Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58981
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3, 4,5, 1, 1
1MRC Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 3Cancer Research UK Beatson Institute Glasgow, 4MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 5Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Summary

Dictyostelium discoideum הוא אורגניזם מודל פופולרי ללמוד תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים, אנדוציטוזה ופיתוח. השירות של האורגניזם תלויה הכדאיות של הנדסה גנטית. כאן, אנו מציגים שיטות transfect תאים Dictyostelium discoideum להתגבר על המגבלות הקיימות של תאים culturing בתקשורת נוזלי.

Abstract

Dictyostelium discoideum הוא אורגניזם מודל מסקרן לחקר תהליכי התמיינות תאים במהלך הפיתוח, התא איתות ושאלות ביולוגיה תאית חשובים אחרים. בטכנולוגיות הזמינות לתמרן גנטית Dictyostelium תאים הם מפותח. Transfections יכול להתבצע באמצעות סמנים שונים לבחירה, סמן מחדש רכיבה על אופניים, כולל רקומבינציה הומולוגית מוטגנזה מכוונת insertional. זה נתמך על ידי הגנום המבואר היטב. עם זאת, גישות אלה ממוטבים עבור שורות תאים axenic גדל בתרבויות נוזלי, קשה להחיל על תאים פראי-סוג הלא-axenic, אשר ניזונים רק חיידקים. מוטציות הנוכחים זנים axenic להפריע Ras איתות, גרימת macropinocytosis מוגזמת הדרושים עבור האכלה, ולפגוע נדידת תאים, אשר מבלבל את הפרשנות של אותות וניסויים כימוטקסיס של זנים אלה. ניסיונות קודמות לתמרן גנטית התאים הלא-axenic יש חסרה ויעילות ההליכים הנדרשים ניסיוני מורכבים. פיתחנו פרוטוקול תרביות תאים פשוטים זה, בפעם הראשונה, מתגבר על מגבלות אלה. אלה סדרה של שיפורים גדולים גנטיקה מולקולרית Dictyostelium מאפשרים פראי-סוג התאים להיות מתומרן כמו זנים מעבדה סטנדרטיים. בנוסף היתרונות לימוד תהליכי איתות, תנועתיות תקינה, מוטציות לשבש צמיחה מבוססי macropinocytosis עכשיו ניתן לבודד בקלות. יתר על כן, שזרימת העבודה כולו תרביות תאים מאוד מואץ, עם תאים רקומביננטי, כי יכול להיווצר בתוך ימים ולא שבועות. יתרון נוסף הוא כי הגנטיקה המולקולרית עוד יותר ניתן לבצע עם פראי-סוג טרי מבודד Dictyostelium דגימות מן הסביבה. זה יכול לעזור כדי להרחיב את היקף גישות בשימוש באזורים אלה מחקר.

Introduction

הסוג Dictyostelium הם אדמת-המגורים אמבה חברתית הניזונים בעיקר חיידקים. להציב שלקרוא Amoebozoa, מספר רב של מינים היה מבודד זה ניתן לקבץ ארבע clades שונים1. המין Dictyostelium discoideum (discoideum ד) הפך אורגניזם מודל פופולרי ללמוד תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים ו- phagocytosis. כדי לשלוט לתקנן תנאים ניסיוני, axenic תא קווים פותחו מסוגלים לגדול מורכבים או מוגדר בינוני נוזלי בהיעדרו של חיידקים2. חשיבות מיוחדת Ax2, Ax3, Ax4 זנים, אשר היו כל שנוצרו בשנות ה-70, בסופו של דבר נגזר פרוע אחד לבודד NC43. כלים עבור הנדסה גנטית פותחו בזנים אלו axenic, וכתוצאה מכך הסתרה באמצעות הראשון שפורסם בשנת 19874,5. הפרוטוקולים היו נוספים שפותחו באופן מיטבי לשימוש תחת תנאים axenic6,7.

הסתגלות של פרוטוקולים אלה כדי פראי-סוג ד discoideum זנים שלא מסוגלים לגדול מרק נוזלי נוסו על ידי מספר מעבדות. עם זאת, זה לא הפך לגמרי מוצלח מאז הפרוטוקולים תרביות תאים מורכבים, חוסר יעילות, בין היתר בשל הקיבולת של החיידק לפעול כמו כיור עבור ריאגנטים סלקטיבי8,9. כתוצאה מכך, נתונים למעשה כל מולקולרית ד discoideum נובע צאצאי בידוד פראי-סוג יחיד. רצינו להתגבר על מגבלה זו ולפתח שיטה גנטית לשנות תאים discoideum ד עצמאית של היכולת שלהם גדלים במדיום נוזלי. ניתן להסביר את הצורך של השיטה על ידי התצפית כי היא ההנחה היתה בעבר מוטציות המאפשר צמיחה axenic היו בעיקר נייטרלי, לא לפגום פיזיולוגיה של התא. סברה נכונה רק בחלקה. באופן כללי, יש שני הבדלים בולטים; ראשית, בין השונה בודדו זנים axenic, ושנית, כאשר אלה זנים axenic לעומת מבודד פרא-axenic8,9.

אולי הגורם הקריטי ביותר הוא מפתח axenic הגן, גרזןB, שזוהה לאחרונה כמו RasGAP NF1. הפונקציה העיקרית של NF1 בתור RasGAP הוא לרסן את הפעילות ראס3. המחיקה של האנזים ב כל זני axenic מוביל עודף פעילות ראס בא לידי ביטוי בכינויו היווצרות של טלאים גדולים ראס הפעיל. הטלאים ראס מוגדלת לגרום להצטברות של PIP3 קרום הפלזמה. אלה כתמים המופיעים מקרי של PIP3 וראס פעיל הם תבנית להיווצרות קפלים מעגלית בסופו של דבר נסגר, מוביל את היווצרות של macropinosomes10. התוצאה היא עלייה מוגזמת macropinocytic פעילות. Macropinocytosis הוא תהליך מונחה אקטין. תחרות cytoskeletal מרכיבי היווצרות של macropinosomes או pseudopods היא התוצאה. השפעתה על התנהגות תא באה לידי ביטוי כמעט מוחלט למניעת כימוטקסיס של תאי צמח חומצה פולית11. המדבקות PIP3 מוגדל מסיבית הן מאוד עקשן. אפילו בתאים מורעבים, המדבקות PIP3 נשארים, יכול להתפרש בטעות כשייך pseudopods, אשר יכול לגרום לבעיות לפרש מחקרים על כימוטקסיס למחנה.

במקרים מסוימים, המוטציה NF1 שימושית השפעול. זה מוביל אותנו מניע השני לפיתוח שיטה תקנים עבור מבוגר bacterially discoideum ד תאים, מאז העלייה בשיעור macropinocytosis הופך תאים axenic יקר עבור חוקרים ההיבטים הבסיסיים של תהליך זה,12 . עם זאת, מוטציה בגנים הדרושים עבור macropinocytosis, כגון Ras ו- PI3-kinases10, יש כמעט ביטל צמיחה axenic, ולכן יש צורך לתפעל את התאים האלה דרך גידול על חיידקים. סיבה נוספת שמעבדת המבוססת על חיידקים transfections יקר היא השימוש הגובר Dictyostelids לחקור שאלות באבולוציה של13,cellularity מרובה14,15,זיהוי משפחה16, התנהגות הסלולר אלטרואיסטי, אשר תלויים בעיקר השימוש פראי-סוג טרי מבודד מבודד17. כל הזכיר שטחי מחקר ניתן להקל על ידי שיטות יעילות עבור הנדסה גנטית של מבודד פרא, אשר אי-axenic לא צומחים בתוך מרק נוזלי.

הפרוטוקולים שלנו מאפשרים להתגבר על המגבלות המתואר. יחדיו, את האפשרות של ביצוע מניפולציות גנטיות עם בקטריאלי גדל discoideum ד תאים חסימות הטבות עבור כל החוקרים Dictyostelium , אפילו אם זה רק מהירות מוגברת של תהליך הבחירה בשל מהר יותר הצמיחה של אמבה (4 שעות זמן ההכפלה) על חיידקים לעומת צמיחה בתקשורת axenic (10 h הכפלת זמן).

Protocol

1. הכנת תאים וחומרים

  1. הכנת מאגר SorMC
    1. הכן 100 מ של 100 x SorMC (מאגר סורנסן כולל MgCl2 CaCl2) מאגר על ידי המסת 20.36 g של ח'2PO4 (15 מ מ) ו- g 5.47 נה2HPO4·7 H2O (2 מ מ) ב- 100 מ של ddH2O מים. מערבבים את הפתרון בטמפרטורת החדר (RT) ולהביא את אמצעי האחסון 100 מ ב- dH2O.
      הערה: המאגר וכתוצאה מכך יש pH של 6 והוא אינו חייב עוד יותר התאמת.
    2. לייצר 1000 מ ל 1 x עובד פתרון ב- ddH2O. להוסיף 50 µL כל של MgCl2 CaCl2 כדי להשיג ריכוזים הסופי של 50 מיקרומטר. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
      הערה: תמיד מוסיפים MgCl2 CaCl2 אל המאגר 1 x כדי להימנע משקעים של המלחים 100 x פתרון מניות.
    3. לחלופין, להכין KK2 מאגר (2.2 גר'2פו ח'4 ו- 0.7 g K2HPO4 1 ליטר של המאגר) בתוספת 50 מיקרומטר MgCl2 ו- 50 מיקרומטר CaCl2 (המכונה בזאת KK2MC). השתמש המאגר ברחבי במקום SorMC.
  2. הכנה של חיידקים כמקור מזון discoideum ד
    1. השתמש מושבה בודדת של ק' aerogenes , לחסן L 1 LB-בינוני (lysogeny מרק). השתמש בקבוקון 2 ל'. תן חיידקים לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-220 סל"ד.
      הערה: אם נדרשות כמויות גדולות של חיידקים, להשתמש במדיה עשירה יותר כמו 2xTY (שמרים לחלץ טריפטון בינוני) או בכי (מרק סופר אופטימלית) במקום ליברות. למקרה השימוש של חיידקים ק' aerogenes אסורה בשל מגבלות בטיחות, ניתן להשתמש במקום זאת BL21 e. coli .
    2. לקצור את התאים למחרת על ידי מסובב אותם למטה שני צינורות צנטריפוגה 500 מ"ל ב x ~ 6,600 g לחיידקים שטיפת מינימלית 20 פעם אחת עם 500 מ"ל SorMC מאגר.
    3. Resuspend בגדר ב- 20 מ של SorMC. בדוק את יתר600 (צפיפות אופטית על 600 ננומטר) באמצעות photometer של. לדלל עם המאגר אותו יתר600 של סביב 100.
      הערה: Aerogenes ק. חיידקים הם שקשה גלולה, אז במהירות יחסית גבוהה עבור מסתובב למטה החיידקים יש צורך למנוע אובדן של מזון חיידקים. הפתרון שיתקבל מניות חיידקי ניתן לאחסן עד 4 חודשים במקרר ב 4 ° C ולתחזק את השירות שלה כמקור מזון עבור discoideum ד. 1 ליטר של לילה ההשעיה ק' aerogenes גדל LB בינוני בדרך כלל מניבה 20 מיליליטר יתר600 של סביב 100.
      התראה: כדי להבטיח כי החיידק מוכן גידולי תעשייה של ק' aerogenes, לבצע את כל הצעדים ברדס.
  3. הכנת מאגר אלקטרופורציה H40
    1. להכין 100 מ של בופר, להמיס 0.952 גר' HEPES במים2O ddH ולהוסיף µL 100 MgCl2 פתרון 1 מ' מניות. להתאים את ה-pH 7 באמצעות קו עבור טיטור. לעקר את המאגר באמצעות מיקרומטר 0.22 מסנן או אוטוקלב. השתמש HEPES חומצה חינם לא מלח נתרן.
  4. לבצע הכנה פלסמיד ע פ הפרוטוקול של היצרן ושימוש ערכות לסכם את הטבלה של חומרים. השתמש את פלסמידים מסוכמים בטבלה1.
    הערה: האיכות של ה-DNA משמש תרביות תאים היא קריטית. הבחירה של transfectants discoideum ד גוברת על חיידקים יש דרישות ספציפיות של היזמים נהיגה בקלטת בחירה וביטוי (ראה דיון).
פלסמיד שם התנגדות/בחירה של חיידקים התנגדות/בחירה ב- Dictyostelium תג
הביטוי extrachromosomal פלסמידים
pDM1203 Ampicilin G418 לא
pDM1207 Ampicilin G418 N-מסוף GFP
pDM1208 Ampicilin G418 MCherry N-מסוף
pPI159 Ampicilin G418 MNeon N-מסוף
pPI437 Ampicilin G418 MScarlet N-מסוף
pPI54 Ampicilin G418 MTurquoise2 N-מסוף
pDM1209 Ampicilin G418 C-מסוף GFP
pDM1210 Ampicilin G418 MCherry ג-טרמינל
pPI143 Ampicilin G418 MNeon ג-טרמינל
pPI459 Ampicilin G418 MScarlet ג-טרמינל
pPI142 Ampicilin G418 MTurquoise2 ג-טרמינל
הסעות פלסמידים
pDM344 Ampicilin לא לא
pDM1019 Ampicilin לא N-מסוף GFP
pDM1018 Ampicilin לא MCherry N-מסוף
pPI152 Ampicilin לא MNeon N-מסוף
pPI418 Ampicilin לא MScarlet N-מסוף
pPI150 Ampicilin לא MTurquoise2 N-מסוף
pDM1021 Ampicilin לא C-מסוף GFP
pDM1020 Ampicilin לא MCherry ג-טרמינל
pPI153 Ampicilin לא MNeon ג-טרמינל
pPI457 Ampicilin לא MScarlet ג-טרמינל
pPI151 Ampicilin לא MTurquoise2 ג-טרמינל
הביטוי extrachromosomal inducible פלסמידים
pDM1038 Ampicilin Hygromycin לא
pDM1047 Ampicilin Hygromycin N-מסוף GFP
pDM1046 Ampicilin Hygromycin MCherry N-מסוף
pPI450 Ampicilin Hygromycin MNeon N-מסוף
pPI452 Ampicilin Hygromycin MScarlet N-מסוף
pPI449 Ampicilin Hygromycin MTurquoise2 N-מסוף
pDM1049 Ampicilin Hygromycin C-מסוף GFP
pDM1048 Ampicilin Hygromycin MCherry ג-טרמינל
pPI470 Ampicilin Hygromycin MNeon ג-טרמינל
pPI460 Ampicilin Hygromycin MScarlet ג-טרמינל
pPI469 Ampicilin Hygromycin MTurquoise2 ג-טרמינל
act5 מבטחים מיקוד פלסמידים
pDM1501 Ampicilin Hygromycin לא
pDM1513 Ampicilin Hygromycin N-מסוף GFP
pDM1514 Ampicilin Hygromycin MCherry N-מסוף
pPI231 Ampicilin Hygromycin MNeon N-מסוף
pPI419 Ampicilin Hygromycin MScarlet N-מסוף
pPI228 Ampicilin Hygromycin MTurquoise2 N-מסוף
pDM1515 Ampicilin Hygromycin C-מסוף GFP
pDM1516 Ampicilin Hygromycin MCherry ג-טרמינל
pPI230 Ampicilin Hygromycin MNeon ג-טרמינל
pPI458 Ampicilin Hygromycin MScarlet ג-טרמינל
pPI229 Ampicilin Hygromycin MTurquoise2 ג-טרמינל
רמי ביטוי פלסמידים
pDM1220 Ampicilin Hygromycin לא
pDM1351 Ampicilin Hygromycin N-מסוף GFP
pDM1259 Ampicilin Hygromycin MCherry N-מסוף
pPI465 Ampicilin Hygromycin MNeon N-מסוף
pPI468 Ampicilin Hygromycin MScarlet N-מסוף
pPI466 Ampicilin Hygromycin MTurquoise2 N-מסוף
pDM1352 Ampicilin Hygromycin C-מסוף GFP
pDM1305 Ampicilin Hygromycin MCherry ג-טרמינל
pPI471 Ampicilin Hygromycin MNeon ג-טרמינל
pPI467 Ampicilin Hygromycin MScarlet ג-טרמינל
pPI472 Ampicilin Hygromycin MTurquoise2 ג-טרמינל
ממוקד מסגרת פלסמידים
pDM1355 Ampicilin Hygromycin C-מסוף GFP
pPI461 Ampicilin Hygromycin MCherry ג-טרמינל
pPI462 Ampicilin Hygromycin MNeon ג-טרמינל
pPI464 Ampicilin Hygromycin MScarlet ג-טרמינל
pPI463 Ampicilin Hygromycin MTurquoise2 ג-טרמינל
פלסמידים הנוק-אאוט
pDM1079 Ampicilin Blasticidin לא
pDM1080 Ampicilin Nourseothricin לא
pDM1081 Ampicilin Hygromycin לא
pDM1082 Ampicilin G418 לא
CRE ביטוי פלסמידים
pDM1483 Ampicilin Nourseothricin לא
pDM1489 Ampicilin Hygromycin לא
pDM1488 Ampicilin G418 לא

טבלה 1: רשימת פלסמיד עבור transfections axenic.

  1. הגדרת התאים Dictyostelium עבור תרביות תאים
    1. לגדול ק' aerogenes הנהרות במדיום SM (עשירות בינוני) לילה במלון RT. תרבויות ניתן לאחסן עד 2 שבועות ב 4 º C.
    2. להוסיף כ-400 µL של ההשעייה חיידקי על צלחת אגר SM (peptone 10 גרם/ליטר; שמרים לחלץ 1 g/L; גלוקוז 10 גרם/ליטר; ח'2PO4 1.9 g/L; K2HPO4 x 3 H2O, 1.3 g/L; MgSO4 נטול מים 0.49 g/L; 1.7% אגר) ולהתפשט באופן שווה. קח לולאה סטרילי, לחסן עם תאים Dictyostelium . מורחים את התאים בקצה אחד של הצלחת.
    3. דגירה את הצלחת ב 22 מעלות צלזיוס במשך יומיים להבטיח אזורי צמיחה גדול מספיק עבור תרביות תאים.
      הערה: עבור זנים Dictyostelium לא להפוך את אזורי צמיחה גדולה (למשל, Ax3, DH1 או JH10), או עבור ניסויים לא מנוסים, להשתמש ניקוי לוחות במקום. לשם כך, בצע את ההוראות בשלבים 1.5.4 כדי 1.5.6.
    4. קח לולאה סטרילי, לחסן עם תאים Dictyostelium (כ 2-4 x 105 תאים). להעביר את התאים µL 800 של צפופה ק' aerogenes ההשעיה בתאים SM. מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    5. העבר 400 µL, 200 µL, 100 µL ו- 50 µL על פלטות אגר SM טריים. להוסיף כל µL צלחת 400 של השעיה SM ק' aerogenes נוספים, נמרח בקלות, יבש.
    6. דגירה הלוחות ב 22 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים עד הלוחות הופכים לשקופים.
      הערה: בשל קצב צמיחה מהיר יותר שלהם, החיידק לייצר בתחילה מדשאה confluent, amoebae לאחר מכן "נקה" את הצלחת של החיידקים. הזמן הנדרש עבור תהליך זה יכול להשתנות בהתאם רקע המתח ואת היכולת של מוטציות בתאים גדלים על חיידקים.

2. תקנים של תאים Dictyostelium בהתבסס על הבחירה חיידקי

Figure 1
איור 1 : תהליך עבודה תרביות תאים שגודלו חיידקים תאים Dictyostelium . השלבים עבור תרביות תאים מפורטים כדלקמן. לגדל תאים discoideum ד על צלחת SM עם חיידקים ק' aerogenes (אדום). קציר תאים רק מהחזית האכלה (ירוק), הימנעות התאים כבר מפתחים (ירוק כהה). לשטוף את התאים ב- H40. Resuspend לתאים צפיפות הסופי של 2-4 x 107 תאים למ"ל. מערבבים התליה תא עם 1-2 µg של ה-DNA. להעביר את התערובת cuvette אלקטרופורציה ותאי דופק. העבר את התאים ישירות לאחר אלקטרופורציה מאכל עם SorMC וחיידקים. לאפשר את התאים להתאושש במשך 5 שעות לפני הוספת הסמן לבחירה. עבור extrachromosomal פלסמידים, הוסף את הבחירה ישירות לצלחת. Transfectants הם בדרך כלל גלויים לאחר ~ 2 ימים. עבור בונה ליניארית אשר מטרתם לשילוב יחיד לתוך הגנום, להגדיר שלושה דילולים כמצוין ולהוסיף את הבחירה. חיידקים נלקחים מן ה OD600 = פתרון 100 מניות. מערבבים היטב את הצינורות ולהעביר את התאים לוחות תרביות רקמה 96-ובכן שטוח התחתונה. השתמש שתי צלחות לכל דילול. פיפטה 150 µL תא השעיה בכל טוב. זה לוקח כ- 5 ימים עד מושבות חזק גלויים. הבארות אדום להראות דוגמה של הסכום הרגיל של תאים בהצלחה טרנספורמציה שהושג (לוח העליון שונה הפרסום הקודם22). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. כדי להכין צלחות עם השעיה ק' aerogenes , להוסיף 10 מ ל SorMC מאגר המכיל חיידקים ק' aerogenes צפיפות של יתר600 = 2 (להוסיף 200 µL של ה OD מוכן600 = 100 ק' aerogenes מניות פתרון הרצוי ריכוז חיידקים) לתוך 10 ס מ תרביות רקמה מטופלים פטרי.
    הערה: הצלחת הזו מאוחר יותר יש צורך לטפח את transfected תאים discoideum ד . לחלופין, ניתן להשתמש צלחת 6-ובכן רקמות-תרבות. במקרה של תרביות תאים של פלסמידים extrachromosomal, הצלחת 6-ובכן רקמות-תרבות יעיל יותר משאבים. השתמש מ 2 ל SorMC ק aerogenes (OD600 = 2) השעיה לכל טוב.
  2. הכנה של תאים Dictyostelium
    1. באמצעות לולאה חיסון חד פעמיות 10 µL, לגרד תאים אזורי צמיחה (כ 3 ס מ) של לוח תרבות (קצה האזור שנוקה) או ניקוי צלחת. העברת תאים לתוך צינור 1.5 mL המכיל 1 מ"ל של מאגר H40 קר כקרח.
      הערה: העיתוי של קציר תאים ניקוי לוחות חיוני. הסיכון של מניב חלקית לקצירת תשואות מוקדם מדי מעט מדי כמות תאים, במטע מגביר מאוחר פיתחו תאים.
    2. לשטוף את התאים על ידי ספינינג למטה למשך 2 דקות ב 1,000 x g או פלאש-ספינינג 2 s ב x 10,000 ג'י. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאים במאגר H40 כדי צפיפות הסופי של 2-4 x 107 תאים למ"ל. שמור את התאים קר במהלך ההליך כולו תרביות תאים. השתמש slurry קרח-מים כדי להבטיח מגע ישיר של צינורות, קרח.
  3. אלקטרופורציה
    1. להוסיף 100 µL של תאים צינור עם 1-2 µg של ה-DNA. מערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
    2. להעביר את התערובת תא/DNA cuvette אלקטרופורציה טרום מקורר (מרווח 2 מ מ).
    3. . דופק את התאים באמצעות ההגדרות הבאות כיכר-גל: 350 V, 8 מילי-שניות, פולסים 2 ו 1 s דופק מרווח.
      הערה: אל תוסיף יותר מ 2 µg של ה-DNA. סכומים גבוהים יותר הם רעילים לתאים ולהקטין תרביות תאים יעילות. סה כ הוסיף נפח ה-DNA לא יעלה על 5 µL.
    4. להעביר תאים מיד מוקדם יותר מוכן 10 ס צלחת פטרי עם ק' aerogenes SorMC ולאפשר את התאים להתאושש במשך 5 שעות.
      הערה: בדוק את התאים בצלוחית הפטרי תחת מיקרוסקופ הפוכה. התאים יופיעו עגול ישירות לאחר אלקטרופורציה אך יחזיר את צורתם amoeboid לאחר כ- 30 דקות, כאשר יש להם מספיק זמן כדי לצרף כראוי אל פני השטח.
  4. מבחר transfectants: תלוי אם תרביות תאים מיועדת ליצירת של הנוק-אאוט, טוק-in, או act5 טוק-in, או כדי לבטא חלבון כתב פלורסנט מ פלסמיד extrachromosomal, לבצע את תהליך הבחירה באחד להלן תיאר שיטות.
    הערה: בניגוד תאים בוגרים axenically, תאים bacterially מבוגר הם עמידים מאוד בפני blasticidin. בחירה, לכן, תמיד מתבצעת באמצעות G418 או hygromycin (ראה דיון).
    1. אאוט טוק, טוק-in ו act5 טוק-in
      1. לנתק את התאים בזהירות צלחת פטרי יכפו שוב ושוב את הנוזל מן פיפטה על גבי המשטח.
      2. הגדרת שלוש דילולים ההשעיה SorMC ק aerogenes (OD600 = 2) ולהוסיף את הסוכן סלקטיבי בהתאם ההתנגדות בשימוש (ראה איור 1).
      3. נמוך דילול: מערבבים 9 מ של השעיה תא עם 20.4 מ של SorMC ו- 600 µL של פתרון מניות ק' aerogenes .
      4. דילול בינוני: מערבבים µL 900 של השעיה תא עם mL 28.5 של SorMC ו- 600 µL של פתרון מניות ק' aerogenes .
      5. דילול גבוה: מערבבים µL 90 של השעיה תא עם mL. 29.3 של SorMC ו- 600 µL של פתרון מניות ק' aerogenes .
      6. להוסיף 30 µL של סמן לבחירה (100 x פתרון מניות).
      7. הפץ את דילולים מוכן תרביות רקמה 96-ובכן שטוח התחתונה לוחות pipetting µL 150 של השעיה תא לבאר כל.
        הערה: הליך זה נועד שיבוטים יחיד מסך מאשר אוכלוסיות. הבחירה לוקח בערך 5-7 ימים, בהתאם הבונה בשימוש.
    2. פלסמידים extrachromosomal
      1. הוספת הסמן לבחירה ישירות לצלחת 10 מ"ל (ראה איור 1).
        הערה: יש צורך להגדיר דילולים, מכיוון שאין שום רצון לאוכלוסיות המשובטים. תהליך הבחירה עבור פלסמידים extrachromosomal נובע מהר למספרים העתק גבוהה, נוכח בתאים discoideum ד . Transfectants ניתן לצפות לאחר 32 h כדי 2 ימים.
        התראה: אנטיביוטיקה משמש סמן לבחירה רעילים. ללבוש כפפות.
  5. מסך שיבוטים שהושג עבור tranfectants חיובי. עבור נסיונות מעלף או בטוק, בצע את ההוראות בשלב 2.5.1. בדוק להצלחה תקנים עבור פלסמידים extrachromosomal תוך שימוש בהוראות בשלב 2.5.2.
    1. אאוט. טוק, טוק-in של act5 טוק-in, לבצע את המסך הראשוני באמצעות PCR כדי לאשר שילוב הבונה לוקוס גנומית הנכון.
      הערה: כדי להגדיל את הסבירות של אוכלוסיות המשובטים, שימוש אפשרי דילול הגבוהה ביותר המניבה transfectants לאחר הבחירה. המטרה עבור הצלחות כי הם מקסימום שליש בארות הכבושה.
      1. כדי להרחיב את אוכלוסיות המשובטים, העברה שיבוטים שצמחו לאחר הבחירה מהצלחת 96-ובכן-תרביות רקמה לתוך צלחת 12-ובכן רקמות-תרבות לגדול מספיק תאים עבור הבידוד של דנ א גנומי. לספק כל טוב עם 1 מ ל SorMC ק aerogenes (OD600 = 2) וסמן לבחירה טריים.
        הערה: 1 יום מספיקה בדרך כלל לקבל confluent מתאים היטב עבור בידוד של דנ א.
      2. כדי לבצע מיני בידוד דנ א גנומי, לקצור תאי של באר confluent ובידוד הדנ א באמצעות ערכת חילוץ DNA מיני ההוראות של היצרן.
      3. ה-DNA גנומי מבודד יחד עם תחל מתאימים ולהשתמש Taq-פולימראז (ראה טבלה של חומרים) עבור integrands חיובי מסך ה-PCR.
        הערה: לאחר אישור של השתלבות חיובית מיקומה גנומית נכונה, לבצע ניתוח תספיג דנ א. הדבר מבטיח ביטחון רב יותר לא התרחשו אירועים נוספים ההכנסה באזורים גנומית לא ספציפי.
    2. כתב פלורסנט חלבונים, חזותית לזהות תאים פלורסנט חיובי, לבדוק עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. לחלופין, לבצע את תספיג חלבון עם נוגדנים מתאימים לזיהוי הביוכימי.
תוכנית ה-PCR
שלב טמפרטורה זמן
דנטורציה הראשונית 94 ° C 30 s
מחזורים 94 ° C 15-30 s
42 ° C 15-60 s
68 מעלות צלזיוס 1 דקות/kb
סיומת הסופי 68 מעלות צלזיוס 5 דקות
. תחזיק 4-10 ° C
תגובת הרכב
רכיב תגובה 25 μL ריכוז סופי
פריימר לפנים 10 מיקרומטר 0.5 ΜL 0.2 ΜM
פריימר הפוכה 10 מיקרומטר 0.5 ΜL 0.2 ΜM
תבנית ה-DNA משתנה (ca. 5 µL) < 1,000 ng
2 x מיקס מאסטר עם מאגר סטנדרטי כולל פולימראז (ראה טבלה של חומרים) 12.5 ΜL 1 x
נוקלאז ללא מים כדי 25 µL < 1,000 ng

בטבלה 2: קומפוזיציה התוכנית, דוגמת ה-PCR עבור ההגברה של Discoideum ד הדנ א.

Representative Results

פלסמידים extrachromosomal משמשים כתב מחקרים, אשר שואפים לזהות הלוקליזציה של חלבונים מסוימים בתוך תא או שינויי המבנה התאי של תאים מוטציה. עבור גישות רבות, כגון ניטור של מחזור התא, זה הכרחי להביע את שני הכתבים באותו זמן. . זה עכשיו אפשרי באמצעות מערכת פלסמיד extrachromosomal שלנו כתב כפול (טבלה 1). יום 1, התאים היו transfected לפני הוספת הסמן לבחירה G418 לאחר 5 שעות (איור 1). לדוגמה, NC4, DdB, Ax2 ו מבודד פראי נגזר באופן עצמאי V12M2 ו- WS2162 (משלים טבלה 1) היו transfected עם pPI289 פלסמיד, שמקודד עבור GFP-TubulinA, סמן microtubules, mCherry-PCNA, חלבון זה משמש לניטור מחזור התא (איור 2א). לאחר 32 h, נצפו התאים במיקרוסקופ. הרוב המכריע של תאי ביטא שני חלבונים פיוז'ן התווית על-ידי פלורסנט, עקבי עם הקודם דוחות את הביטוי הזה של שני עיתונאים מכל לאותו פלסמיד מראה דומה הביטוי רמות, וזה כמעט בלתי אפשרי בעת שימוש בשני פלסמידים שונים 18,19. תא נציג עבור כל קו תא (NC4, DdB, Ax2, V12M2 ו WS2162) המבטאת הכתב כפול הרצוי מוצגת באיור 2B. היעילות תרביות תאים מסוכמות באיור2 ג. שורות תאים נגזר NC4 להראות את היעילות תרביות תאים הטוב ביותר. עם זאת, עבור שורות תאים V12M2 ו- WS2162, מספר גבוה במידה ניכרת של transfectants היה מתקבל.

Figure 2
איור 2 : ביטוי פלסמיד extrachromosomal. (א) Extrachromosomal פלסמידים הן ישירות transfected בצורה מעגלית. כדוגמה, pPI289 כתב כפול מוצג. האתרים MIV העמותותמצביעות על ההכנסה של הכתבת השנייה לתוך פלסמיד הביטוי extrachromosomal. (B) Z-ההקרנה של תא נציג לבטא GFP-TubulinA (cytoplasmic) ו- mCherry-PCNA (בעיקר גרעינית) עבור חמישה תאים פראי-סוג שונות קווים המשמשים (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) תרביות תאים יעילות עבור שורות תאים חמש בתמונה (ב') חושבו. המוצג הוא הממוצע של שני ניסויים. קווי שגיאה לציין ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

השתלבותם של הווקטור מיקוד לוקוס גנומית שצוין הוא יותר מאתגרת ודורשת ניתוח זהיר יותר של קו התא שנוצר. איור 3, נעשה ניסיון של act5- mCherry "קי" NC4. ראשית, פלסמיד חייב להיות לליניארית להגדיל את תדירות אירועי רקומבינציה. בעקבות תרביות תאים. בשביל זה, pDM1514 פלסמיד נחתך עם העמותותMIV. שתי להקות מתקבלים לאחר שהתמודדו digest ג'ל agarose. הלהקה 4127 bp מכיל הבונה הרצוי (איור 3). תרביות תאים, ה-DNA מתעכל חייב להיות מופק הג'ל, לטהר על-ידי ערכת חילוץ ג'ל ההוראות של היצרן.

Figure 3
איור 3 : הכנת act5 טוק-ב, ה-DNA על תרביות תאים. דוגמה של השימוש של תוספת פועלים5 לדפוק pDM1514 פלסמיד מוצג. השלבים להכנה מפורטים כדלקמן. (א) לפני אלקטרופורציה, linearize את פלסמיד באמצעות האתרים MIV המצוין של העמותות. (ב, ג) להפעיל את פלסמיד לחתוך על ג'ל agarose עד שתי הלהקות הצפוי מופרדים כראוי. לגזור את הלהקה bp 4127 המכיל הזרועות רקומבינציה, mCherry וההתנגדות-הקלטת, ג'ל לחלץ את ה-DNA. ה-DNA מוכן כעת על תרביות תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ה-DNA מטוהרים שימש תרביות תאים של תאי NC4. אחרי 5-6 ימי בחירה, התקבלו שיבוטים. תרביות תאים נציג היעילות ואת כמות חיובית שיבוטים מזוהה עבור מספר act5 טוק-אין נסיונות מסוכמים בטבלה3. שני שכפולים של תרביות תאים NC4 באופן אקראי, וכיום נותחו על ידי ה-PCR (איור 4א), והראתה שני הדפוסים הלהקה החזוי הצפוי של יישום טוק-in ואומת היו עוד יותר עם ניתוח תספיג דנ א כדי להבטיח שילוב יחיד אירוע של הבונה לתוך הגנום20. האבן החשופה מציג שילוב יחיד ברור מיקומה הרצוי act5 (איור 4B). הקו תא NC4::act5-mCherry שנוצר כעת ניתן להשתמש בניסויים.

Figure 4
איור 4 : אימות של act5- mCherry KIs ב- NC4. (א) הערכה ובקרה מותני לשם האימות של שילובי חיובי לתוך לוקוס act5 . צבעי בסיס המצוין שימשו כדי לנתח שני שכפולים עצמאית ועל ההורה. שני שכפולים להראות הלהקות הצפוי של התנגדות-מגרות, במורד הזרם (P1) או פריימר נגד הזרם (P2), אשר אינם נוכח המתח הורים. השילוב פריימר (P1/P2) מאשרת את השילוב הנכון של קלטת mCherry והתנגדות לתוך מיקומה act5 . NC4 פראי-סוג מראה הלהקה bp 2800 הצפויה, בעוד שני שכפולים קי חוסר הלהקה הזאת ולהציג במקום מוצר ה-PCR על 1400 בסיסים גדולים יותר. סכימת (B) כדי להפוך את תקציר הגבלה בשימוש תספיג דנ א. שני שכפולים טוק-in הראה הלהקה bp 3400 קטנים יותר, אשר הוא התוצאה של שילוב הבונה לוקוס פועלים5, במיוחד נוספים Bclאני לאתר הקלטת ההתנגדות hygromycin. פראי-סוג הפקד מציג kb 5.8 צפויות הנובעות שני ממוקם במורד הזרם Bclאני אתרים. האבן החשופה שנחתכו, משולבים עבור בהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לבנות יישוב לתוך מיקומה act5 פלסמיד שם מספר בארות כבוש מספר שיבוטים בדק שיבוטים חיובי שיבוטים הנכון (%) זן Dictyostelium בשימוש תרביות תאים יעילות (transfectants / עונה 2 פרק 10 ^ 6/1 µg DNA)
LifeAct-mCherry pPI226 7 7 1 14.2 AX2 3.5 x 10 ^-6
LifeAct-GFP pPI227 12 12 5 41.6 AX2 6 x 10 ^-6
GFP pDM1513 3 3 2 66.6 AX2 1.5 x 10 ^-6
mCherry pDM1514 3 3 1 33.3 AX2 1.5 x 10 ^-6
GFP pDM1513 66 9 5 55.5 AX2 3.3 x 10 ^-5
mCherry pDM1514 221 12 10 83.3 AX2 1.1 x 10 ^-4
ויזת עבודה H2B-mCherry pPI420 3 3 1 33.3 AX2 1.5 x 10 ^-6
ויזת עבודה H2B-mCherry pPI420 7 7 6 85.7 AX2 3.5 x 10 ^-6
mCherry pDM1514 10 10 7 70 DdB 5 x 10 ^-6
mCherry pDM1514 240 12 11 91.6 DdB 1.2 x 10 ^-4
mCherry pDM1514 320 12 12 100 NC4 1.6 x 10 ^-4

טבלה 3: תקנים היעילות ואת הכמות השיג transfectants חיובי עבור הדור של act5 KIs ברקעים זן שונה 22 .

מיקומה פועלים5 מציע ביטוי יחסית הומוגנית של הכתב משולבת21. התאים NC4::act5-mCherry שנוצר אפשר לערבב ניסויים כדי לבצע עם act5 טוק-in אחרים באמצעות חלבון שונה פלורסנט כגון ה-GFP. כדי להדגיש את היתרון הגדול של שיטה זו, מוצגים ניסויים ערבוב עם Ax2::act5-GFP . בשל חוסר היכולת transfect-axenic פראי-סוג תאים, סוג זה של גישה לא ניתן היה לבצע קודם. מיקס ניסויים הם כלי חשוב לנתח בהתנהגות התא, כי הם מאפשרים השוואה ישירה בין שורות תאים שונים חווה ניסיונית בתנאים זהים. NC4 תאים גדלים מהר יותר על מדשאות חיידקי מאשר Ax2 תאים (איור 5א). זה יכול להיות בגלל קיבולת גבוהה יותר כדי phagocytose חיידקים או שיפור היכולת להעביר ולהראות כימוטקסיס לכיוון מקור מזון. שימוש assay כימוטקסיס של חומצה פולית תת אגר, השוואה ישירה של אוכלוסייה של NC4::act5-mCherry ו- Ax2::act5-GFP בוצעה, מראה כי NC4::act5-mCherry הם הרבה יותר יעיל בחומצה פולית חישה. לאחר 4 שעות, יותר תאים NC4::act5-mCherry היו מסוגלים לזחול מתחת agarose מ- Ax2::act5-GFP תאים (איור 5B). ניתוח מדדים סטנדרטיים של כימוטקסיס עבור התאים נודדים תחת agarose גילה כי תאים NC4::act5-mCherry היו יותר מהר, הראו תגובה חזקה יותר chemotactic מאשר Ax2::act5-GFP תאים (איור 5C-E ).

Figure 5
איור 5 : שימוש פועלים5 קילו לניסויים מיקס כימוטקסיס מבוססת תמונה. (א) NC4::act5-mCherry , Ax2::act5-GFP המביעות החלבון הניאון המצוין מ מיקומה פועלים5 נותחו על היכולת לגדול על הדשא חיידקי. אחרי ארבעה ימים, נמדדו הקוטר פלאק שהתעוררו כתוצאה תאי Dictyostelium מצופה בידוד. Non-axenic act5:: NC4 תאים להפוך הפלאק גדול יותר באופן משמעותי מאשר תאים Ax2::act5-GFP axenic (זאת אומרת ± SD, * * * 0.0001 < p, n = 3, גודל בר 5 מ מ). (B) עבור השימוש כימוטקסיס חומצה פולית תחת-agarose assay22 להשוות ישירות את היכולות chemotactic של NC4::act5-mCherry , Ax2::act5-GFP בשימוש (א), חיידקים-גדל amoebae של שני זנים מעורבים על יחס 50: 50. תאים הורשו לזחול מתחת agarose. לאחר 4 שעות, התאים היו מעביר את המילוי ההדרגתי חומצה פולית היו עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. לאחר מכן נקבע את מספר תאי NC4::act5-mCherry ו- Ax2::act5-GFP . תאים NC4::act5-mCherry היו יותר יעיל בהערכת חישה חומצה פולית. על יותר 10-fold NC4::act5-mCherry נמצאו תאים בהשוואה Ax2::act5-GFP תאים (זאת אומרת ± SD, * * * 0.0001 < p, n = 6, סולם בר 100 מיקרומטר). (C, D) התאים צולמו במשך 60 דקות, אינדקס chemotactic ומהירות שלהם חושבו. לאחר מיון מוקדם של התאים מגיבים ביותר chemotactically (רק אלה אשר נדד תחת agarose), Ax2::act5-GFP תאים הראה ערכים נמוכים יותר עבור מהירות התא והן כימוטקסיס. תאים חמישים לשורה תא נותחו. (חציון ± SD, * 0.01 < p, n = 3). (E) הרצועות של NC4::act5-mCherry , Ax2::act5-GFPact5 טוק-in מותוות מעל 60 דקות, מציג את התנועה מכוונת יותר לכיוון המקור chemoattractent של תאי NC4::act5-mCherry (חציון ± SD, * * * 0.0001 < p, n = 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הקווים טוק-in תא act5 יכול לשמש גם עבור cytometry זרימה. כמו עם גידול על חיידקים, ישנם הבדלים מהותיים בהתפתחות בין זנים axenic בר-axenic-סוגים. לאחר פיתוח, הגופים fruiting NC4 תאים גדולים כ פעמיים כמו אלה נגזרים מתאי Ax2. אם התאים מעורבבים, גוף fruiting בגודל ביניים מתקבל. כדי לנתח את התרומה של שני הקווים תא יותר באופן כמותי, שימש cytometry זרימה. ניתוחים אלה הראו בבירור כי הגופים fruiting בגודל בינוני בשל רמות שונות של התרומה של שתי שורות תאים. בזמן NC4::act5-mCherry תאים מורכב על 75% של נבגים נמדד, Ax2::act5-GFP תרם רק 25%, חושף יתרון כושר פוטנציאליים עבור זנים שאינם axenic (איור 6). מאז הניתוח אינו מפקח על האוכלוסייה תא ' גבעול ', קיימות שתי אפשרויות להסביר את חוסר האיזון בהתפתחות בין Ax2 NC4. אפשרות אחת היא כי תאים Ax2 לתרום בעיקר האוכלוסייה תא ' גבעול ', ולא נכנס האוכלוסייה תא נבג. לחלופין, יותר NC4 תאים רשאים להיכנס מחזור התפתחותית, עם Ax2 יחסית מושהית, והם כתוצאה מכך אין אפשרות לתרום מכלול של גוף fruiting. האפשרות transfect-axenic פראי-סוג תאים נוספים מפתחת גישות אחרות, מפשטת במידה ניכרת את הליכי ניסיוני.

Figure 6
איור 6: מעשה5 קילו לאפשר ניתוח של מיקס ניסויים באמצעות cytometry זרימה. (א) NC4::act5-mCherry ו- Ax2::act5-GFP פותחו בנפרד או בתערובת 50: 50 על פלטות אגר שאינם התזונתי. תאים NC4::act5-mCherry טופס גופות fruiting גדול יותר מאשר Ax2::act5-GFP. המיקס במקום מראה את גודל ביניים של (גודל בר 5 מ מ). מיקרוסקופ אור זריחה קונאפוקלית מרמזת על סכום גבוה יותר של NC4::act5-mCherry נבגים בראשיהם נבג נגזר מתערבב. (B) לכמת התבוננות זו, הכמויות של נבגים ב נבג שנקטפו ראשי מן הניסוי ערבוב ב (א) נותחו על ידי cytometry זרימה. כ-75% מתוך הנבגים שמקורם תאים NC4::act5-mCherry , רק ב-25% מתאי Ax2::act5-GFP . (ג) הפצה נציג של נבגים של שני הקווים התא המוצג פיזור cytometry זרימה. כ- 0.05% להראות חיובי mCherry ו- GFP אותות, מציע פיוז'ן parasexual תהליכים התרחשו או נבגי דבוקים אחד לשני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תא קו רקע גנטית מספר סימוכין פורסם לפני סוג
AX2 (קה) DBS0235521 בלומפילד et al., 2008 פראי סוג
NC4 (S) בלומפילד et al., 2008 פראי סוג
act5::mCherry 5 שיבוט NC4 HM1912 Paschke et al., 2018 act5 טוק-
act5::GFP גומי 2 AX2 HM1930 Paschke et al., 2018 act5 טוק-
V12M2 בלומפילד et al., 2008 פראי סוג
WS2162 בלומפילד et al., 2008 פראי סוג

משלים טבלה 1: זנים שונים של Dictyostelium למד.

Discussion

השימוש הלא-axenic, פראי-סוג תאים Dictyostelium הוגבלה מאוד עד כה במחקר מולקולרי. השיטות הזמינות עבור הנדסה גנטית זנים אלה יש חסר אמינות, יעילות23, מניעת אימוץ כללי שלהם. החומרים המופקים והפרוטוקולים המובאת כאן יכול לשמש עבור כל זן discoideum ד עצמאית של יכולתו לגדול במדיום נוזלי. יצוין, כי פרוטוקול זה ממוטב עבור שורות תאים נגזר NC4. תרביות תאים יעילות עבור זנים טרי מבודד מן הטבע נבדלים NC4, כאשר הבחינו לפני מוצגות כאן8,V12M2, WS21629. התנאים אלקטרופורציה נראה בפרט יש השפעה ניכרת על היעילות תרביות תאים, מחייבים נוספים מיטוב עבור זנים מסוימים. באופן כללי, כמות מספקת של transfectants נצפו כל זני נבדקו עד כה, מראה כי שיטות אלה הם מעשי. מספר חיובי transfectants תוך שימוש NC4-derived זנים הוא גבוה יותר בהשוואה זנים אחרים-פראי-סוג הלא-axenic, אך בכל המקרים, מספר מספיק של transfectants מתקבלים כדי לאפשר לניסויים נוספים. זה, וגם את הפשטות של הפרוטוקול שלנו הוא שיפור משמעותי לעומת ניסיונות קודמת8,9.

פרוטוקולים אלה שאינם axenic חדש לכסות את כל נהלי גנטי ולהוסיף יתרונות נוספים, כיוון transfections יכול להתבצע במהירות וביעילות במקביל. ניתן להשיג שיבוטים חיובית בתוך ימים ולא שבועות, מאז גידול על חיידקים חצאים הזמן החטיבה. פלסמידים שהוקם גם לעבוד תחת התנאים axenic, יכול להיות בשימוש שגרתי תחת שני תנאים צמיחה, וזה עוד לקידום הזה methology22. כפי הוצג הפרוטוקול, פלסמיד משמש בחירה על חיידקים יש דרישות מיוחדות, חיוניות להצלחת תרביות תאים. בפרט, היזמים נהיגה הקלטות הביטוי והתנגדות חשובים עבור תקנים מוצלחת. יזם שמרבים להשתמש בו act6 (אקטין 6)24 נהיגה הקלטות התנגדות או ביטוי חסר יעילות כאשר התאים גדלים על חיידקים. במערכת שלנו פלסמיד, האמרגן פעיל ביותר act15 (אקטין 15) כונני קלטות כל ביטוי, בזמן הקלטות ההתנגדות נמצאים תחת השליטה של מקדם coA (coactosin A), שניהם אשר פעילים תחת תנאים axenic תאים גדל על חיידקים. דרישות עבור הביטוי של הכתב בונה כמו גם בטוק, הנוק-אאוט בונה את הצורך להשתמש הרפרטואר שלנו פלסמיד, אך למרבה הצער מגביל את השימוש וקטורים כבר יצרת שימוש זה האמרגן לא יעיל act6 .

מקדם היעילות הם קריטיים במיוחד עבור transfections תלויים אירוע יחיד אינטגרציה לתוך מיקומה גנומית הנכון. עקב השיפור שלנו של היזמים נהיגה בביטוי הגן ההתנגדות, מספיק חלבונים ההתנגדות מופק שילובים לוקוס בודד. הדאגה העיקרית הייתה העדפה של שילובי מרובים לתוך הגנום בעת שימוש hygromycin או G418 כמתואר. אין העדפה של שילובי מרובים נצפתה כה, כפי שדווח בעבר עבור בחירות G418 בעזרת מבוגר המקדם מערכות25. משמעות הדבר היא כי הן hygromycin ו- G418 הם סמנים לבחירה מתאימה לדור של נקי שירותי. טוק, טוק-חברה למרבה הצער, blasticidin סמן לבחירה לא עובד בתנאים שאינם axenic. זהו חיסרון גדול של השיטה שלנו, שכן בקלטת ההתנגדות blasticidin משמש באופן שגרתי כדי לייצר מעלף בונה ב discoideum ד. בונה זה נוצרו כבר עם קלטות ההתנגדות blasticidin צריך להיות rederived באמצעות אחד הסמנים ניתן לבחירה עביד. אפשרות אחרת כדי להתגבר על מגבלה זו היא לשלב את הוקמה לאחרונה axenic discoideum ד CRISPR טכנולוגיה עם פרוטוקול זה תרביות תאים26. הדור של המדריך מתאים, יחיד RNAs (sgRNAs) הוא פשוט יותר ומהירה יותר מאשר מחדש של המבנים הנוק-אאוט מוחלט. עבור כיוונים לעתיד, האפשרות של יצירת טוק מרובים-outs באמצעות CRISPR/Cas9 בשילוב עם פרוטוקול תרביות תאים זה מושך, עשוי לסלול את הדרך עבור חוקרים רבים בקהילה Dictyostelium . עם זאת, עבידות של המערכת הוקמה ביטוי ארעי משמש CRISPR/Cas9 axenic תאים בוגרים צריך בזהירות להיבדק.

Act5 טוק-אין המערכת הציג מציע מערכת אמינה ובטוחה אינטגרציה לדור של שורות תאים יציב ב discoideum ד, עם היתרון של אתרים דומים נוסדה בשנת אורגניזמים אחרים22. זה גם תלוי אירוע יחיד אינטגרציה הגנום, ומציע אפשרויות רבות עבור כיווני מחקר שונים. יזם act5 פעילה בחום ומבטיחה ביטוי הומוגנית כמעט27 עצמאית של התנאים הטיפוח. ניתן לשלב חלבונים כתב פלורסנט בקלות לוקוס זה מבטחים באמצעות של פלסמידים מיקוד מהונדסים. אפשרות זו שימושית, לדוגמה, למטרות מעקב תא, כפי שמוצג כאן ניסוי מיקס. התאים מראים השתנות מינימלית-לתא ביטוי, אשר יכול לסייע בתא אוטומטי מעקב. חשוב, החדרת רצף הרצוי לתוך מיקומה פועלים5 מופיע phenotypically נייטרלית28,29. כמו הביטוי אינו תלוי בסמן לבחירה כדי לשמור על ביטוי חלבון, כפי שניתן לראות integrants אקראית או שורות תאים וקטור מניבי extrachromosomal, מערכת act5 יכול להיות שימושי עבור חילוץ ניסויים, כמו גם. מאז הקווים תא הומוגנית, ניתן לנתח כל התאים. . זה לא אפשרי באמצעות פלסמיד extrachromosomal של הביטוי, בהם יש הטרוגניות ניכר בביטוי.

בנוסף שיפורים כלליים אלה עבור כל זנים, היכולת להשתמש הלא-axenic פראי-סוג תאים למחקר מולקולרית מאפשרת הערכה של ההשפעות של מוטציות שהצטברו זנים מעבדה העדכני. Rearrangements גנטי מרובים נמצאה מאז האימוץ של המתח Ax2 בשנת 1970, כפי שמוצג על ידי microarray שפורסמו בעבר ניתוחים26. סינתטי פנוטיפים שנצפו עקב הנוכחות של מוטציות אלו. לדוגמה, מוטנט שדווחה phg2 מציג אדהזיה ירד רקע זן אחד של מעבדה והצמדות מוגברת עוד3. נתונים סותרים כאלה עכשיו הקרניו לחזור על הניסוי בנימה אב קדמון משותף (במקרה זה, DdB). הכוח של גישה זו הוכח לאחרונה עבור30,רז GTPase קטן31.

היכולת לבצע ניסויים גנטיים בתוך כל זן discoideum ד מרחיב את הפוטנציאל של כיווני מחקר חדשים שתלויים השימוש מבודד פראי, ובפרט אלה מעורבים אבולוציה חברתית ותרבותית, זיהוי משפחה, מיניות מחזור22.

Disclosures

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים תודה למעבדה קיי עבור קלט לשיטה זו LMB מיקרוסקופ לזרום cytometry במתקני לתמיכה מדעיים וטכניים מעולים. עבודה זו מומן על ידי המועצה למחקר רפואי מענק MC_U105115237 ר ר קיי, BBSRC (ביוטכנולוגיה, מחקר מדעי הביולוגיה המועצה) מענק BB/K009699/1 לקיי רבי רבי, לחקר הסרטן בבריטניה להעניק A15672 ר ה Insall, Wellcome אמון מלגת בכיר 202867/ת/16/Z ג'ונתן R צ'אב ולאחר MRC מימון (MC_U12266B) ליחידה אוניברסיטת LMCB MRC ב UCL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R ThermoScientific 05-400-002
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor ThermoScientific 12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers Sigma Aldrich EP6331000025
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules BioRad 1652660
Safety Cabinet Foruna - SCANLAF Labogene
BioPhotometer Plus Eppendorf
CLSM 710 Zeiss
Media & Agaroses
LoFlo Medium Formedium LF0501
Seakem GTG Agarose Lonza 50071
Low EEO Agarose BioGene 300-200
Purified Agar Oxoid LP0028
SM broth Formedium SMB0102
2x LB broth Formedium LBD0102
Chemicals
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoScientific S33102
1 Kb Plus DNA Ladder ThermoScientific 10787018
1 Kb DNA Ladder NEB N3232L
HEPES free acid Sigma Aldrich/Merck 391340 EMD
KH2PO4 VWR P/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2O VWR 10028-24-7
MgCl2 * 6 H2O Sigma Aldrich/Merck 5982 EMD
CaCl2 * 2 H2O Sigma Aldrich 442909
Folic Acid Sigma Aldrich F7876
KOH VWR 26668.263
Cultur Dishes
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3595
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3516
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 353003
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 MatTek Corporation P50G-1.5-30-F
Antibiotics
Geneticin G418-sulphate Gibco by Life Technologies 11811-023
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1
Additional Consumables
2 mm gap electroporation cuvettes, long electrode Geneflow Limited E6-0062
10 µL Inoculating Loop, Blue 10 Micro L ThermoScientific 129399
Spreader, L-shaped, sterile greiner bio-one 730190
Combitips advanced 5 mL Eppendorf BIOPUR 30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep Classic Zymoresearch D4016
Quick DNA Miniprep Kit Zymoresearch D3025
Zymoclean DNA Recovery Kit Zymoresearch D40002
Enzymes
Restriction enzymes NEB
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer NEB M0482L
T4 DNA Ligase NEB M0202S
PrimeSTAR Max DNA Polymerase TakaraBio R045A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schaap, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum. Development. 138 (3), 387-396 (2011).
  2. Sussman, R., Sussman, M. Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).
  3. Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).
  4. Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein. The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).
  5. De Lozanne, A., Spudich, J. A. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination. Science. 236, 1086-1091 (1987).
  6. Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum. Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).
  7. Knecht, D., Pang, K. M. Electroporation of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).
  8. Wetterauer, B., et al. Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene. Plasmid. 36, 169-181 (1996).
  9. Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains. Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).
  10. Bloomfield, G., et al. Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium. eLife. 4, (2015).
  11. Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. eLife. 5, (2016).
  12. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).
  13. Hoeller, O., Kay, R. R. Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients. Current Biology. 17, 813-817 (2007).
  14. Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement. Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).
  15. Schaap, P., et al. Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas. Science. 314, 661-663 (2006).
  16. Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).
  17. Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes. Science. 333 (6041), 467-470 (2011).
  18. Strassmann, J. E., Queller, D. C. Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).
  19. Wolf, J. B., et al. Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success. Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).
  20. Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).
  21. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).
  22. Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).
  23. Woznica, D., Knecht, D. A. Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).
  24. Dubin, M., Nellen, W. A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium. Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).
  25. de Hostos, E. L., et al. Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility. Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).
  26. Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium. Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).
  27. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  28. Rosengarten, R. D., et al. Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum. BMC Genomics. 16, 294 (2015).
  29. Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).
  30. Gebbie, L., et al. Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).
  31. Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).

Tags

גנטיקה גיליון 143 Dictyostelium תרביות תאים מעלף בטוק פלסמידים extrachromosomal act5 ביטוי כימוטקסיס תנועתיות macropinocytosis
הנדסה גנטית של <em>Dictyostelium discoideum</em> תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paschke, P., Knecht, D. A.,… More

Paschke, P., Knecht, D. A., Williams, T. D., Thomason, P. A., Insall, R. H., Chubb, J. R., Kay, R. R., Veltman, D. M. Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58981, doi:10.3791/58981 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter