनल mScarlet
pPI142 Ampicilin G418 सी-टर्मिनल mTurquoise2
शटल plasmids
pDM344 Ampicilin नहीं नहीं
pDM1019 Ampicilin नहीं एन-टर्मिनल GFP
pDM1018 Ampicilin नहीं एन-टर्मिनल mCherry
pPI152 Ampicilin नहीं एन-टर्मिनल mNeon
pPI418 Ampicilin नहीं एन-टर्मिनल mScarlet
pPI150 Ampicilin नहीं एन-टर्मिनल mTurquoise2
pDM1021 Ampicilin नहीं सी-टर्मिनल GFP
pDM1020 Ampicilin नहीं सी-टर्मिनल mCherry
pPI153 Ampicilin नहीं सी-टर्मिनल mNeon
pPI457 Ampicilin नहीं सी-टर्मिनल mScarlet
pPI151 Ampicilin नहीं सी-टर्मिनल mTurquoise2
inducible extrachromosomal अभिव्यक्ति plasmids
pDM1038 Ampicilin Hygromycin नहीं
pDM1047 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल GFP
pDM1046 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mCherry
pPI450 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mNeon
pPI452 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mScarlet
pPI449 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mTurquoise2
pDM1049 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल GFP
pDM1048 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mCherry
pPI470 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mNeon
pPI460 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mScarlet
pPI469 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mTurquoise2
act5 सेफ हेवन टार्गेटिंग plasmids
pDM1501 Ampicilin Hygromycin नहीं
pDM1513 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल GFP
pDM1514 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mCherry
pPI231 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mNeon
pPI419 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mScarlet
pPI228 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mTurquoise2
pDM1515 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल GFP
pDM1516 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mCherry
pPI230 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mNeon
pPI458 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mScarlet
pPI229 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mTurquoise2
रेमी अभिव्यक्ति plasmids
pDM1220 Ampicilin Hygromycin नहीं
pDM1351 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल GFP
pDM1259 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mCherry
pPI465 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mNeon
pPI468 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mScarlet
pPI466 Ampicilin Hygromycin एन-टर्मिनल mTurquoise2
pDM1352 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल GFP
pDM1305 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mCherry
pPI471 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mNeon
pPI467 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mScarlet
pPI472 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mTurquoise2
फ़्रेम plasmids में लक्षित
pDM1355 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल GFP
pPI461 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mCherry
pPI462 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mNeon
pPI464 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mScarlet
pPI463 Ampicilin Hygromycin सी-टर्मिनल mTurquoise2
नॉक आउट plasmids
pDM1079 Ampicilin Blasticidin नहीं
pDM1080 Ampicilin Nourseothricin नहीं
pDM1081 Ampicilin Hygromycin नहीं
pDM1082 Ampicilin G418 नहीं
CRE अभिव्यक्ति plasmids
pDM1483 Ampicilin Nourseothricin नहीं
pDM1489 Ampicilin Hygromycin नहीं
pDM1488 Ampicilin G418 नहीं

तालिका 1: गैर-axenic transfections के लिए प्लाज्मिड सूची ।

  1. अभिकर्मक के लिए Dictyostelium कक्ष सेट करना
    1. RT. संस्कृतियों में रात भर के एसएम मध्यम (पोषक तत्वों से भरपूर मध्यम) में संगम को aerogenes के लिए विकसित किया जा सकता है 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. एक एसएम आगर प्लेट पर इस जीवाणु निलंबन के बारे में ४०० µ एल जोड़ें (peptone 10 g/l; खमीर निकालने 1 g/l; ग्लूकोज 10 g/l; KH2पो4 १.९ g/L; K2HPO4 x 3 ज2O, १.३ g/L; MgSO4 निर्जल ०.४९ g/L; १.७% आगर) और समान रूप से फैल गया । एक बाँझ पाश ले और Dictyostelium कोशिकाओं के साथ inoculate. प्लेट के एक किनारे पर कोशिकाओं को फैलाएं ।
    3. अभिकर्मक के लिए पर्याप्त रूप से बड़े विकास क्षेत्रों को सुनिश्चित करने के लिए 2 दिनों के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
      नोट: Dictyostelium उपभेदों है कि बड़े विकास क्षेत्रों (जैसे, Ax3, DH1, या JH10) नहीं करते हैं, के लिए या अनुभवहीन प्रयोगों के लिए, इसके बजाय प्लेट समाशोधन का उपयोग करें । इसके लिए, चरणों में दिए गए निर्देशों का पालन करने के लिए 1.5.4 1.5.6 ।
    4. एक बाँझ पाश ले लो और Dictyostelium कोशिकाओं के साथ inoculate (लगभग 2-4 x 105 कोशिकाओं). ८०० µ l के लिए कक्षों को स्थानांतरित करें a घने K. aerogenes निलंबन में SM. Mix कक्षों pipetting ऊपर और नीचे से ।
    5. स्थानान्तरण ४०० µ l, २०० µ l, १०० µ l, और ५० µ l पर ताजा एसएमस आगर प्लेट्स. हर थाली में जोड़ें अतिरिक्त SM K. aerogenes निलंबन के ४०० µ एल, समान रूप से फैले हुए, और शुष्क ।
    6. प्लेट पारदर्शी हो जब तक के बारे में 2 दिनों के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें ।
      नोट: उनकी तेजी से विकास दर के कारण, बैक्टीरिया शुरू में एक धाराप्रवाह लॉन का उत्पादन, और amoebae बाद में "स्पष्ट" बैक्टीरिया की थाली । इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक समय तनाव पृष्ठभूमि और उत्परिवर्ती कोशिकाओं की क्षमता बैक्टीरिया पर बढ़ने के आधार पर अलग कर सकते हैं ।

2. जीवाणु चयन के आधार पर Dictyostelium कोशिकाओं का अभिकर्मक

Figure 1
चित्रा 1 : जीवाणु-उगाए Dictyostelium कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए कार्यप्रवाह. अभिकर्मक के लिए चरण निम्नानुसार सूचीबद्ध होते हैं । aerogenes बैक्टीरिया (लाल) के साथ वरीयता प्राप्त एक एसएम प्लेट पर D. discoideum कोशिकाओं को विकसित. केवल खिला सामने (हरा) से फसल कोशिकाओं, पहले से ही विकसित कर रहे हैं कि कोशिकाओं से परहेज (डार्क ग्रीन). H40 में कोशिकाओं को धो लें । 2-4 x 107 कोशिकाओं की एक अंतिम घनत्व के लिए कोशिकाओं को resuspend/ डीएनए के 1-2 µ जी के साथ सेल सस्पेंशन मिलाएं । मिश्रण एक electroporation cuvette और नाड़ी कोशिकाओं के लिए स्थानांतरण । SorMC और बैक्टीरिया के साथ एक डिश के लिए electroporation के बाद सीधे कोशिकाओं स्थानांतरण । चयन करने योग्य मार्कर जोड़ने से पहले कोशिकाओं को 5 ज के लिए ठीक करने की अनुमति दें । extrachromosomal plasmids के लिए, डिश के लिए सीधे चयन जोड़ें । Transfectants के बाद आमतौर पर दिखाई दे रहे है ~ 2 दिन । रैखिक निर्माण के लिए है कि जीनोम में एकल एकीकरण के लिए लक्ष्य, संकेत के रूप में तीन कमजोर पड़ने की स्थापना की और चयन जोड़ें । बैक्टीरिया आयुध डिपो६०० = १०० स्टॉक समाधान से लिया जाता है । अच्छी तरह से ट्यूबों मिश्रण और ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति प्लेटों में कोशिकाओं हस्तांतरण । कमजोर पड़ने पर प्रति दो प्लेट का प्रयोग करें । पिपेट १५० हर कुआं में सेल निलंबन के µ एल । इसमें करीब 5 दिन का समय लगता है जब तक तंग कालोनियां दिखती हैं । लाल वेल्स सफलतापूर्वक प्राप्त कोशिकाओं (ऊपरी पिछले प्रकाशन22से संशोधित पैनल) की सामांय राशि का एक उदाहरण दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. k. aerogenes निलंबन के साथ प्लेटें तैयार करने के लिए, SorMC बफ़र युक्त k. aerogenes बैक्टीरिया के एक घनत्व के लिए 10 मिलीलीटर जोड़ें६०० = 2 (तैयार आयुध डिपो६०० के २०० µ l जोड़ें = १०० K. वांछित के लिए aerogenes शेयर समाधान एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति पेट्री डिश इलाज में बैक्टीरिया एकाग्रता) ।
    नोट: बाद में इस थाली को transfected डी. discoideum कोशिकाओं की खेती की जरूरत है । वैकल्पिक रूप से, एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली इस्तेमाल किया जा सकता है । extrachromosomal plasmids के अभिकर्मक के मामले में, 6-well टिशू-कल्चर प्लेट अधिक संसाधन कुशल है । K. aerogenes SorMC (OD६०० = 2) के 2 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
  2. Dictyostelium कोशिकाओं की तैयारी
    1. एक 10 µ एल डिस्पोजेबल टीका पाश का उपयोग करना, विकास क्षेत्रों से कोशिकाओं परिमार्जन (लगभग 3 सेमी) संस्कृति की थाली (खाली क्षेत्र के किनारे) या समाशोधन प्लेट. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण कोशिकाओं बर्फ शीत H40 बफर के 1 मिलीलीटर युक्त ।
      नोट: प्लेटें साफ़ करने से कोशिकाओं की कटाई के समय महत्वपूर्ण है । कटाई भी जल्दी पैदावार बहुत कम कोशिकाओं की एक राशि है, जबकि देर से फसल आंशिक रूप से विकसित कोशिकाओं उपज का खतरा बढ़ जाता है ।
    2. १,००० x जी में 2 मिनट के लिए नीचे कताई या फ्लैश-2 एस के लिए कताई से कोशिकाओं को धो १०,००० x g। H40 बफर में supernatant और resuspend कोशिकाओं 2-4 x 107 कोशिकाओं के एक अंतिम घनत्व को छोड़ो/ पूरे अभिकर्मक प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को ठंडा रखें । ट्यूबों और बर्फ के सीधे संपर्क सुनिश्चित करने के लिए एक बर्फ पानी के घोल का प्रयोग करें ।
  3. Electroporation
    1. एक ट्यूब के लिए कोशिकाओं के १०० µ एल जोड़ें डीएनए के 1-2 µ जी के साथ । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ध्यान से मिश्रण ।
    2. एक पूर्व ठंडा electroporation cuvette (2 मिमी गैप) में सेल/डीएनए मिश्रण स्थानांतरण ।
    3. पल्स निम्नलिखित वर्ग-तरंग सेटिंग्स का उपयोग कर कोशिकाओं: ३५० वी, 8 ms, 2 दालें, और 1 एस पल्स अंतराल.
      नोट: डीएनए के 2 µ जी से अधिक मत जोड़ें । उच्च मात्रा में कोशिकाओं को विषाक्त और अभिकर्मक क्षमता कम कर रहे हैं । कुल जोड़ा डीएनए की मात्रा 5 µ से अधिक नहीं होनी चाहिए l
    4. aerogenes SorMC के साथ पहले से तैयार 10 सेमी पेट्री डिश के लिए तुरंत कोशिकाओं को हस्तांतरण और कोशिकाओं 5 एच के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं ।
      नोट: एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत पेट्री डिश में कोशिकाओं की जाँच करें । कोशिकाओं electroporation के बाद सीधे दौर दिखाई देगा, लेकिन लगभग 30 मिनट के बाद उनके amoeboid आकार के लिए वापस आ जाएगा, जब वे पर्याप्त समय के लिए सतह को ठीक से संलग्न किया है ।
  4. transfectants का चयन: पर निर्भर करता है कि क्या अभिकर्मक एक नॉक आउट उत्पंन करने के उद्देश्य से है, दस्तक में, या act5 दस्तक में, या एक extrachromosomal प्लाज्मिड से एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, एक के माध्यम से बाहर ले चयन प्रक्रिया निम्न विधियों का वर्णन किया गया है ।
    नोट: axenically हो कोशिकाओं के विपरीत, बैक्टीरियल हो कोशिकाओं अत्यधिक blasticidin के लिए प्रतिरोधी रहे हैं । चयन, इसलिए, हमेशा G418 या hygromycin का उपयोग कर बाहर किया जाता है (चर्चा देखें) ।
    1. नॉक-आउट, नॉक-इंस, और act5 नॉक-इंस
      1. एक पिपेट से सतह पर तरल को मजबूर बार पेट्री डिश से ध्यान से कोशिकाओं को अलग ।
      2. SorMC K. aerogenes निलंबन (OD६०० = 2) में तीन कमजोर पड़ने की स्थापना करें और उपयोग किए गए प्रतिरोध के अनुसार चयनात्मक एजेंट जोड़ें ( चित्र 1देखें).
      3. कम कमजोर पड़ने: aerogenes शेयर समाधान के SorMC और ६०० µ एल के २०.४ मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन के 9 मिलीलीटर मिश्रण ।
      4. मध्यम कमजोर पड़ने: SorMC और ६०० µ एल के aerogenes शेयर समाधान के २८.५ मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन के ९०० µ एल मिश्रण ।
      5. उच्च कमजोर पड़ने: SorMC और ६०० µ एल के aerogenes शेयर समाधान के २९.३ मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन के ९० µ एल मिश्रण ।
      6. चयन मार्कर (100x स्टॉक समाधान) के 30 µ एल जोड़ें ।
      7. ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति प्लेटों में सेल निलंबन के pipetting १५० µ एल द्वारा एक अच्छी तरह से तैयार कमजोर पड़ने वितरित ।
        नोट: इस प्रक्रिया के बजाय आबादी से एक क्लोन स्क्रीन करना है । चयन के बारे में 5-7 दिन लगते हैं, निर्माण के आधार पर इस्तेमाल किया ।
    2. Extrachromosomal plasmids
      1. 10 मिलीलीटर डिश के लिए चयन मार्कर सीधे जोड़ें ( चित्रा 1देखें) ।
        नोट: कोई जरूरत नहीं है ऊपर कमजोर पड़ने की स्थापना की, क्योंकि वहां क्लोनिंग आबादी के लिए कोई इच्छा नहीं है । डी. discoideum कोशिकाओं में मौजूद उच्च प्रति संख्याओं के कारण extrachromosomal plasmids के लिए चयन प्रक्रिया तेज है. Transfectants ३२ ज के बाद 2 दिनों के लिए उंमीद की जा सकती है ।
        सावधानी: चयन मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया एंटीबायोटिक दवाओं विषाक्त कर रहे हैं । दस्ताने पहनें ।
  5. सकारात्मक tranfectants के लिए प्राप्त क्लोन स्क्रीन । नॉक-आउट या नॉक-इन प्रयासों के लिए, चरण 2.5.1 में दिए गए निर्देशों का पालन करें. extrachromosomal plasmids चरण 2.5.2 में दिए गए निर्देशों का उपयोग करने के लिए अभिकर्मक सफलता की जाँच करें ।
    1. दस्तक-बहिष्कार, दस्तक-ins, और act5 दस्तक-ins के लिए, सही जीनोमिक लोकस में निर्माण के एकीकरण की पुष्टि करने के लिए पीसीआर के माध्यम से प्रारंभिक स्क्रीन प्रदर्शन करते हैं ।
      नोट: क्लोनल आबादी की संभावना को अधिकतम करने के लिए, सबसे अधिक संभव कमजोर पड़ने का उपयोग करें कि पैदावार transfectants चयन के बाद । प्लेटों के लिए लक्ष्य है कि एक अधिकतम एक तिहाई कुओं पर कब्जा कर रहे हैं ।
      1. क्लोनल आबादी का विस्तार करने के लिए, स्थानांतरण क्लोन है कि ९६ से चयन के बाद बड़े हो गए है अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट एक 12 में अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली जीनोमिक डीएनए के अलगाव के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को विकसित करने के लिए । SorMC K. aerogenes के 1 मिलीलीटर (आयुध डिपो६०० = 2) और ताजा चयन मार्कर के साथ एक अच्छी तरह से आपूर्ति ।
        नोट: 1 दिन आमतौर पर एक अच्छी तरह से डीएनए अलगाव के लिए उपयुक्त धाराप्रवाह प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है ।
      2. मिनी जीनोमिक डीएनए अलगाव प्रदर्शन करने के लिए, एक धाराप्रवाह अच्छी तरह से और अलग जीनोमिक डीएनए निर्माता के निर्देशों का पालन एक मिनी डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर की कोशिकाओं फसल ।
      3. सकारात्मक integrands के लिए पीसीआर स्क्रीन करने के लिए उपयुक्त प्राइमरों और Taq-पोलीमरेज़ ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एक साथ अलग जीनोमिक डीएनए का प्रयोग करें ।
        नोट: सही जीनोमिक लोकस में सकारात्मक एकीकरण की पुष्टि के बाद, एक दक्षिणी दाग विश्लेषण किया जाना चाहिए । इससे अधिक विश्वास सुनिश्चित होता है कि विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में अतिरिक्त सम्मिलन ईवेंट्स नहीं हुई हैं.
    2. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के लिए, नेत्रहीन सकारात्मक फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की पहचान और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ की जांच करें । वैकल्पिक रूप से, जैव रासायनिक पहचान के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ एक पश्चिमी दाग प्रदर्शन करते हैं ।
पीसीआर प्रोग्राम
चरण तापमान समय
प्रारंभिक विकार ९४ ° c 30 एस
30 चक्र ९४ ° c 15-30 s
४२ ° c 15-60 s
६८ ° c 1 min/kb
अंतिम विस्तार ६८ ° c 5 min
पकड़ 4-10 ° c
प्रतिक्रिया संरचना
घटक २५ μL प्रतिक्रिया अंतिम एकाग्रता
10 µ एम फॉरवर्ड प्राइमर ०.५ µ l ०.२ µ m
10 µ मीटर रिवर्स प्राइमर ०.५ µ l ०.२ µ m
टेंपलेट डीएनए चर (ca .5 µ l) < १,००० एनजी
पोलीमरेज़ सहित मानक बफर के साथ 2x मास्टर मिश्रण (सामग्री की तालिका देखें) १२.५ µ l 1x
Nuclease-मुफ्त पानी को 25 µ l < १,००० एनजी

तालिका 2: पीसीआर कार्यक्रम और के प्रवर्धन के लिए नमूना संरचना D. discoideum जीनोमिक डीएनए.

Representative Results

Extrachromosomal plasmids रिपोर्टर अध्ययन है, जो एक सेल या उत्परिवर्ती कोशिकाओं के सेलुलर संरचना में परिवर्तन के अंदर कुछ प्रोटीन के स्थानीयकरण की पहचान करने के लिए उद्देश्य के लिए उपयोग किया जाता है । सेल चक्र की निगरानी के रूप में कई दृष्टिकोणों के लिए, यह एक ही समय में दो पत्रकारों को व्यक्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह अब हमारे दोहरे रिपोर्टर extrachromosomal प्लाज्मिड प्रणाली (तालिका 1) का उपयोग कर संभव है । 1 दिन पर, कोशिकाओं को 5 घंटे के बाद चयन मार्कर G418 जोड़ने से पहले transfected थे (चित्रा 1) । उदाहरण में, NC4, DdB, Ax2, और स्वतंत्र रूप से व्युत्पंन जंगली V12M2 और WS2162 (अनुपूरक तालिका 1) transfected प्लाज्मिड, जो pPI289-GFP, TubulinA और microtubules के लिए एक मार्कर-mCherry, एक प्रोटीन है कि के लिए encodings के साथ PCNA थे सेल चक्र (चित्रा 2ए) की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया । ३२ ज के बाद, कोशिकाओं माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया । कोशिकाओं के बहुमत दोनों फ्लोरोसेंट-संलयन प्रोटीन लेबल, पिछले रिपोर्टों के अनुरूप है कि एक ही प्लाज्मिड से दो पत्रकारों की अभिव्यक्ति समान अभिव्यक्ति का स्तर है, जो लगभग असंभव है दिखाता है जब दो अलग plasmids का उपयोग 18,19. प्रत्येक कक्ष पंक्ति के लिए एक प्रतिनिधि कक्ष (NC4, DdB, Ax2, V12M2, और WS2162) वांछित दोहरी रिपोर्टर व्यक्त चित्रा 2बीमें दिखाया गया है । चित्रा2cमें अभिकर्मक क्षमता संक्षेप हैं । NC4-व्युत्पन्न कोशिका रेखाएँ श्रेष्ठ अभिकर्मक क्षमताएँ दिखाती हैं. हालांकि, सेल लाइनों V12M2 और WS2162, transfectants की एक काफी अधिक संख्या के लिए प्राप्त किया गया था ।

Figure 2
चित्रा 2 : एक extrachromosomal प्लाज्मिड की अभिव्यक्ति । (क) Extrachromosomal plasmids परिपत्र रूप में सीधे transfected हैं. उदाहरण के रूप में, दोहरी रिपोर्टर pPI289 दिखाया गया है । गैर सरकारी संगठनमिव साइटों extrachromosomal अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में दूसरी रिपोर्टर की प्रविष्टि से संकेत मिलता है । (ख) एक प्रतिनिधि कोशिका एक्सप्रेस GFP-TubulinA (cytoplasmic) और mCherry-PCNA (मोटे तौर पर परमाणु) के लिए पांच अलग जंगली प्रकार के सेल लाइनों (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162) इस्तेमाल किया के जेड प्रक्षेपण । (ग) (ख) में चित्र पांच सेल लाइनों के लिए अभिकर्मक क्षमता की गणना की गई । दिखाया गया है दो प्रयोगों का मतलब है । त्रुटि सलाखों के संकेत ± एसडी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक निर्दिष्ट जीनोमिक लोकस में एक लक्ष्यीकरण वेक्टर के एकीकरण अधिक चुनौतीपूर्ण है और उत्पंन सेल लाइन के अधिक सावधान विश्लेषण की आवश्यकता है । चित्रा 3में, NC4 में एक act5-mCherry KI प्रयास किया है । पहले, प्लाज्मिड अभिकर्मक निम्न संयोजन ईवेंट्स की आवृत्ति को बढ़ाने के लिए रेखीय होना चाहिए । इसके लिए एनजीओमिव के साथ प्लाज्मिड pDM1514 कट रहा है । दो बैंड एक agarose जेल पर डाइजेस्ट चलाने के बाद प्राप्त कर रहे हैं । ४१२७ बीपी बैंड वांछित निर्माण (चित्रा 3) शामिल हैं । अभिकर्मक के लिए, पचा डीएनए जेल से निकाला जाना चाहिए और निर्माता के निर्देशों का पालन एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर शुद्ध ।

Figure 3
चित्रा 3 : act5 दस्तक-इन और अभिकर्मक के लिए डीएनए की तैयारी । एक अधिनियमके उपयोग का एक उदाहरण 5 दस्तक-प्लाज्मिड pDM1514 में दिखाया गया है । तैयारी के लिए चरण निम्नानुसार सूचीबद्ध होते हैं । (क) electroporation से पहले, linearize प्लाज्मिड प्रयोग केलेलेमिव करेल. (ख, ग) दो उम्मीद बैंड ठीक से अलग कर रहे हैं जब तक एक agarose जेल पर कटौती प्लाज्मिड चलाएँ. बाहर कट ४१२७ बीपी संयोजन हथियार, mCherry, और प्रतिरोध-कैसेट युक्त बैंड, और जेल डीएनए निकालें । अब डीएनए अभिकर्मक के लिए तैयार है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

शुद्ध डीएनए NC4 कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया गया था । चयन के 5-6 दिन बाद क्लोन प्राप्त किए गए । प्रतिनिधि अभिकर्मक क्षमता और कई act5 दस्तक में प्रयास के लिए सकारात्मक पहचान क्लोन की राशि तालिका 3में संक्षेप हैं । NC4 अभिकर्मक के दो क्लोनों बेतरतीब ढंग से चुना और पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया (चित्रा 4ए), और दोनों की भविष्यवाणी की बैंड एक दस्तक की उंमीद पैटर्न से पता चला और आगे दक्षिणी दाग विश्लेषण के साथ मांय थे एक भी एकीकरण सुनिश्चित 20जीनोम में निर्माण की घटना । ब्लाटर वांछित act5 लोकस (चित्रा 4बी) में स्पष्ट एकल एकीकरण से पता चलता है । जनरेटेड NC4:: act5-mCherry सेल लाइन का इस्तेमाल अब प्रयोगों में किया जा सकता है ।

Figure 4
चित्र 4 : NC4 में act5-mCherry किस का सत्यापन । (क) act5 लोकस में धनात्मक एकीकरणों के सत्यापन के लिए योजना और नियंत्रण पीसीआर. संकेत प्राइमरों के लिए दो स्वतंत्र क्लोन और माता पिता का विश्लेषण किया गया । दोनों क्लोन प्रतिरोध के लिए उंमीद बैंड-कैसेट और बहाव (P1) या नदी के ऊपर ऊपर (P2), जो माता पिता के तनाव में मौजूद नहीं है दिखाओ । प्राइमर संयोजन (P1/P2) act5 लोकस में mCherry और प्रतिरोध कैसेट के सही एकीकरण की पुष्टि करता है । जंगली प्रकार NC4 की उंमीद २८०० बीपी बैंड से पता चलता है, जबकि दोनों की क्लोन इस बैंड की कमी है और बदले में १४०० आधार जोड़े बड़ा के बारे में एक पीसीआर उत्पाद प्रदर्शित करते हैं । (ख) प्रयुक्त प्रतिबंध डाइजेस्ट और दक्षिणी दाग के लिए योजना । दोनों में दस्तक क्लोन छोटे ३४०० बीपी बैंड, जो अधिनियम5 लोकस में निर्माण के एकीकरण का परिणाम है, विशेष रूप से अतिरिक्त Bclhygromycin प्रतिरोध कैसेट में मैं साइट दिखाते हैं । वाइल्ड-प्रकार नियंत्रण अपेक्षित ५.८ kb दो बहाव स्थित BclI साइट्स से जिसके परिणामस्वरूप दिखाता है । ब्लाटर ने स्पष्टता के लिए फसली और ब्याह किया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लक्षित act5 लोकस में निर्माण प्लाज्मिड नाम कब्जे वाले कुओं की संख्या चेक किए गए क्लोनों की संख्या सकारात्मक क्लोन सही क्लोन (%) Dictyostelium इस्तेमाल किया तनाव अभिकर्मक दक्षता (transfectants/2x10 ^ 6/1 µ g DNA)
LifeAct-mCherry pPI226 7 7 1 १४.२ AX2 3.5 x10 ^-6
LifeAct-GFP pPI227 12 12 5 ४१.६ AX2 6x10 ^-6
GFP pDM1513 3 3 2 ६६.६ AX2 1.5 x10 ^-6
mCherry pDM1514 3 3 1 ३३.३ AX2 1.5 x10 ^-6
GFP pDM1513 ६६ 9 5 ५५.५ AX2 3.3 x10 ^-5
mCherry pDM1514 २२१ 12 10 ८३.३ AX2 1.1 x10 ^-4
H2B-mCherry pPI420 3 3 1 ३३.३ AX2 1.5 x10 ^-6
H2B-mCherry pPI420 7 7 6 ८५.७ AX2 3.5 x10 ^-6
mCherry pDM1514 10 10 7 ७० Ddb 5x10 ^-6
mCherry pDM1514 २४० 12 11 ९१.६ Ddb 1.2 x10 ^-4
mCherry pDM1514 ३२० 12 12 १०० NC4 1.6 x10 ^-4

तालिका 3: अभिकर्मक क्षमता और की पीढ़ी के लिए प्राप्त सकारात्मक transfectants की राशि act5 अलग तनाव पृष्ठभूमि में किस 22 .

अधिनियम5 लोकस एकीकृत रिपोर्टर21के अपेक्षाकृत समरूप अभिव्यक्ति प्रदान करता है । उत्पन्न NC4:: act5-mCherry कोशिकाओं मिश्रण प्रयोगों अन्य act5 दस्तक के साथ प्रदर्शन किया जा करने की अनुमति-इन GFP के रूप में एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर. इस प्रणाली के महान लाभ पर जोर देने के लिए, Ax2 के साथ प्रयोग मिश्रण :: act5-GFP दिखाया जाता है । transfect गैर axenic जंगली प्रकार की कोशिकाओं को असमर्थता के कारण, इस प्रकार के दृष्टिकोण से पहले नहीं किया जा सकता है । मिश्रण प्रयोगों सेल व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं, क्योंकि वे समान प्रयोगात्मक स्थितियों का अनुभव विभिन्न सेल लाइनों के बीच एक सीधी तुलना की अनुमति. NC4 कोशिकाओं Ax2 कोशिकाओं की तुलना में बैक्टीरियल लॉन पर तेजी से बढ़ने (चित्रा 5ए). यह एक उच्च क्षमता के कारण हो सकता है phagocytose बैक्टीरिया या सुधार करने के लिए ले जाने और एक खाद्य स्रोत की ओर chemotaxis दिखाने की क्षमता । एक के तहत-आगर फोलेट chemotaxis परख, NC4 की आबादी की प्रत्यक्ष तुलना :: act5-mCherry और Ax2:: act5-GFP प्रदर्शन किया गया था, दिखा रहा है कि NC4:: act5-mCherry फोलेट संवेदन में ज्यादा कुशल हैं । 4 ज के बाद, अधिक NC4:: act5-mCherry कोशिकाओं Ax2 से agarose के तहत क्रॉल करने में सक्षम थे: : act5-GFP कोशिकाओं (चित्रा 5बी). agarose के अंतर्गत माइग्रेट करने वाले कक्षों के लिए chemotaxis के मानक मेट्रिक्स का विश्लेषण करने से पता चला कि NC4:: act5-mCherry कक्ष तेज़ थे और chemotactic से मजबूत Ax2 प्रतिसाद दिखाया :: act5-GFP कक्ष (चित्रा 5सी-ई ).

Figure 5
चित्रा 5 : छवि के लिए अधिनियम5 किस का प्रयोग आधारित chemotaxis मिश्रण प्रयोगों । (क) NC4:: act5-mCherry और Ax2:: act5- GFP अधिनियमसे संकेत फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त 5 लोकस एक जीवाणु लॉन पर विकसित करने की क्षमता के लिए विश्लेषण किया गया । 4 दिनों के बाद, पट्टिका व्यास एकान्त मढ़वाया Dictyostelium कोशिकाओं से उत्पंन मापा गया । Non-axenic act5:: NC4 कोशिकाओं axenic Ax2 से काफी बड़ा सजीले टुकड़े बनाने :: act5-GFP कोशिकाओं (± एसडी, * * * पी < ०.०००१, एन = 3, स्केल बार 5 मिमी) मतलब है । (ख) agarose फोलेट chemotaxis परख22 के उपयोग के लिए सीधे NC4 की chemotactic क्षमताओं की तुलना करने के लिए :: act5-mCherry और Ax2:: act5-GFP (A) में प्रयुक्त, जीवाणु-दोनों उपभेदों के उगाए amoebae मिश्रित थे एक 50:50 अनुपात में । कक्षों को agarose के अंतर्गत क्रॉल करने की अनुमति थी । 4 एच के बाद, कोशिकाओं है कि ऊपर फोलेट ढाल पलायन कर रहे थे एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged थे । NC4 की संख्या:: act5-mCherry और Ax2:: act5-GFP कोशिकाओं को फिर निर्धारित किया गया । NC4:: act5-mCherry कोशिकाओं में फोलेट की संवेदना में अधिक दक्ष थे । के बारे में 10 गुना अधिक NC4:: act5-mCherry कोशिकाओं Ax2 की तुलना में पाया गया:: act5-GFP कोशिकाओं (± एसडी मतलब, * * * पी < ०.०००१, एन = 6, स्केल बार १०० µm) । (सी, डी) कोशिकाओं ६० मिनट के लिए फिल्माया गया था, और उनकी गति और chemotactic सूचकांक की गणना की गई । सबसे chemotactically उत्तरदायी कोशिकाओं के पूर्व चयन के बाद (केवल उन है कि agarose के तहत चले गए), Ax2:: act5-GFP कोशिकाओं सेल गति और chemotaxis दोनों के लिए कम मूल्यों दिखाया. सेल लाइन प्रति ५० कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया । (माध्य ± एसडी, * पी < ०.०१, एन = 3) । (ङ) NC4 की पटरियों :: act5-mCherry और Ax2:: act5-GFPact5 दस्तक-ins ६० मिनट से अधिक की साजिश रची, chemoattractent के NC4 स्रोत की ओर अधिक निर्देश आंदोलन दिखा रहे हैं : act5-mCherry कोशिकाओं (माध्य ± एसडी, * * * p < ०.०००१, n = 6). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

act5 नॉक-इन सेल लाइनों को फ्लो cytometry के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है । बैक्टीरिया पर विकास के साथ के रूप में, वहां axenic उपभेदों और गैर axenic जंगली प्रकार के बीच विकास में प्रमुख अंतर कर रहे हैं । विकास के बाद, NC4 कोशिकाओं के फलने निकायों लगभग दो बार Ax2 कोशिकाओं से व्युत्पंन के रूप में बड़े रूप में कर रहे हैं । यदि कोशिकाओं मिश्रित कर रहे हैं, एक मध्यवर्ती आकार फलने शरीर प्राप्त की है । दोनों कक्ष रेखाओं के योगदान का अधिक मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए, फ़्लो cytometry का उपयोग किया गया था. इन विश्लेषण स्पष्ट रूप से पता चला है कि मध्यवर्ती आकार फलने निकायों दोनों सेल लाइनों से योगदान के विभिंन स्तरों के कारण हैं । जबकि NC4:: act5-mCherry कोशिकाओं को मापा बीजाणुओं के बारे में ७५% की, Ax2:: act5-GFP केवल 25% योगदान दिया, गैर के लिए एक संभावित फिटनेस लाभ axenic उपभेदों (चित्रा 6) खुलासा । चूंकि विश्लेषण डंठल सेल जनसंख्या की निगरानी नहीं करता है, Ax2 और NC4 के बीच विकास में असंतुलन को समझाने के लिए दो संभावनाएं हैं । एक संभावना यह है कि Ax2 कोशिकाओं के डंठल सेल आबादी के लिए मुख्य रूप से योगदान, बल्कि बीजाणु कोशिका आबादी में प्रवेश करने से । वैकल्पिक रूप से, अधिक NC4 कोशिकाओं के विकास चक्र में प्रवेश कर सकते हैं, Ax2 अपेक्षाकृत देरी के साथ, और वे फलस्वरूप एक फलने शरीर के विधानसभा में योगदान करने में असमर्थ हैं । गैर transfect करने की संभावना-axenic जंगली प्रकार की कोशिकाओं को आगे अंय दृष्टिकोण विकसित करता है और बहुत प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को सरल ।

Figure 6
चित्रा 6: अधिनियम5 किस मिश्रण प्रयोग के विश्लेषण की अनुमति प्रवाह cytometry का उपयोग कर । (क) NC4:: act5-mCherry और Ax2:: act5-GFP को अलग से या गैर-पोषक आगर प्लेटों पर 50:50 मिश्रण में विकसित किया गया. NC4:: act5-mCherry कोशिकाओं Ax2 से बड़ा फलने निकायों फार्म :: act5-GFP। मिश्रण के बजाय एक मध्यवर्ती आकार (स्केल बार 5 मिमी) से पता चलता है. फोकल प्रतिदीप्ति लाइट माइक्रोस्कोपी NC4 की एक उच्च राशि का पता चलता है:: घोला जा सकता है से प्राप्त बीजाणु सिर में act5-mCherry बीजाणु । (ख) इस प्रेक्षण को मात्रा में लेने के लिए, (क) में मिश्रण प्रयोग से काटा बीजाणु सिर में बीजाणुओं के प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । NC4 से उत्पन्न बीजाणुओं के बारे में ७५%:: act5-mCherry कोशिकाओं, Ax2 से केवल 25% के साथ :: act5-GFP कोशिकाओं. (ग) एक प्रवाह cytometry तितर बितर में दर्शाए गए दोनों कक्ष रेखाओं से बीजाणुओं का प्रतिनिधि वितरण । लगभग ०.०५% सकारात्मक mCherry और GFP संकेतों को दर्शाते हैं, सुझाव देते हैं कि parasexual फ्यूजन की प्रक्रिया हुई है या बीजाणु एक दूसरे से चिपके हुए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सेल लाइन आनुवंशिक रूप से पृष्ठभूमि संदर्भ संख्या से पहले प्रकाशित प्रकार
AX2 (Ka) DBS0235521 Bloomfield एट अल., २००८ जंगली प्रकार
NC4 (S) Bloomfield एट अल., २००८ जंगली प्रकार
act5:: mCherry क्लोन 5 NC4 HM1912 Paschke एट अल., २०१८ act5 नॉक-इन
act5:: GFP क्लोन 2 AX2 HM1930 Paschke एट अल., २०१८ act5 नॉक-इन
V12M2 Bloomfield एट अल., २००८ जंगली प्रकार
WS2162 Bloomfield एट अल., २००८ जंगली प्रकार

अनुपूरक तालिका 1: के विभिंन उपभेदों Dictyostelium अध्ययन किया ।

Discussion

गैर-axenic, वन्य-प्रकार की Dictyostelium कोशिकाओं का उपयोग आणविक अनुसंधान में अब तक बहुत सीमित रहा है. इन उपभेदों के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए उपलब्ध तरीकों विश्वसनीयता और दक्षता23का अभाव है, उनके सामांय गोद लेने को रोकने । उत्पंन सामग्री और प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किसी भी discoideum के लिए तरल माध्यम में विकसित करने की क्षमता के स्वतंत्र तनाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल NC4-व्युत्पन्न सेल लाइनों के लिए अनुकूलित है । जंगली से हौसले से अलग उपभेदों के लिए अभिकर्मक क्षमता NC4 से अलग है, जैसा कि हम पहले देखा है और V12M2 और WS21628,9के लिए यहां दिखाए जाते हैं । electroporation स्थितियों में विशेष रूप से लगता है अभिकर्मक क्षमता पर काफी प्रभाव पड़ता है और कुछ उपभेदों के लिए और अधिक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । सामांय में, transfectants की एक पर्याप्त राशि सभी उपभेदों में देखा गया है अब तक परीक्षण, दिखा रहा है कि इन तरीकों व्यावहारिक हैं । NC4-व्युत्पन्न उपभेदों का उपयोग कर प्राप्त की सकारात्मक transfectants की संख्या अन्य गैर-axenic जंगली प्रकार उपभेदों की तुलना में अधिक है, लेकिन सभी मामलों में, transfectants की पर्याप्त संख्या आगे प्रयोगों के लिए अनुमति देने के लिए प्राप्त कर रहे हैं. यह, प्लस हमारे प्रोटोकॉल की सादगी, पहले के प्रयास की तुलना में प्रमुख सुधार है8,9।

इन नए गैर axenic प्रोटोकॉल सभी मानक आनुवंशिक प्रक्रियाओं को कवर और आगे लाभ जोड़ने के लिए, के बाद से transfections तेजी से और कुशलता से समानांतर में प्रदर्शन किया जा सकता है । सकारात्मक क्लोन दिनों के बजाय हफ्तों में प्राप्त किया जा सकता है, के बाद से बैक्टीरिया पर वृद्धि विभाजन समय आधा । नव स्थापित plasmids भी axenic शर्तों के तहत काम करते है और नियमित रूप से दोनों विकास की स्थिति है, जो इस methology22की एक और उंनति है के तहत इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में प्रोटोकॉल में शुरू की, बैक्टीरिया पर चयन के लिए इस्तेमाल किया प्लाज्मिड विशेष आवश्यकताओं कि अभिकर्मक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । विशेष रूप से अभिव्यक्ति और प्रतिरोधक कैसेटों को चलाने वाले प्रवर्तक सफल अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण हैं. अक्सर इस्तेमाल किया act6 (actin 6) प्रतिरोध या अभिव्यक्ति कैसेट ड्राइविंग के लिए24 प्रमोटर दक्षता का अभाव है जब कोशिकाओं बैक्टीरिया पर हो रहे हैं । हमारी प्लाज्मिड प्रणाली में, अत्यधिक सक्रिय act15 (actin 15) प्रवर्तक सभी अभिव्यक्ति कैसेटों को चलाता है, जबकि प्रतिरोधक कैसेट एक coA (coactosin) प्रवर्तक के नियंत्रण में होती हैं, जिनमें से दोनों axenic परिस्थितियों में सक्रिय हैं और बैक्टीरिया पर उगाई कोशिकाओं । रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यकताओं का निर्माण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दस्तक में और नॉक आउट constructs यह हमारे प्लाज्मिड प्रदर्शनों की रिपोर्टर का उपयोग करने के लिए आवश्यक बनाते हैं, लेकिन दुर्भाग्य से पहले से ही बनाया है कि अकुशल act6 प्रमोटर का उपयोग की सीमा वैक्टर का उपयोग करें ।

प्रवर्तक क्षमताएँ transfections के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं जो सही जीनोमिक लोकस में एकल एकीकरण ईवेंट पर निर्भर करती हैं. प्रतिरोध जीन अभिव्यक्ति ड्राइविंग प्रवर्तकों के हमारे सुधार के कारण, पर्याप्त प्रतिरोध प्रोटीन एकल लोकस एकीकरण से उत्पादित है । एक प्रमुख चिंता का विषय जीनोम में कई एकीकरण के पक्ष में था जब hygromycin या G418 का उपयोग कर के रूप में वर्णित है । कई एकीकरण का कोई एहसान अब तक मनाया गया है, के रूप में G418 चयन के लिए पहले की रिपोर्ट पुराने प्रमोटर25सिस्टम का उपयोग कर । इसका मतलब यह है कि दोनों hygromycin और G418 साफ दस्तक-बहिष्कार और दस्तक-ins की पीढ़ी के लिए उपयुक्त चयन मार्करों हैं । दुर्भाग्य से, चयन मार्कर blasticidin गैर axenic शर्तों के तहत काम नहीं करता है । यह हमारी विधि का एक बड़ा नुकसान है, के बाद से blasticidin प्रतिरोध कैसेट नियमित रूप से दस्तक उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया है बाहर डी discoideumमें constructs । constructs कि पहले से ही blasticidin प्रतिरोध कैसेट के साथ उत्पंन की आवश्यकता होगी के लिए व्यावहारिक चयन मार्करों में से एक का उपयोग कर व्युत्पंन होगा । इस सीमा को पार करने की एक और संभावना इस अभिकर्मक प्रोटोकॉल26के साथ हाल ही में स्थापित axenic D. discoideum CRISPR प्रौद्योगिकी गठबंधन है । उपयुक्त की पीढ़ी, एकल गाइड RNAs (sgRNAs) सरल और तेजी से पूरा दस्तक के पुनर्निर्माण से बाहर constructs । भविष्य के निर्देशों के लिए, कई दस्तक-CRISPR/Cas9 का उपयोग कर इस अभिकर्मक प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त बहिष्कार की संभावना अपील है और Dictyostelium समुदाय में कई शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त हो सकता है । तथापि, axenic उगाए गए कक्षों में CRISPR/Cas9 के लिए उपयोग किए गए विस्थापित क्षणिक व्यंजक प्रणाली की कार्य-सावधानीपूर्वक जांच की जानी चाहिए ।

act5 दस्तक प्रणाली प्रस्तुत में डी discoideum में स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए एक विश्वसनीय और सुरक्षित एकीकरण प्रणाली प्रदान करता है, इसी तरह के अंय जीवों22में स्थापित साइटों के लाभ के साथ । यह भी जीनोम में एक एकल एकीकरण घटना पर निर्भर करता है और विभिंन अनुसंधान दिशाओं के लिए कई संभावनाएं प्रदान करता है । act5 प्रवर्तक दृढ़ता से सक्रिय है और लगभग समरूप अभिव्यक्ति की गारंटी देता है27 खेती की शर्तों के स्वतंत्र । फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन आसानी से इस सुरक्षित हेवन लोकस में एकीकृत किया जा सकता है इंजीनियर लक्ष्यीकरण plasmids का उपयोग कर । यह उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए, सेल ट्रैकिंग प्रयोजनों के लिए, के रूप में एक मिश्रण प्रयोग में यहां दिखाया गया है । कक्ष न्यूनतम कक्ष-से-कक्ष व्यंजक परिवर्तनशीलता दिखाते हैं, जो स्वचालित कक्ष ट्रैकिंग में सहायता कर सकते हैं. महत्वपूर्ण बात, 5 लोकस अधिनियममें एक वांछित अनुक्रम के सम्मिलन phenotypically तटस्थ28,29प्रकट होता है । के रूप में अभिव्यक्ति एक चयन मार्कर पर निर्भर नहीं है प्रोटीन अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए, के रूप में यादृच्छिक integrants या extrachromosomal वेक्टर असर सेल लाइनों में देखा, act5 प्रणाली बचाव प्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है, के रूप में अच्छी तरह से । चूंकि कक्ष पंक्तियां समरूप हैं, इसलिए सभी कक्षों का विश्लेषण किया जा सकता है । अभिव्यक्ति के लिए एक extrachromosomal प्लाज्मिड का उपयोग करना संभव नहीं है, जिसमें अभिव्यक्ति में काफी विविधता है.

सभी उपभेदों के लिए इन सामान्य सुधार के अलावा, आणविक अनुसंधान के लिए गैर axenic जंगली प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग करने की क्षमता वर्तमान प्रयोगशाला उपभेदों में संचित उत्परिवर्तनों के प्रभाव का एक आकलन की अनुमति देता है । एकाधिक आनुवंशिक व्यवस्था १९७० में Ax2 तनाव के गोद लेने के बाद से पाया गया है, के रूप में पहले प्रकाशित microarray विश्लेषण26द्वारा दिखाया गया है । सिंथेटिक phenotypes इन उत्परिवर्तनों की उपस्थिति की वजह से मनाया जाता है । उदाहरण के लिए, एक रिपोर्ट phg2 उत्परिवर्ती से पता चलता है एक प्रयोगशाला तनाव पृष्ठभूमि में आसंजन में कमी आई और एक और3में वृद्धि हुई आसंजन । इस तरह के परस्पर विरोधी आंकड़ों को अब आम पूर्वज तनाव (इस मामले में, DdB) में प्रयोग को दोहराने से सुलझाया जा सकता है । इस दृष्टिकोण की ताकत को हाल ही में छोटे GTPase ञास30,31के लिए दिखाया गया है ।

किसी भी discoideum तनाव में आनुवंशिक प्रयोगों प्रदर्शन करने की क्षमता है कि जंगली अलग के उपयोग पर निर्भर करता है कि नए अनुसंधान दिशाओं की क्षमता का विस्तार, विशेष रूप से उन सामाजिक विकास, परिजन मांयता शामिल है, और यौन चक्र22।

Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

लेखक इस विधि और उत्कृष्ट वैज्ञानिक और तकनीकी सहायता के लिए LMB माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry सुविधाओं के लिए इनपुट के लिए Kay लैब धंयवाद । यह काम मेडिकल रिसर्च काउंसिल ग्रांट MC_U105115237 द्वारा आर. आर. kay, BBSRC (बायोटेक्नोलॉजी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद्) ग्रांट बीबी/K009699/1 से आर. आर. kay, कैंसर रिसर्च यूके ग्रांट A15672 को आर. एच. Insall, वेलकम ट्रस्ट सीनियर फैलोशिप के लिए वित्त पोषित किया गया । 202867/z/16/z जोनाथन आर Chubb करने के लिए, और MRC में LMCB UCL विश्वविद्यालय इकाई को MRC धन (MC_U12266B) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R ThermoScientific 05-400-002
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor ThermoScientific 12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers Sigma Aldrich EP6331000025
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules BioRad 1652660
Safety Cabinet Foruna - SCANLAF Labogene
BioPhotometer Plus Eppendorf
CLSM 710 Zeiss
Media & Agaroses
LoFlo Medium Formedium LF0501
Seakem GTG Agarose Lonza 50071
Low EEO Agarose BioGene 300-200
Purified Agar Oxoid LP0028
SM broth Formedium SMB0102
2x LB broth Formedium LBD0102
Chemicals
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoScientific S33102
1 Kb Plus DNA Ladder ThermoScientific 10787018
1 Kb DNA Ladder NEB N3232L
HEPES free acid Sigma Aldrich/Merck 391340 EMD
KH2PO4 VWR P/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2O VWR 10028-24-7
MgCl2 * 6 H2O Sigma Aldrich/Merck 5982 EMD
CaCl2 * 2 H2O Sigma Aldrich 442909
Folic Acid Sigma Aldrich F7876
KOH VWR 26668.263
Cultur Dishes
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3595
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3516
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 353003
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 MatTek Corporation P50G-1.5-30-F
Antibiotics
Geneticin G418-sulphate Gibco by Life Technologies 11811-023
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1
Additional Consumables
2 mm gap electroporation cuvettes, long electrode Geneflow Limited E6-0062
10 µL Inoculating Loop, Blue 10 Micro L ThermoScientific 129399
Spreader, L-shaped, sterile greiner bio-one 730190
Combitips advanced 5 mL Eppendorf BIOPUR 30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep Classic Zymoresearch D4016
Quick DNA Miniprep Kit Zymoresearch D3025
Zymoclean DNA Recovery Kit Zymoresearch D40002
Enzymes
Restriction enzymes NEB
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer NEB M0482L
T4 DNA Ligase NEB M0202S
PrimeSTAR Max DNA Polymerase TakaraBio R045A

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References

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जेनेटिक्स इश्यू १४३ Dictyostelium अभिकर्मक नॉक आउट नॉक-इन extrachromosomal plasmids act5 स्एक्सप्रेस chemotaxis गतिशीलता macropinocytosis
बैक्टीरिया पर चयन और विकास के आधार पर <em>Dictyostelium discoideum</em> कोशिकाओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग
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Paschke, P., Knecht, D. A., Williams, T. D., Thomason, P. A., Insall, R. H., Chubb, J. R., Kay, R. R., Veltman, D. M. Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58981, doi:10.3791/58981 (2019).

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