Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genteknik Dictyostelium discoideum celler baserat på urval och tillväxt på bakterier

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58981
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3, 4,5, 1, 1
1MRC Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 3Cancer Research UK Beatson Institute Glasgow, 4MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 5Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Summary

Dictyostelium discoideum är en populär modellorganism att studera komplexa cellulära processer såsom cellmigration, endocytos och utveckling. Nyttan av organismen är beroende av genomförbarheten av genetisk manipulation. Här presenterar vi metoder för att transfect Dictyostelium discoideum celler som övervinna befintliga begränsningar av odling av celler i flytande media.

Abstract

Dictyostelium discoideum är en spännande modellorganism för att studera cell differentiering processer under utveckling, cell signalering och andra viktiga cellulära biologi-frågor. Teknikerna som finns att genetiskt manipulera Dictyostelium celler är välutvecklade. Transfections kan utföras med olika valbara markörer och markör åter Cykling, inklusive homolog rekombination och insertionsmutationer. Detta stöds av en väl kommenterad genomet. Men dessa metoder är optimerade för axenic cellinjer som växer i flytande kulturer och är svåra att tillämpa icke-axenic vildtyp cellerna, vilket foder endast på bakterier. De mutationer som finns i axenic stammar stör Ras signalering, orsakar överdriven macropinocytosis krävs för utfodring och försämra cellmigration, som förvirrar tolkningen av signaltransduktion och chemotaxisna experiment i dessa stammar. Tidigare försök att genetiskt manipulera icke-axenic celler har saknat effektivitet och krävs komplexa experimentella procedurer. Vi har utvecklat ett enkelt transfection protokoll som, för första gången, övervinner dessa begränsningar. De serier av stora förbättringar till Dictyostelium molekylär genetik tillåta vildtyp celler att manipuleras så enkelt som standard laboratorie stammar. Utöver fördelarna för att studera okorrumperade signalering och motilitet processer, kan mutanter som stör macropinocytosis-baserade tillväxt nu lätt isolerade. Dessutom är hela transfection arbetsflödet avsevärt snabbare, med rekombinant celler som kan genereras i dagar snarare än veckor. En annan fördel är att molekylär genetik ytterligare kan utföras med nymalen isolerade vildtyp Dictyostelium prover från miljön. Detta kan bidra till att utvidga tillämpningsområdet för metoder som används inom dessa forskningsområden.

Introduction

Släktet Dictyostelium är jord-levande sociala amöba som främst livnär sig på bakterier. Placeras i stammen Amoebozoa, ett stort antal arter har isolerats som kan grupperas i fyra olika klader1. Arten Dictyostelium discoideum (D. discoideum) har blivit en populär modellorganism att studera komplexa cellulära processer såsom cellmigration och fagocytos. Att styra och standardisera försöksbetingelser, axenic cell linjer har utvecklats som kan växa i komplexa eller definierade flytande medium i avsaknad av bakterier2. Särskilt viktiga är Ax2, Ax3, och Ax4 stammar, som alla genereras på 1970-talet och som ytterst härrör från en enda wild isolera NC43. Verktyg för gentekniken utvecklades i dessa axenic stammar, vilket resulterar i den första publicera knockout i 19874,5. Protokoll var ytterligare utvecklad och optimerad för användning under axenic villkor6,7.

Anpassning av dessa protokoll till vildtyp D. discoideum stammar som inte kan växa i flytande buljong har varit försökt flera laboratorier. Detta har dock inte blivit fullt framgångsrik eftersom protokollen transfection är komplexa och saknar effektivitet, delvis på grund av bakterierna förmåga att agera som en diskbänk för selektiva reagens8,9. Som ett resultat, kommer i huvudsak alla molekylär data på D. discoideum från ättlingar till en enda vildtyp-isolat. Vi ville övervinna denna begränsning och utveckla en metod för att genetiskt modifiera D. discoideum celler oberoende av deras förmåga att växa i flytande medium. Behovet av en sådan metod kan förklaras av observationen att det antogs i det förflutna som de mutationer som ger axenic tillväxt var huvudsakligen neutrala och inte försämrar cellfysiologi. Detta antagande är bara delvis korrekt. I allmänhet finns det två anmärkningsvärda skillnader; först, mellan de olika isolerade axenic stammar, och andra, när dessa axenic stammar är jämfört med icke-axenic vilda isolat8,9.

Den mest kritiska faktorn är kanske den viktigaste axenic gen, yxaB, som identifierades nyligen som RasGAP NF1. NF1 som en RasGAP viktigaste funktion är att hindra Ras aktivitet3. Borttagningen av enzym i alla axenic stammar leder till överdriven Ras aktivitet manifesteras som bildandet av stora aktiva Ras fläckar. Dessa utvidgade Ras patchar leda till ansamling av PIP3 i plasmamembranet. Dessa slump visasende fläckar av PIP3 och aktiv Ras är en mall för bildandet av en cirkulär volang som så småningom stänger och leder till bildandet av macropinosomes10. Följden är en överdriven ökning av macropinocytic aktivitet. Macropinocytosis är en aktin-driven process. En tävling för cytoskeletal komponenter för bildandet av antingen macropinosomes eller pseudopods är resultatet. Dess inverkan på cell beteende återspeglas i nästan fullständig förebyggande av chemotaxisna vegetativa celler till folat11. Den kraftigt utvidgade PIP3 fläckar är mycket långlivade. Även i utsvultna celler, PIP3 patchar kvar och kan misstolkas som pseudopods, vilket kan orsaka problem tolka studier på chemotaxis till lägret.

I vissa fall är NF1 mutationen experimentellt användbar. Detta leder oss till en andra motivation för att utveckla en transfection metod för bacterially odlade D. discoideum celler, eftersom ökningen av macropinocytosis hastighet gör axenic celler värdefull för att undersöka grundläggande aspekter av denna process12 . Mutation i de gener som krävs för macropinocytosis, såsom Ras- och PI3-kinaser10, har dock nästan avskaffat axenic tillväxt, vilket gör det nödvändigt att manipulera dessa celler genom tillväxt på bakterier. En annan anledning som återger bakterier-baserade transfections värdefull är den ökande användningen av Dictyostelids att utforska frågor i utvecklingen av flera cellularitet13,14, kin erkännande15,16, och altruistiska cellulära beteende, vilket främst beror på användning av nymalen isolerade vildtyp isolerar17. Alla nämnda forskningsområden kan underlättas genom effektiva metoder för genetisk manipulering av vilda isolat, som är icke-axenic och växer inte i flytande buljong.

Våra protokoll möjliggör att övervinna beskrivna begränsningar. Tillsammans, möjlighet att utföra genetiska manipulationer med bakteriell växt D. discoideum celler rymmer fördelar för alla Dictyostelium forskare, även om det är bara ökad hastighet av urvalsprocessen beror på snabbare tillväxten av amöban (4 h fördubbling tid) på bakterier jämfört med tillväxt i axenic media (10 h fördubbling tid).

Protocol

1. beredning av celler och material

  1. SorMC buffert förberedelse
    1. Bereda 100 mL 100 x SorMC (Sorensen buffert inklusive MgCl2 och CaCl2) buffert genom upplösning 20.36 g KH2PO4 (15 mM) och 5.47 g Na2HPO4·7 H2O (2 mM) i 100 mL ddH2O vatten. Rör om lösningen vid rumstemperatur (RT) och föra volymen till 100 mL med dH2O.
      Obs: Den resulterande bufferten har ett pH på 6 och behöver inte ytterligare justering.
    2. Producera 1000 mL 1 x arbetar lösning i ddH2O. Tillsätt 50 µL varje MgCl2 och CaCl2 att uppnå slutliga koncentrationer av 50 µM varje. Filter sterilisera lösningen med ett 0,22 µm filter.
      Obs: Alltid lägga till MgCl2 och CaCl2 på 1 x buffert för att undvika utfällning av salter i 100 x stamlösning.
    3. Du laga KK2 buffert (2,2 g KH2PO4 och 0,7 g K2HPO4 för 1 L buffert) kompletterad med 50 µM MgCl2 och 50 µM CaCl2 (hädanefter kallas KK2MC). Använd denna buffert i hela istället för SorMC.
  2. Beredning av bakterier som näringskälla för D. discoideum
    1. Använd en enda koloni av K. aerogenes och Inokulera 1 L för LB-medium (lysogeny buljong). Använd en 2 L kolv. Låt bakterier växa över natten vid 37 ° C med skakningar vid 220 rpm.
      Obs: Om stora mängder bakterier krävs, Använd rikare medier som 2xTY (jästextrakt trypton medium) eller SOB (super optimal buljong) i stället för LB. Om användning av K. aerogenes bakterier inte är tillåten på grund av säkerhetsskäl, kan BL21 E. coli användas i stället.
    2. Skörda cellerna nästa dag genom att snurra dem ner i två 500 mL centrifugrör vid ~ 6 600 x g i 20 min. Tvätta bakterier en gång med 500 mL SorMC buffert.
    3. Återsuspendera pelleten i 20 mL SorMC. Kontrollera den OD600 (optisk densitet vid 600 nm) med en fotometer. Späd med samma bufferten till en OD600 av runt 100.
      Obs: K. aerogenes bakterier är svåra att pellets, så en relativt hög hastighet för spinning ner bakterier är nödvändigt för att undvika förlust av mat bakterier. Den resulterande bakteriell stamlösningen kan förvaras i upp till 4 månader i kylen vid 4 ° C och upprätthålla dess användbarhet som näringskälla för D. discoideum. 1 L av övernattningar K. aerogenes suspension vuxit i LB medium vanligtvis ger 20 mL av en OD600 av runt 100.
      Varning: För att garantera att de beredda bakterierna är en monokultur av K. aerogenes, utföra alla steg under en huv.
  3. Beredning av H40 elektroporation buffert
    1. Förbereda 100 mL buffertlösning, Lös 0.952 g HEPES i ddH2O vatten och tillsätt 100 µL av MgCl2 från 1 M stamlösning. Justera till pH 7 med KOH för titrering. Sterilisera bufferten med 0,22 µm filter eller autoklav. Använd syrafritt HEPES och inte natriumsaltet.
  4. Utföra plasmid förberedelse efter tillverkarens protokollet och med de kit som sammanfattas i Tabell för material. Använd de plasmider som sammanfattas i tabell 1.
    Obs: Kvaliteten på DNA används för transfection är avgörande. Valet av D. discoideum transfectants växer på bakterier har särskilda krav för initiativtagarna körning urval och uttryck kassetten (se diskussion).
plasmid namn motstånd/urval i bakterier motstånd/markeringen i Dictyostelium tag
extrachromosomal uttryck plasmider
pDM1203 Ampicilin G418 Nej
pDM1207 Ampicilin G418 N-terminala GFP
pDM1208 Ampicilin G418 N-terminala mCherry
pPI159 Ampicilin G418 N-terminala mNeon
pPI437 Ampicilin G418 N-terminala mScarlet
pPI54 Ampicilin G418 N-terminala mTurquoise2
pDM1209 Ampicilin G418 C-terminal GFP
pDM1210 Ampicilin G418 C-terminal mCherry
pPI143 Ampicilin G418 C-terminal mNeon
pPI459 Ampicilin G418 C-terminal mScarlet
pPI142 Ampicilin G418 C-terminal mTurquoise2
Shuttle plasmider
pDM344 Ampicilin Nej Nej
pDM1019 Ampicilin Nej N-terminala GFP
pDM1018 Ampicilin Nej N-terminala mCherry
pPI152 Ampicilin Nej N-terminala mNeon
pPI418 Ampicilin Nej N-terminala mScarlet
pPI150 Ampicilin Nej N-terminala mTurquoise2
pDM1021 Ampicilin Nej C-terminal GFP
pDM1020 Ampicilin Nej C-terminal mCherry
pPI153 Ampicilin Nej C-terminal mNeon
pPI457 Ampicilin Nej C-terminal mScarlet
pPI151 Ampicilin Nej C-terminal mTurquoise2
inducerbara extrachromosomal uttryck plasmider
pDM1038 Ampicilin Hygromycin Nej
pDM1047 Ampicilin Hygromycin N-terminala GFP
pDM1046 Ampicilin Hygromycin N-terminala mCherry
pPI450 Ampicilin Hygromycin N-terminala mNeon
pPI452 Ampicilin Hygromycin N-terminala mScarlet
pPI449 Ampicilin Hygromycin N-terminala mTurquoise2
pDM1049 Ampicilin Hygromycin C-terminal GFP
pDM1048 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI470 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI460 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI469 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
act5 fristad inriktning plasmider
pDM1501 Ampicilin Hygromycin Nej
pDM1513 Ampicilin Hygromycin N-terminala GFP
pDM1514 Ampicilin Hygromycin N-terminala mCherry
pPI231 Ampicilin Hygromycin N-terminala mNeon
pPI419 Ampicilin Hygromycin N-terminala mScarlet
pPI228 Ampicilin Hygromycin N-terminala mTurquoise2
pDM1515 Ampicilin Hygromycin C-terminal GFP
pDM1516 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI230 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI458 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI229 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
REMI uttryck plasmider
pDM1220 Ampicilin Hygromycin Nej
pDM1351 Ampicilin Hygromycin N-terminala GFP
pDM1259 Ampicilin Hygromycin N-terminala mCherry
pPI465 Ampicilin Hygromycin N-terminala mNeon
pPI468 Ampicilin Hygromycin N-terminala mScarlet
pPI466 Ampicilin Hygromycin N-terminala mTurquoise2
pDM1352 Ampicilin Hygromycin C-terminal GFP
pDM1305 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI471 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI467 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI472 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
riktade i ram plasmider
pDM1355 Ampicilin Hygromycin C-terminal GFP
pPI461 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI462 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI464 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI463 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
Knock-out plasmider
pDM1079 Ampicilin Blasticidin Nej
pDM1080 Ampicilin Nourseothricin Nej
pDM1081 Ampicilin Hygromycin Nej
pDM1082 Ampicilin G418 Nej
CRE uttryck plasmider
pDM1483 Ampicilin Nourseothricin Nej
pDM1489 Ampicilin Hygromycin Nej
pDM1488 Ampicilin G418 Nej

Tabell 1: Plasmid lista för icke-axenic transfections.

  1. Ställa in Dictyostelium celler för transfection
    1. Växa K. aerogenes till sammanflödet i SM medium (näringsrika medium) övernattning på RT. kulturer kan lagras i upp till 2 veckor vid 4 ° C.
    2. Tillsätt ca 400 µL av denna bakteriesuspension på SM agar plåt (pepton 10 g/L; jäst extrakt 1 g/L; glukos 10 g/L; KH2PO4 1,9 g/L; K2HPO4 x 3 H2O, 1,3 g/L; MgSO4 vattenfri 0,49 g/L; 1,7% agar) och jämnt. Ta en steril ögla och Inokulera med Dictyostelium celler. Sprida cellerna på ena kanten av plattan.
    3. Inkubera plattan vid 22 ° C i 2 dagar för att säkerställa tillräckligt stor tillväxt zoner för transfection.
      Obs: För Dictyostelium stammar som inte göra stora tillväxt zoner (t.ex. Ax3, DH1 eller JH10), eller Använd för oerfarna praktiker, clearing plattor istället. För detta, följ instruktionerna i steg 1.5.4 till 1.5.6.
    4. Ta en steril ögla och Inokulera med Dictyostelium celler (cirka 2-4 x 105 celler). Överföra cellerna till 800 µL av en tät K. aerogenes suspension i SM. Mix celler genom pipettering upp och ner.
    5. Överföra 400 µL, 200 µL, 100 µL och 50 µL på färska SM agarplattor. Lägg till varje tallrik 400 µL ytterligare SM K. aerogenes suspension, jämnt och torrt.
    6. Inkubera plattorna vid 22 ° C i ca 2 dagar tills plattorna blivit genomskinlig.
      Obs: På grund av deras snabbare tillväxttakt, bakterierna producerar inledningsvis en konfluenta gräsmatta och endoparasiterna ”rensa därefter” plattan av bakterier. Den tid som krävs för denna process kan variera beroende på stam bakgrunden och förmåga mutanta celler att växa på bakterier.

2. transfection av Dictyostelium celler baserat på bakteriell val

Figure 1
Figur 1 : Arbetsflöde för transfection bakterier odlas Dictyostelium celler. Stegen för transfection är listade enligt följande. Odla D. discoideum cellerna på en SM-platta som ympats med K. aerogenes bakterier (röd). Skörda celler bara framifrån utfodring (grön), undvika celler som redan utvecklar (Mörkgrön). Tvätta cellerna i H40. Att resuspendera cellerna till en slutlig densitet på 2-4 x 107 celler/mL. Blanda cellsuspension med 1-2 µg av DNA. Överför blandningen till ett elektroporation kyvetten och puls celler. Överföra cellerna direkt efter elektroporation till en maträtt med SorMC och bakterier. Att cellerna att återhämta sig i 5 h innan du lägger den valbara markören. För extrachromosomal plasmider, lägga valet direkt i skålen. Transfectants är vanligtvis synliga efter ~ 2 dagar. Linearized konstruktioner som syftar för enkel integrering i genomet, ställa in tre utspädningar som anges och lägga till markeringen. Bakterier är tagna från OD600 = 100 stamlösning. Blanda rören väl och överföra cellerna i 96 brunnar platt-botten vävnadsodling plattor. Använd två plattor per utspädning. Pipettera över 150 µL cellsuspension till varje brunn. Det tar ca 5 dagar tills snäva kolonier är synliga. De röda brunnarna visar ett exempel på den vanliga mängden framgångsrikt transformerade celler erhålls (övre panelen modifierad från tidigare publication22). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. För att förbereda plattor med K. aerogenes fjädring, tillsätt 10 mL av SorMC buffert innehållande K. aerogenes bakterier till densitet OD600 = 2 (tillsätt 200 µL av beredda OD600 = 100 K. aerogenes stamlösning för önskad bakterier koncentration) i en 10 cm vävnadsodling behandlas petriskål.
    Obs: Denna platta behövs senare att odla de transfekterade D. discoideum celler. Alternativt, en 6-väl-vävnadskultur platta kan användas. När det gäller transfection av extrachromosomal plasmidsna är 6-väl-vävnadskultur plattan mer resurseffektiv. Använd 2 mL av K. aerogenes SorMC (OD600 = 2) suspension per brunn.
  2. Beredning av Dictyostelium celler
    1. Använda en 10 µL disponibla inympning loop, skrapa celler från zonerna tillväxt (ca 3 cm) av kultur plattan (kanten av området rensas) eller rensa plattan. Överföra celler i ett 1,5 mL rör innehållande 1 mL iskallt H40 buffert.
      Obs: Tidpunkten för skörd celler från clearing plattor är avgörande. Skörd för tidigt avkastning för lite en mängd celler, medan skörd till sena ökar utvecklat risken för framställning av delvis celler.
    2. Tvätta cellerna genom att snurra ner för 2 min på 1 000 x g - eller flash-spinning för 2 s vid 10 000 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i H40 buffert till slutliga densitet av 2-4 x 107 celler/mL. Hålla cellerna kall under förfarandet för hela transfection. Använd ett is-vatten flytgödsel för att säkerställa direktkontakt av rören och is.
  3. Elektroporation
    1. Tillsätt 100 µL av celler till ett rör med 1-2 µg av DNA. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner.
    2. Över cell/DNA blandningen till en pre kylda elektroporation kyvetten (2 mm gap).
    3. Puls cellerna med följande kvadratiska våg inställningar: 350 V, 8 ms, 2 pulser och 1 s puls intervall.
      Obs: Lägg inte till mer än 2 µg av DNA. Högre belopp är giftiga för celler och minska transfection effektivitet. Totalen lagt till DNA volym inte bör överstiga 5 µL.
    4. Överföra celler omedelbart till den tidigare beredda 10 cm petriskål med K. aerogenes SorMC och låta cellerna att återhämta sig i 5 h.
      Obs: Markera cellerna i petriskål under en inverterade Mikroskop. Celler visas runda direkt efter elektroporation men återgår till sin amoeboid form efter ca 30 min, när de har haft tillräckligt med tid att fästa ordentligt på ytan.
  4. Urval av transfectants: beroende på huruvida transfection, syftar till att generera en knock-out, inpressning eller act5 inpressning, eller att uttrycka ett fluorescerande reporter protein från en extrachromosomal plasmid utföra urvalsprocessen genom en av följande beskrivs metoder.
    Obs: Till skillnad från axenically odlade celler är bacterially odlade celler mycket motståndskraftig mot blasticidin. Urval, därför utförs alltid med G418 eller hygromycin (se diskussion).
    1. Knock-outs, knock-ins och act5 knock-ins
      1. Lossa cellerna noggrant från petriskål genom upprepade gånger tvingar vätskan från en pipett på ytan.
      2. Ställa in tre utspädningar i SorMC K. aerogenes avstängning (OD600 = 2) och Lägg till det selektiva ämnet enligt det motstånd som används (se figur 1).
      3. Låg utspädning: blanda 9 mL cellsuspension med 20,4 mL SorMC och 600 µL av K. aerogenes stamlösning.
      4. Medelstora utspädning: blanda 900 µL cellsuspension med 28,5 mL SorMC och 600 µL av K. aerogenes stamlösning.
      5. Hög utspädning: blanda 90 µL cellsuspension med 29,3 mL SorMC och 600 µL av K. aerogenes stamlösning.
      6. Tillsätt 30 µL av valbara markör (100 x stamlösning).
      7. Fördela de beredda utspädningarna i 96 brunnar platt-botten vävnadsodling plattor av pipettering 150 µL cellsuspension i varje brunn.
        Obs: Detta förfarande syftar till att skärmen enda kloner i stället för populationer. Valet äger ca 5-7 dagar, beroende på den konstruktionen används.
    2. Extrachromosomal plasmider
      1. Lägg till valbar markören direkt till 10 mL skålen (se figur 1).
        Obs: Finns ingen anledning att ställa in utspädningar, eftersom det finns ingen önskan för klonal populationer. Urvalsprocessen för extrachromosomal plasmider är snabbare på grund av höga kopia antalet närvarande i D. discoideum celler. Transfectants kan förväntas efter 32 h till 2 dagar.
        Varning: De antibiotika som används som valbar markör är giftiga. Använd handskar.
  5. Skärm erhållna klonerna för positiva tranfectants. För knock-out eller inpressning försök, följ instruktionerna i steg 2.5.1. Kontrollera transfection framgång för extrachromosomal plasmider genom att följa anvisningarna i steg 2.5.2.
    1. För knock-outs, knock-ins och act5 knock-ins, utföra den inledande skärmen via PCR att bekräfta konstruera integreras i den rätta genomisk locus.
      Obs: För att maximera sannolikheten för klonal populationer, använda den högsta utspädning möjligt som ger transfectants efter valet. Målet för plattor som är ett maximalt en tredjedel av brunnar ockuperade.
      1. Expandera klonal populationer kan överföra kloner som vuxit fram efter urval från 96 brunnar vävnad-kultur plattan till en 12-väl-vävnadskultur platta att växa tillräckligt med celler för isolering av genomisk DNA. Förse varje brunn med 1 mL av SorMC K. aerogenes (OD600 = 2) och färska valbara markör.
        Obs: 1 dag är vanligen tillräckligt för att erhålla en konfluenta väl passande för DNA isolering.
      2. För att utföra mini genomisk DNA isolering, skörda cellerna i en konfluenta väl och isolera genomiskt DNA med hjälp av ett DNA extraktion mini-kit följa tillverkarens instruktioner.
      3. Använd isolerade genomisk DNA tillsammans med lämpliga grundfärger och Taq-polymeras (se Tabell för material) till PCR-skärm för positiva integrands.
        Obs: Efter bekräftelse av positiv integration in i det rätta genomiska locus, bör en Southern blot-analys utföras. Detta säkerställer större förtroende att ytterligare införande i ospecifika genomisk regioner inte händelser.
    2. För fluorescerande reporter proteiner, visuellt identifiera positiva fluorescerande celler och kontrollera med fluorescens Mikroskop. Alternativt utföra en western blot med lämplig antikroppar för biokemiska identifiering.
PCR-program
steg temperatur tid
Inledande denaturering 94 ° C 30 s
30 cykler 94 ° C 15-30 s
42 ° C 15-60 s
68 ° C 1 min/kb
Slutliga förlängning 68 ° C 5 min
Håll 4-10 ° C
Reaktion sammansättning
komponent 25 μL reaktion slutlig koncentration
10 µM framåt Primer 0,5 ΜL 0,2 ΜM
10 µM reverse Primer 0,5 ΜL 0,2 ΜM
Templat-DNA variabel (ca. 5 µL) < 1000 ng
2 x Master Mix med Standard buffert inklusive polymeras (se tabell material) 12.5 ΜL 1 x
Nuclease-gratis vatten till 25 µL < 1000 ng

Tabell 2: PCR-program och prov sammansättning för förstärkning av D. discoideum genomiskt DNA.

Representative Results

Extrachromosomal plasmider används för reporter studier, som syftar till att identifiera lokaliseringen av vissa proteiner inuti en cell eller förändringar i cellstruktur av mutanta celler. För många metoder, såsom kontroll av cellcykeln, är det avgörande att uttrycka två reportrar samtidigt. Detta är nu möjligt med hjälp av vår dubbla reporter extrachromosomal plasmid system (tabell 1). Dag 1, var celler transfekterade innan du lägger den valbara markören G418 efter 5 h (figur 1). I exemplet, NC4, DdB, Ax2 och självständigt härledda vilda isolaten V12M2 och WS2162 (kompletterande Tabell1) var transfekterade med de plasmiden pPI289, som kodar för GFP-TubulinA, en markör för mikrotubuli och mCherry-PCNA, ett protein som är används för att övervaka cellcykeln (figur 2A). Efter 32 h observerades cellerna under mikroskopet. Flertalet celler uttrycks både lysrör-märkt fusionsproteinerna, rapporterar konsekvent med tidigare detta uttryck av två reportrar från samma plasmid visar liknande uttryck nivåer, vilket är nästan omöjligt när man använder två olika plasmider 18,19. En representativ cell för varje cellinje (NC4, DdB, Ax2, V12M2 och WS2162) uttrycker önskad dubbla reportern visas i figur 2B. Transfection effektivitetsvinsterna sammanfattas i figur2 C. NC4-derived cellinjer visar de bästa transfection effektivitetsvinsterna. Dock för cellinjer V12M2 och WS2162 erhölls ett betydligt hög antal transfectants.

Figure 2
Figur 2 : Uttryck för en extrachromosomal plasmid. (A) Extrachromosomal plasmider är direkt transfekterade i runda form. Som ett exempel visas den dubbla reporter pPI289. NgoMIV webbplatser visar införandet av andra reportern i extrachromosomal uttryck Plasmiden. (B) Z-projektion av en representativ cell uttrycker GFP-TubulinA (Cytoplasmatisk) och mCherry-PCNA (till stor del kärnkraft) för fem olika vildtyp cellinjer används (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) transfection effektivitetsvinster för de fem cellinjer som avbildas i (B) beräknades. Visas är medelvärdet av två experiment. Felstaplarna visar ± SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Integrering av en inriktning vektor i en angiven genomisk locus är mer utmanande och kräver mer noggrann analys av den genererade cell-linjen. I figur 3görs en act5- mCherry KI i NC4. Det första måste plasmiden vara linearized för att öka frekvensen av rekombination händelser efter transfection. För detta skärs de plasmiden pDM1514 med NgoMIV. Två band erhålls efter körs digest på en agarosgel. 4127 bp bandet innehåller den önska bygga (figur 3). För transfection, smält DNA måste extraheras från gelen och renas med en gel utvinning kit följa tillverkarens instruktioner.

Figure 3
Figur 3 : Förberedelse av act5 inpressning och DNA för transfection. Ett exempel på användningen av en agera5 inpressning av Plasmiden pDM1514 visas. Anvisningarna för förberedelser är listade enligt följande. (A) innan elektroporation, linjär plasmiden med de angivna NgoMIV sites. (B, C) Kör skär plasmiden på en agarosgel tills de två beräknade banden är korrekt avgränsade. Klipp ut 4127 bp bandet som innehåller rekombination armarna, mCherry och motstånd-kassett och gel extrahera DNA. DNA är nu klar för transfection. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den renade DNA användes för transfection NC4 celler. Efter 5-6 dagar av urval erhölls kloner. Representativa transfection effektivitetsvinster och mängden positiva identifierade kloner för flera act5 inpressning försök sammanfattas i tabell 3. Två kloner av den NC4 transfection var slumpmässigt valt och analyseras med PCR (figur 4A), och båda visade de förutspådda band mönsterna förväntas av en inpressning och validerades ytterligare med Southern blot-analys för att säkerställa en enda integration i händelse av bygga in i genomet20. Blot visar en tydlig inre integration i det önska act5 locus (figur 4B). Den genererade NC4::act5-mCherry -cellinje kan nu användas i experiment.

Figure 4
Figur 4 : Validering av act5- mCherry KIs i NC4. (A) system och kontroll primärvården för validering av positiva integrationer till act5 locus. Indikerade primers användes för att analysera två oberoende kloner och förälder. Båda kloner Visa beräknade banden för resistens-kassett och nedströms (P1) eller uppströms primer (P2), som inte är närvarande i föräldrarnas stam. Kombinationen primer (P1/P2) bekräftar korrekt integrering av mCherry och motstånd kassett i det act5 locus. Den vildtyp NC4 visar förväntade 2800 bp bandet, medan både KI kloner saknar detta band och i stället Visa en PCR produkt om 1400 baspar större. (B) system för begagnade begränsning digest och Southern blot. Båda inpressning kloner Visa mindre 3400 bp bandet, som är resultatet av konstruera integreras i det agera5 locus, särskilt den ytterligare Bcljag plats i hygromycin motstånd kassett. Vildtyp kontroll visar den förväntade 5,8 kb som härrör från de två nedströms belägna Bcljag webbplatser. Blot var beskuren och skarvas för tydlighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

riktade konstruktion i det act5 locus plasmid namn antal ockuperade brunnar antal kontrollerade kloner Positiva kloner Rätt kloner (%) Dictyostelium stam används transfection effektivitet (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA)
LifeAct-mCherry pPI226 7 7 1 14,2 AX2 3,5 x 10 ^ -6
LifeAct-GFP pPI227 12 12 5 41,6 AX2 6 x 10 ^ -6
GOD JORDBRUKARSED pDM1513 3 3 2 66,6 AX2 1,5 x 10 ^ -6
mCherry pDM1514 3 3 1 33,3 AX2 1,5 x 10 ^ -6
GOD JORDBRUKARSED pDM1513 66 9 5 55,5 AX2 3.3 x 10 ^ -5
mCherry pDM1514 221 12 10 83,3 AX2 1.1 x 10 ^ -4
H2B-mCherry pPI420 3 3 1 33,3 AX2 1,5 x 10 ^ -6
H2B-mCherry pPI420 7 7 6 85,7 AX2 3,5 x 10 ^ -6
mCherry pDM1514 10 10 7 70 DdB 5 x 10 ^ -6
mCherry pDM1514 240 12 11 91,6 DdB 1,2 x 10 ^ -4
mCherry pDM1514 320 12 12 100 NC4 1.6 x 10 ^ -4

Tabell 3: Transfection effektivitetsvinster och mängden erhållna positiva transfectants för generering av act5 KIs i annan stam bakgrunder 22 .

Det agera5 locus erbjuder relativt homogen uttryck av integrerade reporter21. Genererade NC4::act5-mCherry cellerna tillåta blandning experiment kan utföras med andra act5 knock-moduler använder en olika fluorescerande protein såsom god Jordbrukarsed. För att betona den stora fördelen med detta system, visas blandande experiment med Ax2::act5-GFP . På grund av oförmågan att transfect icke-axenic vildtyp celler, kunde denna typ av strategi inte utföras innan. Blanda experiment är ett viktigt verktyg för att analysera cell beteende, eftersom de tillåter en direkt jämförelse mellan olika cellinjer upplever identiska experimentella förhållanden. NC4 cellerna växer snabbare på bakteriell gräsmattor än Ax2 celler (figur 5A). Detta kan bero på en högre kapacitet att phagocytose bakterier eller förbättrad förmåga att flytta och Visa chemotaxis mot en näringskälla. Med en under agar folat chemotaxis-analys, utfördes direkt jämförelse av en befolkning på NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFP , visar att NC4::act5-mCherry är mycket mer effektiva i folat avkänning. Efter 4 h skulle mer NC4::act5-mCherry celler kunna krypa under Agarens än Ax2::act5-GFP celler (figur 5B). Analysera standardstatistisk av chemotaxisna för cellerna migrerar under Agarens avslöjade att NC4::act5-mCherry celler var snabbare och visade starkare kemotaktisk svar än Ax2::act5-GFP celler (figur 5C-E ).

Figure 5
Figur 5 : Använder agera5 KIs för image-baserad chemotaxis mix experiment. (A) NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFP uttrycker det indikerade fluorescerande proteinet från det agera5 locus analyserades för förmågan att växa på en bakteriell gräsmattan. Efter 4 dagar mättes plack diameter uppstått från ensliga guldpläterade Dictyostelium celler. Icke-axenic act5:: NC4 celler göra betydligt större plack än axenic Ax2::act5-GFP celler (genomsnitt ± SD, *** p < 0,0001, n = 3, skala bar 5 mm). (B) för användning av under-agaros folat chemotaxisna analys22 att direkt jämföra kemotaktisk förmåga av NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFP används i (A), bakterier-växt endoparasiterna av båda stammar var blandade i förhållandet 50: 50. Celler fick krypa under Agarens. Efter 4 h, var celler som migrera upp folat övertoningen avbildas med confocal Mikroskop. Antalet celler som NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFP fastställdes därefter. NC4::act5-mCherry cellerna var effektivare i avkänning folat. Om 10-faldig mer NC4::act5-mCherry celler hittades jämfört med Ax2::act5-GFP celler (genomsnitt ± SD, *** p < 0,0001, n = 6, skala bar 100 µm). (C, D) Cellerna har filmats för 60 min och deras hastighet och kemotaktisk index beräknades. Efter första urval av de mest chemotactically lyhörd cellerna (endast de som migrerade under Agarens), celler Ax2::act5-GFP visade lägre värden för både cell hastighet och chemotaxisna. Femtio celler per cell fodrar analyserades. (median ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) spåren av NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFPact5 knock-ins ritas över 60 min, visar mer riktad rörelse mot den chemoattractent källan för NC4::act5-mCherry cellerna (median ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De act5 inpressning cellinjer kan också användas för flödescytometri. Som med tillväxt på bakterier, finns det stora skillnader i utveckling mellan axenic stammar och icke-axenic wild-typer. Efter utveckling, fruktkroppar av NC4 celler är ungefär dubbelt så stor som de härrör från Ax2 celler. Om cellerna blandas, erhålls en mellanliggande storlek fruiting kropp. För att analysera bidrag av både cellinjer mer kvantitativt, användes flödescytometri. Dessa analyser visade tydligt att de mellanliggande medelstora fruktkroppar är på grund av olika nivåer av bidrag från både cellinjer. Medan NC4::act5-mCherry celler består cirka 75% av de uppmätta Sporerna, bidrog Ax2::act5-GFP endast 25%, avslöjar en potentiell fitness fördel för icke-axenic stammar (figur 6). Eftersom analysen inte övervakar stjälken cell befolkningen, finns det två möjligheter att förklara obalansen i utveckling mellan Ax2 och NC4. En möjlighet är att Ax2 celler bidrar främst till stjälk cell befolkningen, i stället för att ange spor cellen befolkningen. Alternativt mer NC4 celler kan ange utvecklingsmässiga cykeln, med Ax2 relativt försenade, och de kan därför inte bidra till montering av en fruiting kropp. Möjlighet att transfect icke-axenic vildtyp celler utvecklar andra tillvägagångssätt och förenklar experimentella rutiner.

Figure 6
Figur 6: Act5 KIs möjliggöra analys av mix experiment med flödescytometri. (A) NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFP har utvecklats separat eller i en 50: 50-blandning på icke-näringsämne agarplattor. NC4::act5-mCherry celler bildar större fruktkroppar än Ax2::act5-GFP. Mixen i stället visar en mellanliggande storlek (skala bar 5 mm). Confocal fluorescens ljusmikroskopi föreslår en större mängd NC4::act5-mCherry sporer i spore huvuden härrör från mixar. (B) att kvantifiera denna observation, mängder sporer i skördade spore huvuden från blandning experimentet i (A) analyserades av flödescytometri. Cirka 75% av sporer härstammar från NC4::act5-mCherry celler, med endast 25% från Ax2::act5-GFP celler. (C) representativ fördelning av sporer från både cellinjer som visas i ett flöde flödescytometri scatter. Om 0,05% visar positiva mCherry och god Jordbrukarsed signaler, vilket tyder på att parasexual fusion bearbetar har inträffat eller att sporer sticker till varandra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Cellinje Genetiskt bakgrund Referensnummer Utgiven före Typ
AX2 (Ka) DBS0235521 Bloomfield et al., 2008 vildtyp
NC4 (S) Bloomfield et al., 2008 vildtyp
act5::mCherry klon 5 NC4 HM1912 Paschke et al., 2018 act5 inpressning
act5::GFP klon 2 AX2 HM1930 Paschke et al., 2018 act5 inpressning
V12M2 Bloomfield et al., 2008 vildtyp
WS2162 Bloomfield et al., 2008 vildtyp

Kompletterande Tabell1: olika stammar av Dictyostelium studerade.

Discussion

Användning av icke-axenic, vildtyp Dictyostelium celler har varit mycket begränsad hittills i molekylär forskning. Tillgängliga metoder för genetisk modifiering av dessa stammar har saknat tillförlitlighet och effektivitet23, hindrar deras allmänna antagandet. De genererade material och protokoll som presenteras här kan användas för någon D. discoideum stam oberoende av dess förmåga för att växa i flytande medium. Det bör nämnas att detta protokoll är optimerad för NC4-derived cellinjer. Transfection effektivitetsvinster för färska isolerade stammar från vilt skiljer sig från NC4, så vi har iakttagits före och visas här för V12M2 och WS21628,9. Elektroporation villkoren i synnerhet verkar ha ett avsevärt inflytande på transfection effektivitetsvinster och kan kräva ytterligare optimering för vissa stammar. I allmänhet, en tillräcklig mängd av transfectants har observerats i alla stammar testat hittills visar att dessa metoder är fungerande. Antalet positiva transfectants som erhållits med NC4-derived stammar är högre jämfört med andra icke-axenic vildtyp-stammar, men i alla fall, erhålls tillräckligt antal transfectants för att tillåta att ytterligare experiment. Detta, plus enkelheten i våra protokoll, är det stor förbättring jämfört med tidigare försök8,9.

Dessa nya icke-axenic protokoll täcka alla genetiska standardförfaranden och lägga till ytterligare fördelar, eftersom transfections kan utföras snabbt och effektivt parallellt. Positiva kloner kan erhållas i dagar i stället för veckor, eftersom tillväxt på bakterier halvor division tiden. De nyinrättade plasmidsna också arbeta under axenic förhållanden och kan rutinmässigt användas under båda tillväxt villkorar, som är en annan befordran av denna metodik22. Införts i protokollet plasmiden används för selektion på bakterier har särskilda krav som är avgörande för framgången för transfection. I synnerhet är tillskyndarna körning uttrycket och motstånd korgarna viktiga för framgångsrik transfection. Används ofta act6 (aktin 6) arrangören24 för körning motstånd eller uttryck korgarna saknar effektivitet när cellerna odlas på bakterier. I vårt plasmid system kör högaktiv act15 (aktin 15) arrangören alla uttryck kassetter, medan motstånd kassetterna är under kontroll av en coA (coactosin A) arrangören, som båda är aktiva under axenic förhållanden och celler odlas på bakterier. Krav för uttrycket av reporter konstruerar samt inpressning och knock-out konstruktioner gör det nödvändigt att använda vår plasmid repertoar, men tyvärr begränsar användningen av vektorer som redan skapats som använder ineffektiva act6 arrangören.

Arrangören effektivitetsvinsterna är särskilt kritiska för transfections som beror på en enda integration händelse till den rätta genomisk locus. På grund av vår förbättring av initiativtagare körning uttrycket motstånd genen, produceras tillräckligt motstånd med protein från single locus integrationer. Ett stort bekymmer var den gynnar av flera integrationer i genomet när du använder hygromycin eller G418 som beskrivs. Ingen gynnar av flera integrationer har observerats hittills, som tidigare rapporterats för G418 val med hjälp av äldre arrangören system25. Detta innebär att både hygromycin och G418 är lämplig valbara markörer för generering av ren knock-outs och knock-ins. Tyvärr, den valbara markör blasticidin fungerar inte på icke-axenic villkor. Detta är en stor nackdel med vår metod, eftersom blasticidin motstånd kassett används rutinmässigt för att generera knock-out konstruktioner i D. discoideum. Konstruktioner som genererades redan med blasticidin motstånd kassetter kommer att behöva vara rederived med en av de fungerande valbara markörerna. En annan möjlighet att övervinna denna begränsning är att kombinera den nyligen inrättade axenic D. discoideum CRISPR teknik med denna transfection protokoll26. Generering av lämplig, enda guide RNAs (sgRNAs) är enklare och snabbare än återuppbyggnaden av fullständig knock-out konstruktioner. För framtida inriktningar, möjligheten att generera flera knock-outs med hjälp av CRISPR/Cas9 kombinerat med detta transfection protokoll är tilltalande och kan bana väg för många forskare inom gemenskapens Dictyostelium . Användbarheten av den etablerade övergående uttryck system för CRISPR/Cas9 i axenic odlade celler bör dock undersökas noggrant.

Act5 inpressning systemet presenteras erbjuder en pålitlig och säker integration system för generering av stabil cellinjer i D. discoideum, med fördelen av liknande platser i andra organismer22. Det också beror på en enda integration händelse i genomet och erbjuder många möjligheter till olika forskningsinriktningar. Act5 arrangören är starkt aktiva och garanterar nästan homogent uttryck27 oberoende av odling villkor. Fluorescerande reporter proteiner kan enkelt integreras i denna fristad locus använder de bakåtkompilerade inriktning plasmidsna. Detta kan vara användbart, exempelvis för cell-spårning ändamål, som visas här i en mix experiment. Cellerna visar minimal cell till cell uttryck variationer, som kan bistå i automatiserade cell tracking. Ännu viktigare, visas införandet av en önskad sekvens till det agera5 locus fenotypiskt neutrala28,29. Som uttrycket inte beror på en valbar markör att upprätthålla proteinuttryck, som sett i slumpmässiga integrants eller extrachromosomal vector-bärande cellinjer, kan act5 systemet vara användbar för räddning experiment, samt. Eftersom cellinjer är homogen, kan alla celler analyseras. Detta är inte möjligt med en extrachromosomal plasmid för uttryck, där det finns betydande olikheter i uttrycket.

Förutom dessa allmänna förbättringar för alla stammar kan förmågan att använda icke-axenic vildtyp celler för molekylär forskning en bedömning av effekterna av ackumulerade mutationer i nuvarande laboratorie stammar. Flera genetiska rearrangements har hittats sedan antagandet av Ax2 stammen 1970, som framgår av tidigare publicerade microarray analyser26. Syntetiska fenotyper observeras på grund av förekomsten av dessa mutationer. En rapporterad phg2 mutant visar exempelvis minskad friktion i ett laboratorium stam bakgrund och ökad vidhäftning i ytterligare3. Sådana motstridiga uppgifter kan nu lösas genom att upprepa experimentet i gemensamma förfader stam (i detta fall, DdB). Styrkan i detta synsätt har nyligen visat för de små GTPase RasS30,31.

Förmågan att utföra genetiska experiment i någon D. discoideum stam expanderar potentialen i nya forskningsinriktningar som beror på användning av vilda isolat, särskilt de som rör sociala evolution, kin erkännande och den sexuella cykel22.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Kay lab för indata till denna metod och LMB mikroskopi och flöde flödescytometri faciliteter för utmärkt vetenskapligt och tekniskt stöd. Detta arbete finansierades av medicinska forskningsrådet grant MC_U105115237 R. R. Kay, BBSRC (bioteknik och biologiska Sciences Research Council) grant BB/K009699/1 R. R. Kay, Cancer Research UK bevilja A15672 till R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z till Jonathan R Chubb och MRC finansiering (MC_U12266B) till MRC LMCB universitet enheten vid UCL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R ThermoScientific 05-400-002
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor ThermoScientific 12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers Sigma Aldrich EP6331000025
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules BioRad 1652660
Safety Cabinet Foruna - SCANLAF Labogene
BioPhotometer Plus Eppendorf
CLSM 710 Zeiss
Media & Agaroses
LoFlo Medium Formedium LF0501
Seakem GTG Agarose Lonza 50071
Low EEO Agarose BioGene 300-200
Purified Agar Oxoid LP0028
SM broth Formedium SMB0102
2x LB broth Formedium LBD0102
Chemicals
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoScientific S33102
1 Kb Plus DNA Ladder ThermoScientific 10787018
1 Kb DNA Ladder NEB N3232L
HEPES free acid Sigma Aldrich/Merck 391340 EMD
KH2PO4 VWR P/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2O VWR 10028-24-7
MgCl2 * 6 H2O Sigma Aldrich/Merck 5982 EMD
CaCl2 * 2 H2O Sigma Aldrich 442909
Folic Acid Sigma Aldrich F7876
KOH VWR 26668.263
Cultur Dishes
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3595
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3516
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 353003
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 MatTek Corporation P50G-1.5-30-F
Antibiotics
Geneticin G418-sulphate Gibco by Life Technologies 11811-023
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1
Additional Consumables
2 mm gap electroporation cuvettes, long electrode Geneflow Limited E6-0062
10 µL Inoculating Loop, Blue 10 Micro L ThermoScientific 129399
Spreader, L-shaped, sterile greiner bio-one 730190
Combitips advanced 5 mL Eppendorf BIOPUR 30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep Classic Zymoresearch D4016
Quick DNA Miniprep Kit Zymoresearch D3025
Zymoclean DNA Recovery Kit Zymoresearch D40002
Enzymes
Restriction enzymes NEB
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer NEB M0482L
T4 DNA Ligase NEB M0202S
PrimeSTAR Max DNA Polymerase TakaraBio R045A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schaap, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum. Development. 138 (3), 387-396 (2011).
  2. Sussman, R., Sussman, M. Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).
  3. Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).
  4. Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein. The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).
  5. De Lozanne, A., Spudich, J. A. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination. Science. 236, 1086-1091 (1987).
  6. Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum. Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).
  7. Knecht, D., Pang, K. M. Electroporation of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).
  8. Wetterauer, B., et al. Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene. Plasmid. 36, 169-181 (1996).
  9. Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains. Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).
  10. Bloomfield, G., et al. Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium. eLife. 4, (2015).
  11. Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. eLife. 5, (2016).
  12. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).
  13. Hoeller, O., Kay, R. R. Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients. Current Biology. 17, 813-817 (2007).
  14. Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement. Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).
  15. Schaap, P., et al. Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas. Science. 314, 661-663 (2006).
  16. Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).
  17. Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes. Science. 333 (6041), 467-470 (2011).
  18. Strassmann, J. E., Queller, D. C. Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).
  19. Wolf, J. B., et al. Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success. Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).
  20. Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).
  21. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).
  22. Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).
  23. Woznica, D., Knecht, D. A. Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).
  24. Dubin, M., Nellen, W. A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium. Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).
  25. de Hostos, E. L., et al. Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility. Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).
  26. Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium. Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).
  27. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  28. Rosengarten, R. D., et al. Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum. BMC Genomics. 16, 294 (2015).
  29. Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).
  30. Gebbie, L., et al. Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).
  31. Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).

Tags

Genetik fråga 143 Dictyostelium transfection knock-out inpressning extrachromosomal plasmider act5 överuttryck Kemotaxis motilitet macropinocytosis
Genteknik <em>Dictyostelium discoideum</em> celler baserat på urval och tillväxt på bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paschke, P., Knecht, D. A.,… More

Paschke, P., Knecht, D. A., Williams, T. D., Thomason, P. A., Insall, R. H., Chubb, J. R., Kay, R. R., Veltman, D. M. Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58981, doi:10.3791/58981 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter