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Bioengineering

पानी प्रतिधारण के साथ एक अल्ट्रा पतली polydimethylsiloxane microfluidic चिप का उपयोग कर जीवित caenorhabditis एलिगेंस व्यक्तियों के स्थिरीकरण

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59008
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Summary

स्थिरीकरण विधियों की एक श्रृंखला में पानी प्रतिधारण के साथ एक हाल ही में विकसित अल्ट्रा पतली polydimethylsiloxane microfluidic चिप का उपयोग कर लाइव caenorहैबडिटिस एलिगेंस व्यक्तियों के लक्षित विकिरण की अनुमति देने के लिए स्थापित किया गया है । इस उपंयास पर चिप स्थिरीकरण भी इमेजिंग टिप्पणियों के लिए पर्याप्त है । चिप के विस्तृत उपचार और अनुप्रयोग उदाहरणों को समझाया गया है ।

Abstract

विकिरण व्यापक रूप से जैविक अनुप्रयोगों के लिए और आयन बीम प्रजनन के लिए प्रयोग किया जाता है, और इन विधियों के बीच, microbeam विकिरण सजीव जीवों में रेडियोधर्मी साइटों की पहचान करने का एक शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करता है । इस पत्र में कैनोरहबडिटिस एलिगेंसके जीवित व्यक्तियों के लक्षित माइक्रोबीम विकिरण के लिए विकसित ऑन-चिप स्थिरीकरण विधियों की एक श्रृंखला का वर्णन किया गया है । विशेष रूप से, पॉलीडाइमेथिलसिलॉक्सने (pdms) microfluidic चिप्स है कि हम पहले के लिए anस्थेसिया की आवश्यकता के बिना सी एलिगेंस व्यक्तियों स्थिर विकसित के उपचार में विस्तार से समझाया है । इस चिप, एक कृमि शीट के रूप में संदर्भित, को microfluidic चैनल का विस्तार करने की अनुमति लचीला है, और लोच जानवरों धीरे से ढंक दिया जा करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, PDMS के आत्म अधिशोषण क्षमता के कारण, जानवरों के चैनलों में एक पतली कवर फिल्म है, जिसमें जानवरों संलग्नक के लिए चैनलों में धकेल नहीं रहे है के साथ कीड़ा चादर की सतह को कवर द्वारा सील किया जा सकता है । कवर फिल्म को बंद करके, हम आसानी से जानवरों को इकट्ठा कर सकते हैं । इसके अलावा, कीड़ा चादर पानी प्रतिधारण से पता चलता है और सी एलिगेंस व्यक्तियों जीने की स्थिति के तहत लंबी अवधि के लिए सूक्ष्म अवलोकन के अधीन किया जा करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, चादर केवल ३०० μm मोटी है, जैसे कार्बन आयनों के रूप में भारी आयनों की अनुमति के लिए पशुओं को enclosing चादर के माध्यम से गुजरती हैं, इस प्रकार आयन कणों का पता लगाया जा करने की अनुमति और लागू विकिरण खुराक सही मापा जा करने के लिए । क्योंकि जानवरों को ढकने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली कवर फिल्मों का चयन सफल दीर्घकालिक स्थिरीकरण के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, हमने उपयुक्त कवर फिल्मों के चयन का आयोजन किया और कुछ फिल्मों के बीच एक सिफारिश की है । चिप के एक आवेदन उदाहरण के रूप में, हम कृमि चादर के microfluidic चैनल enclosing जानवरों की पेशी गतिविधियों के इमेजिंग अवलोकन, साथ ही microbeam विकिरण की शुरुआत की । इन उदाहरणों से संकेत मिलता है कि कृमि पत्रकों ने जैविक प्रयोगों की संभावनाओं का काफी विस्तार किया है.

Introduction

एक्स-रे, गामा किरणों, और भारी आयन बीम सहित विकिरण, व्यापक रूप से इस तरह के कैंसर निदान और उपचार में, और आयन बीम प्रजनन के लिए के रूप में जैविक अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है । कई अध्ययनों और तकनीकी विकास वर्तमान में विकिरण के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं1,2,3. सूक्ष्मकिरणपुंज विकिरण सजीव जीवों में रेडियोसंवेदी स्थलों की पहचान करने का एक सशक्तमाध्यम है । क्वांटम और रेडियोलॉजिकल विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए राष्ट्रीय संस्थानों के takasaki उन्नत विकिरण अनुसंधान संस्थान (qst-takasaki) भारी आयन का उपयोग कर सूक्ष्म अवलोकन के तहत व्यक्तिगत कोशिकाओं विकीर्ण करने के लिए एक तकनीक विकसित किया गया है माइक्रोबीम5, और कई मॉडल जानवरों की लक्षित microbeams विकिरण सक्षम करने के लिए विधियों की स्थापना की है, जैसे सूत्रकृमि caenorhabditis एलिगेंस4,6, रेशम के कीड़े7, और oryzias लतीपीज (जापानी मेदका)8. सूत्रकृमि के लक्षित माइक्रोबीम विकिरण सी. एलिगेंस , प्रमुख क्षेत्र में तंत्रिका वलय जैसे विशिष्ट क्षेत्रों के प्रभावी पछाडडाउन की अनुमति देता है, इस प्रकार, चलन जैसी प्रक्रियाओं में इन पद्धतियों की भूमिकाओं को पहचानने में मदद करता है ।

anस्थेसिया की आवश्यकता के बिना सी. एलिगेंस व्यक्तियों के ऑन-चिप स्थिरीकरण के लिए एक विधि माइक्रोबीम विकिरण के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है4. इसके अलावा, microfluidic पिछले4अध्ययन में इस्तेमाल किया चिप्स में सुधार करने के लिए, हम हाल ही में, wettable, आयन-पेनेट्रेशन, polydimethylsiloxane (pdms) microfluidic चिप्स, कृमि शीट्स के रूप में संदर्भित विकसित किया है ( सामग्री की मेजदेखें), के लिए immobilizing C. एलिगेंस व्यक्तियों9. इन अल्ट्रा पतली नरम चादरें (मोटाई = ३०० μm; चौड़ाई = 15 मिमी; लंबाई = 15 मिमी) के साथ एकाधिक (20 या 25) सीधे microfluidic चैनल (गहराई = ७० μm; चौड़ाई = ६० μm या ५० μm; लंबाई = 8 मिमी) में शामिल की सतह (चित्रा 1ए-डी) । microfluidic चैनल खुले हैं और उन्हें एक साथ एक साथ संलग्न किया जा करने के लिए कई जानवरों की अनुमति (चित्रा 1ई). चादरें करने के लिए microfluidic चैनल (द्वारा ~ 10%, चित्रा 1एफ) का विस्तार करने की अनुमति लचीला कर रहे हैं, और लोच जानवरों धीरे से ढंक दिया जा करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, PDMS के आत्म अधिशोषण क्षमता के कारण, जानवरों के चैनलों में एक पतली कवर फिल्म है, जिसमें जानवरों संलग्नक के लिए चैनलों में धकेल नहीं रहे है के साथ कीड़ा चादर की सतह को कवर द्वारा सील किया जा सकता है । कवर फिल्म को बंद करके, हम आसानी से जानवरों को इकट्ठा कर सकते हैं ।

चैनलों के कीड़े जब वे संलग्न किया जा रहा है या जब वे एकत्र कर रहे है चोट नहीं है । इसके अलावा, चादरें PDMS से बना रहे हैं, जो अनिवार्य रूप से hydrophobic है, लेकिन पानी प्रतिधारण सामग्री को hydrophobic प्रदान करके प्राप्त किया जा सकता है । पानी प्रतिधारण और मोटाई कृमि शीट्स के अनुकूल लक्षण हैं । जल-अवधारण क्षमता लंबे समय तक स्थिरीकरण के बाद पशुओं के निर्जलीकरण को रोकती है और दीर्घकालिक टिप्पणियों को निष्पादित करने में सक्षम बनाती है ।

इसके अलावा, के रूप में पहले9वर्णित है, चादरें केवल ३०० μm मोटी हैं, जैसे कार्बन आयनों के रूप में भारी आयनों की अनुमति (पानी में लगभग 1 मिमी की एक सीमा के साथ) के लिए पशुओं enclosing चादर के माध्यम से गुजरती हैं । यह आयन कणों का पता लगाया जा करने के लिए और लागू विकिरण खुराक सही मापा जा करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, कृमि चादरें फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है और इस प्रकार किफायती हैं । पारंपरिक इंजेक्शन विधि के साथ, संलग्न जानवरों को कई बार मर रहे हैं और वे चैनल से बाहर नहीं लिया जा सकता; उनके अंडे भी चैनलों को रोकना कर सकते हैं । इससे चिप अनुपयोगी हो जाती है । चिप्स, इसलिए, मूल रूप से प्रयोज्य है और लागत लाभ अनुपात गरीब है ।

वर्तमान समाचार पत्र में, हम विस्तार से का वर्णन करने के लिए तरीकों की एक श्रृंखला पर लाइव सी. एलिगेंस कीड़ा चादरें का उपयोग कर व्यक्तियों के चिप स्थिरीकरण । पशुओं के चलन assays के माध्यम से 3 ज पर चिप स्थिरीकरण के बाद, हम उपयुक्त कवर फिल्म का मूल्यांकन किया । इसके अलावा, हम दोनों इमेजिंग टिप्पणियों और microbeam विकिरण के लिए पर चिप स्थिरीकरण के उदाहरण दिखाया ।

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Protocol

1. उपभेदों और रखरखाव

  1. प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर C. एलिगेंस और एस्चेरीच्या कोलाई (food) के एक उपयुक्त तनाव का चयन करें ।
    नोट: वर्तमान कागज में, जंगली प्रकार N210C. एलिगेंस (चित्रा 2ए) आम तौर पर प्रयोग किया जाता है, और HBR4:goeIs3 [pmyo-3:: gcamp 3.35:: unc-५४-3 ' utr, unc-119 (+)] V11 केवल इमेजिंग परख के लिए कार्यरत है । ई. कोलाई OP50 C. एलिगेंसके लिए भोजन के रूप में इस्तेमाल किया गया था । असामान्य शरीर के आकार के साथ कुछ म्यूटेंट, जैसे कि unc-119 (e2498) III उत्परिवर्ती के साथ एक कुंडलित आकार (चित्रा 2बी), भी सीधे microfluidic चैनलों में संलग्न किया जा सकता है (चित्रा 2सी).
  2. 6 सेमी पेट्री व्यंजन पर 20 डिग्री सेल्सियस पर c. एलिगेंस बनाए रखने के 10 मिलीलीटर सूत्रकृमि विकास माध्यम (ngm) रातोंरात के साथ फैल-इनयूबेटेड (३७ डिग्री सेल्सियस) ई. कोलाई के रूप में पहले10वर्णितहै । यदि संभव हो तो, भ्रूण अवस्था से सी. एलिगेंस के विकासात्मक अवस्थाओं को सिंक्रनाइज़ करें ।
  3. अच्छी तरह से खिलाया वयस्क जानवरों का प्रयोग करें, लगभग 3-4 दिनों के बारे में 50-60 μm की चौड़ाई के साथ, जो इष्टतम रूप से कृमि शीट्स में microfluidic चैनलों के आकार के लिए उपयुक्त है अंडे के बाद ।

2. बफर समाधान का चयन ऑन-चिप स्थिरीकरण के लिए

  1. गीला कृमि चादरें के लिए, प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर किसी भी बफर समाधान का उपयोग करें ।
    नोट: pdms microfluidic चिप्स पर चिप स्थिरीकरण के लिए उपयुक्त बफर समाधान पहले9 परिभाषित किया गया है और निम्नलिखित बफर समाधान स्थिरीकरण के बाद जानवरों की गतिशीलता पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया गया: एस बेसल बफर समाधान (५.८५ ग्राम NaCl के, 1 मिलीलीटर कोलेस्ट्रॉल (5 मिलीग्राम/मिलीलीटर में इथेनॉल), 1 मीटर पीएच ६.० पोटेशियम फॉस्फेट, एच2ओ के लिए 1 L; autoclaving द्वारा निष्फल)10 nacl की एक बड़ी राशि युक्त, M9 फॉस्फेट बफर समाधान (nacl के 5 ग्राम , 3 जी के ख2पो4, 6 g का ना2hpo4, 1 mL का 1 M Mgso4, H2O से 1 L; autoclaving द्वारा निष्फल)10, धो बफर समाधान (5 मिलीलीटर की 1 मीटर पीएच ६.० पोटेशियम फॉस्फेट, 1 एम के 1 एमएल cacl2, 1 एम mgso4के 1 मिलीलीटर, ०.५ जी पीएफ जिलेटिन, एच2ओ के लिए 1 L; ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल)12 जिलेटिन युक्त , और पराशुद्ध जल9. वर्तमान कागज में, धोने बफर समाधान आम तौर पर प्रयोग किया जाता है, और आधार बफर समाधान है केवल-चिप स्थिरीकरण धारा 3 में विभिंन कवर फिल्मों का उपयोग कर मूल्यांकन के लिए कार्यरत है ।
  2. wettability के बिना पारंपरिक microfluidic चिप्स के लिए, एक धोने बफर समाधान है, जो चिप के microfluidic चैनलों में नमी बनाए रखने का सबसे प्रभावी साधन प्रदान करता है का उपयोग करें और इस प्रकार सी एलिगेंस व्यक्तियों के सुखाने से बचाता है ( microfluidic चिप्स की wettability की परवाह किए बिना) ।

3. पर चिप स्थिरीकरण के लिए उपयुक्त कवर फिल्म का चयन

  1. विभिन्न कवर फिल्मों को इस प्रकार तैयार करें । हैंडलिंग की आसानी के आधार पर, एक उपयुक्त आकार के लिए निम्नलिखित पारदर्शी, biocompatible कवर फिल्मों में कटौती (यानी, 10-15 मिमी की चौड़ाई और 30-50 मिमी की लंबाई): 130-170 μm मोटी कवर ग्लास, १२५ μm मोटी पॉलिएस्टर (पीईटी) फिल्म, और ~ १३० μm मोटी polystyrene (पुनश्च) फिल्म.
  2. इस प्रकार के रूप में अलग कवर फिल्मों का उपयोग 3 एच पर चिप स्थिरीकरण प्रदर्शन । चरण 4.1-4.6 के आधार पर, एक आवरण फिल्म का उपयोग करते हुए कृमि शीट में क्रमशः (३.५ दिन के बाद अंडे देना) 10 धोया वयस्क जानवरों, और 3 एच के लिए छोड़ देते हैं ।
  3. तुलना प्रयोजनों के लिए, मुक्त आंदोलन के 3 एच के रूप में इस प्रकार की अनुमति । प्लेस ≥ 10 एक ३.५ सेमी 3 मिलीलीटर ताजा NGM युक्त थाली पर वयस्क जानवरों को धोया, एक ढक्कन के साथ कवर, और 3 एच के लिए छोड़ दें ।
  4. पशु ले लीजिए तुरंत के बाद 3 एच पर चिप स्थिरीकरण के कदम 5.1-5.3 के अनुसार । कीड़ा चादर से कवर फिल्म निकालें और प्रत्येक जानवर के लिए बफर समाधान की एक बूंद जोड़ें । एक platina बीनने का उपयोग कर छोटी बूंद में तैराकी जानवरों उठाओ और भोजन (परख थाली) के बिना 3 मिलीलीटर ताजा NGM युक्त एक ३.५ सेमी प्लेट के लिए उन्हें हस्तांतरण ।
  5. नि: शुल्क आंदोलन के 3 एच के बाद पशु ले लीजिए । प्रत्येक जानवर के लिए बफर समाधान की एक बूंद जोड़ें । NGM प्लेट पर छोटी बूंद में तैराकी जानवरों उठाओ और एक platina बीनने का उपयोग कर एक परख थाली के लिए उन्हें हस्तांतरण ।
  6. गतिशीलता (चलन परख) पर कवर फिल्म के प्रभाव का मूल्यांकन ।
    1. परख थाली में स्थानांतरण के बाद कम से 5 मिनट, ' गिनती शरीर ' झुकता (20 में पूर्वकाल शरीर क्षेत्र में झुकता की संख्या के रूप में परिभाषित-s अंतराल) एक खुर्दबीन के तहत मैंयुअल रूप से13।
    2. प्रत्येक कवर फिल्म के लिए स्वतंत्र रूप से पांच बार चलन को पूरा करना ।
      नोट: प्रतिनिधि परिणामों में दिखाए गए प्रयोगों में, प्रत्येक प्रयोग के लिए 10 पशुओं का मूल्यांकन किया गया, जिनमें एक साथ कई जानवरों को एक साथ संलग्न किया गया था, जबकि पिछले अध्ययन13में गिने गए केवल पांच जानवरों की तुलना में ।
    3. प्रत्येक प्रयोग के लिए प्रत्येक समूह में 10 पशुओं के लिए शरीर की औसत संख्या की गणना करें । तो पांच स्वतंत्र प्रयोगों से मूल्यों औसत पर चिप स्थिरीकरण के प्रभाव का मूल्यांकन । डेटा सांख्यिकीय विश्लेषण ०.०१ और ०.०५ के महत्व के स्तर पर एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में एक तरह से विचरण का विश्लेषण (ANOVA) परीक्षण का उपयोग कर ।
      नोट: इन प्रयोगों के आधार पर, उच्च ऑक्सीजन पारगम्यता के साथ एक पुनश्च कवर फिल्म उपयुक्त समझा गया था (प्रतिनिधि परिणाम देखें). इन पुनश्च फिल्मों कीड़ा चादरें के साथ शामिल हैं । पीईटी फिल्म है, जो कम ऑक्सीजन पारगम्यता है उपयुक्त समझा नहीं था, क्योंकि जानवरों को घुटन अगर यह कीड़ा चादरें पर लंबे समय तक स्थिरीकरण के दौरान के साथ कवर करने के लिए खड़ा है । यह भी महत्वपूर्ण है कि कवर फिल्म प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला के दौरान तोड़ नहीं है; ग्लास कवर इसलिए भी अनुपयुक्त थे (प्रतिनिधि परिणाम देखें) ।

4. ऑन-चिप स्थिरीकरण

नोट: प्रयोज्य, बाँझ दस्ताने कृमि चादरें contaminating से बचने के लिए पहना जाना चाहिए ।

  1. एक पतली पारदर्शी चादर प्लेस जैसे एक पुनश्च या ग्लास कवर फिल्म है जो कोई autofluorescence है, एक नीचे कवर फिल्म के रूप में प्रयोग के लिए, प्रायोगिक डेस्क या माइक्रोस्कोपिक मंच पर । सपाट चिमटी का उपयोग कर नीचे कवर फिल्म पर एक कीड़ा चादर धीरे प्लेस ।
    नोट: ६० μm चौड़ा microfluidic चैनल (वयस्कों के लिए उपयुक्त के साथ कृमि चादरें के अलावा 3-4 दिनों के बाद अंडे देना), ५० μm चौड़ा चैनल के साथ चादरें (युवा वयस्कों के लिए उपयुक्त 3 दिन के बाद अंडे से और वयस्क अवस्था में छोटे शरीर के साथ मुत्तों) भी नियोजित किया जा सकता है । उपयोग किए जाने वाले जानवरों के आकार के आधार पर एक उपयुक्त शीट का चयन करें ।
  2. जानवरों को इकट्ठा करने के लिए, एक platina बीनने का उपयोग कर एक stereomicroscope के तहत संस्कृति की थाली से एक व्यक्ति वयस्क सी एलिगेंस उठाओ । एक से अधिक जानवरों की जरूरत है, तो इस प्रक्रिया को दोहराएं ।
  3. जानवरों को धोने के लिए भोजन (बैक्टीरिया) को दूर ।
    1. 6 सेमी गैर-स्वास्थ्यकर्मी (वॉटर-विकर्षक) पेट्री डिश की सतह पर बफर सॉल्यूशन की कम तीन बूंदें (5 μL ड्रॉप्स) रखें ।
    2. एक platina बीनने का उपयोग कर एक छोटी बूंद के लिए जानवरों के हस्तांतरण और उन्हें तैराकी द्वारा किसी भी भोजन को हटाने के लिए अनुमति देते हैं । दो अलग बूंदों में उंहें धो लो, और फिर एक और छोटी बूंद में जानवरों कुल्ला ।
      नोट: किसी भी प्रयोग को करने से पहले इसे शीघ्रता से निष्पादित करने में सक्षम होने के लिए इस कार्यविधि का अभ्यास करना आवश्यक है ।
  4. एक कृमि शीट की सतह पर बफर विलयन का 2-3 μL गिरा । पेट्री डिश पर छोटी बूंद से धोया जानवरों उठाओ और उंहें कृमि चादर पर छोटी बूंद के लिए स्थानांतरण ।
  5. पालन के रूप में microfluidic चैनलों में जानवरों संलग्न । एक पुनश्च कीड़ा शीट पर कवर फिल्म फ्लैट चिमटी का उपयोग कर और शीट के एक छोर से चैनलों पर धीरे से दूसरे को नमी बनाए रखने के लिए (के रूप में पहले से4,9वर्णित) ।
    नोट: जानवरों बेतरतीब ढंग से चैनलों में संलग्न हैं । जानवरों वाली बूंदों को चादर को कवर करके कीड़ा चादर में फैल जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बूंदों को कई चैनलों पर व्यापक रूप से विस्तारित किया जा रहा है । प्रत्येक जानवर इन चैनलों में से किसी एक में संलग्न किया जा सकता है । पर चिप स्थिरीकरण के लिए कृमि शीट के उपयोग के बारे में महत्वपूर्ण बात यह है कि एक विस्तृत क्षेत्र में कई चैनल उपलब्ध हैं ।
  6. microfluidic चैनलों में जानवरों को enclosing के तुरंत बाद, पुष्टि करते हैं कि वे एक खुर्दबीन के नीचे सिर की आवाजाही के लिए जाँच करके जीवित हैं (उदा., 1x या 2x आवर्धन).
  7. रिकॉर्ड पशु की स्थिति, एक ही समय में कदम ४.६ बाहर ले जाने के रूप में और कागज के एक समर्पित शीट पर निंनलिखित नोट (अनुपूरक फ़ाइल 1): चैनल जिसमें पशु संलग्न है की संख्या; चैनल में प्रत्येक जानवर की स्थिति (बाएँ/केंद्र/दाएँ); और सिर की दिशा ।
  8. चैनल में प्रत्येक जानवर की स्थिति को चिह्नित करने के लिए तीर आरेखित करें, जो कि पशु के सिर के समान तीर की दिशा के साथ है ।
    नोट: चैनल संख्या (जैसे, 1, 5, 10, 15, 20, 25) माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के बाएँ और दाएँ किनारों के पास कीड़ा चादर की सतह पर उत्कीर्ण कर रहे हैं (चित्र 1ख). समर्पित चादर पर यह जानकारी पशुओं जल्दी से स्थित होने की अनुमति देता है, प्रक्रिया को और अधिक कुशल बनाने, और भी बाद के चरणों के दौरान विकिरण रिसाव को रोकने में मदद करता है ।

5. एक कीड़ा चादर से जानवरों का संग्रह

  1. स्थिरीकरण के तुरंत बाद, फ्लैट चिमटी का उपयोग कर कीड़ा चादर से कवर फिल्म निकालें ।
  2. ड्रॉप 10-15 μL बफर समाधान जानवरों enclosing microfluidic चैनलों पर और एक stereomicroscope के तहत बूंदों में तैरने के लिए शुरू जानवरों का पालन.
    नोट: पशु किसी भी अतिरिक्त दबाव, मदद, या धक्का के बिना अपने दम पर नई छोटी बूंद में तैराकी शुरू करते हैं । बस उनमें से शीर्ष पर कुछ बफर छोड़ने के लिए उंहें चैनल से बाहर तैरने के लिए पर्याप्त है । एक जानवर एक छोटी बूंद में तैरने में असमर्थ हो सकता है अगर यह vitally कदम ७.९ में विकिरण द्वारा क्षतिग्रस्त या कदम 4.2-4.5 में स्थिरीकरण की प्रक्रिया से किया गया है, हालांकि यह दुर्लभ है । इसके अलावा, अगर जानवर कवर फिल्म से जुड़ा रहता है जब यह हटा दिया जाता है, के बजाय चैनलों में कवर फिल्म पर बूंदों जोड़ें ।
  3. एक platina बीनने का उपयोग कर छोटी बूंद में तैराकी जानवरों उठाओ और उन्हें एक परख थाली पर जगह है ।

6. इमेजिंग टिप्पणियों के लिए कृमि शीट्स के आवेदन

नोट: कृमि शीट्स व्यापक रूप से सूक्ष्म टिप्पणियों में इस्तेमाल किया जा सकता है । चिप पानी को बनाए रखने और पर चिप स्थिरीकरण9के 3 एच के बाद सी एलिगेंस व्यक्तियों की गतिशीलता को प्रभावित नहीं करता है । इसके अलावा, चिप ही नहीं autofluorescence है, यह प्रतिदीप्ति इमेजिंग assays में उपयोग के लिए उपयुक्त बना । प्रतिदीप्ति इमेजिंग परख के लिए एक नमूना आवेदन नीचे दिया गया है ।

  1. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का चयन करें और छवियों या वीडियो पर कब्जा करने के लिए खुर्दबीन पर एक डिजिटल कैमरा या डिजिटल वीडियो कैमरा माउंट, क्रमशः (चित्रा 3ए) ।
    नोट: माइक्रोस्कोप की कार्य दूरी (WD) वस्तुनिष्ठ लेंस विनिर्देश के आधार पर ०.२ मिमी से अधिक है ( चित्र 3ख, ग) देखें । इस पत्र में प्रयुक्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रणाली के विनिर्देशन को सामग्रियों की सारणीमें दर्शाया गया है । हालांकि, विनिर्देशन हमारे उदाहरण तक ही सीमित नहीं है क्योंकि यह प्रेक्षण या/और उपयोगकर्ताओं के उद्देश्य पर निर्भर करता है ।
  2. C. एलिगेंस के किसी भी फ्लोरोसेंट तनाव का चयन करें और बनाए रखने के रूप में धारा 1 में वर्णित है ।
    नोट: यदि शरीर-दीवार पेशी संकुचन (प्रतिनिधि परिणाम देखें) का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक है, तो युवा वयस्क HBR411C. एलिगेंसका उपयोग करें, जिसमें एक रिपोर्टर जीन सभी शरीर में दीवार मांसपेशी कोशिकाओं में कैल्शियम संकेतक gcamp 3.35 व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह युवा वयस्कों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है (से बाहर निकलने के बाद ≤ 3 दिन) microfluidic चैनल की चौड़ाई (५० या ६० μm) कीड़ा चादर की तुलना में पतले हैं । मंजूरी की छोटी सी डिग्री का मतलब है कि जानवरों थोड़ा मोड़ कर सकते हैं, यह संभव बनाने के लिए रेंगने के दौरान पेशी संकुचन और विस्तार का निरीक्षण, एक कैल्शियम आयन संकेतक का उपयोग कर ।
  3. धारा 4 में स्थिरीकरण प्रक्रिया के अनुसार पशुओं की पगार ले ।
  4. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग जानवरों के फ्लोरोसेंट स्पॉट (जैसे, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल) का निरीक्षण, और छवियों पर कब्जा एक डिजिटल माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार कैमरे का उपयोग कर ।
    नोट: पहले से स्थापित विधियों का पालन करें14,15,16, के बाद से माइक्रोस्कोप अवलोकन विधियों (प्रतिदीप्ति अवलोकन सहित) और माइक्रोस्कोप प्रणाली के विनिर्देशन पर निर्भर करता है अवलोकन का उद्देश्य ।
  5. छवि कैल्शियम आयन वेव प्रसार वीडियो अधिग्रहण का उपयोग करने के लिए गतिशील गतिविधियों, जैसे शरीर की दीवार पेशी संकुचन और HBR4 worms (वीडियो 1) में विस्तार का निरीक्षण ।

7. माइक्रोबीम विकिरण के लिए कृमि शीट्स के आवेदन

नोट: इस समांतरकारी microbeam विकिरण प्रणाली5 कई भारी आयन का उपयोग कर सकते है दिगंश बदलती क्षेत्र साइक्लोट्रॉन से त्वरित उंनत विकिरण अनुप्रयोग (tiara) की सुविधा के लिए takasaki आयन गतिवर्धक में स्थापित QST-तकासाकी (चित्रा 4A). बीम निकास (चित्रा 4बी) के तहत विकिरण के लिए एक स्वचालित चरण है । इस प्रणाली का उपयोग कर C. एलिगेंस के भारी आयन microbeam विकिरण के लिए प्रक्रिया इस प्रकार है ।

  1. एक एल्यूमीनियम फ़्रेम कस्टम-microbeam-विकिरण सुविधा के लिए बनाया पर एकाधिक जानवरों enclosing कीड़ा चादर का पता लगाने और यह विकिरण के लिए स्वत: मंच पर सेट (चित्रा 4सी) ।
  2. विकिरण नमूना उठाएं (यानी, एक फ्रेम पर एक कीड़ा चादर में संलग्न जानवरों), के तहत तुरंत (~ 2 मिमी) बीम स्वत: चरण (चित्रा 4डी) के तहत स्थित एक खुर्दबीन से मॉनिटर छवि के आधार पर बाहर निकलें ।
  3. ऊर्ध्वाधर स्थिति के बाद, प्रत्येक जानवर का पता लगाने के लिए microbeam जानवरों और सेल संस्कृतियों के लक्षित विकिरण के लिए कस्टम निर्मित सॉफ्टवेयर का उपयोग विकिरण के साथ लक्ष्य । microfluidic चैनल में संलग्न प्रत्येक जानवर का पता लगाने के लिए, चरण 4.7-4.8 में वर्णित समर्पित शीट को देखें ( अनुपूरक फ़ाइल 1देखें) और चैनलों के बाएँ और दाएँ किनारों के पास चैनल संख्या की पुष्टि करें.
  4. बस बीम के तहत जानवरों की स्थिति के लिए एक्स और वाई दिशाओं में स्वत: चरण नियंत्रण एक दूरदराज के नियंत्रण प्रणाली और एक लेजर विकिरण सॉफ्टवेयर के साथ संचालित माउस का उपयोग कर बाहर निकलें ।
  5. मोटे तौर पर नमूने के स्वत: चरण के तहत स्थित खुर्दबीन से प्रक्षेपण देख कर विकिरण क्षेत्र धुन और जानवर के विकिरण की स्थिति के लिए कर्सर ले जाने के लिए लक्षित किया जाएगा ।
  6. किसी न किसी स्थिति के बाद, बाहर निकलें और किरणन कमरे को बंद करने और आसन्न नियंत्रण कक्ष के लिए स्थानांतरित करने के लिए ऑपरेटरों irradiating से बचें ।
  7. एक विकिरण प्रक्रिया के लिए आयन कणों की वांछित संख्या सेट, पशु के एक विशिष्ट क्षेत्र के विकिरण के लिए इसी, एक आयन काउंटर प्रणाली से जुड़े सांत्वना का उपयोग.
    नोट: यह एक प्लास्टिक scintillator और एक photoelectron गुणक के होते हैं में टकराने microbeam विकिरण प्रणाली.
  8. किरणन-नियंत्रण कक्ष से, स्वत: चरण के अंतर्गत स्थित माइक्रोस्कोप से मॉनिटर छवि पर आधारित जानवरों की स्थिति को ठीक-ट्यून करें, जो किरणन कक्ष में मॉनिटर पर प्रक्षेपित छवि है (चित्र 4E) ।
  9. विकिरण के लिए सॉफ्टवेयर के किरणन बटन पर क्लिक करके माइक्रोबीम विकिरण को लक्षित करें ।
    नोट: चित्रा 4चमें दिखाए गए उदाहरण में, हम सिर क्षेत्र में ग्रसनी को लक्षित और microbeam कार्बन आयनों की उचित संख्या के साथ विकीर्ण । क्योंकि नमूने के माध्यम से गुजर आयन कणों की संख्या को सांत्वना और विकिरण सॉफ्टवेयर से जुड़े एक आयन काउंटर प्रणाली का उपयोग कर गिना जाता है, विकिरण आयन कणों की वांछित संख्या की डिलीवरी के बाद बंद कर दिया है.
  10. प्रत्येक जानवर समर्पित पत्रक पर दर्ज की गई और प्रत्येक जानवर को लक्षित विकिरण का पता लगाएँ । सभी जानवरों irradiated किया गया है जब तक चरण ७.८ और ७.९ दोहराएँ ।
  11. विकिरण के तुरंत बाद, विकिरण कमरे में प्रवेश और स्वचालित विकिरण चरण कम । स्वचालित स्टेज पर स्थित कस्टम-निर्मित फ़्रेम पर नमूना निकालें ।
  12. जानवरों के रूप में कदम 5.1-5.3 में वर्णित ले लीजिए ।
  13. अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर लक्षित किरणन के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए अपेक्षित व्यवहार और/अथवा आण्विक विश्लेषण करना ।
    नोट: चलन परख ३.६ कदम में वर्णित गतिशीलता4,9पर विकिरण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रभावी तरीका है ।

8. दोहराया उपयोग के लिए कृमि शीट्स के उपचार

नोट: कृमि शीट्स का प्रयोग कम से 10 बार किया जा सकता है, यदि पशुओं पर कोई प्रतिकूल प्रभाव न पड़े और इस प्रकार प्रयोग करने के बाद ठीक तरह से निष्फल हो जाए ।

  1. सफाई
    1. एक 6 सेमी पेट्री डिश पर इस्तेमाल किया कृमि शीट प्लेस और पूरी चादर पर निष्फल ultrapure पानी की १०० μL के बारे में ड्रॉप ।
    2. धूल, जीवाणु भोजन, और चैनलों में रखी किसी भी अंडे के रूप में गंदगी को धोने के लिए दस्ताने उंगलियों का उपयोग कर चादर की सतह पर पानी पैडल ।
    3. पूरी तरह से प्रयोज्य पोंछे का उपयोग कर कीड़ा चादर से नमी पोंछ ।
  2. बंध्याकरण
    1. पेट्री डिश में ७०% एथेनॉल की लगभग 5 मिलीलीटर सुई, जिसमें कृमि शीट और चादर की सतह चप्ते हैं, जो गंदगी को धोने के लिए चमकदार उंगलियों का प्रयोग करते हैं ।
  3. सुखाने
    1. ७०% इथेनॉल से भरा पेट्री डिश से चिप्स निकालें और स्वाभाविक रूप से सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. भंडारण
    1. सूखने के बाद, एक बाँझ पेट्री डिश पर कीड़ा चादर प्लेस और इसे कवर । चादरें भी ७०% इथेनॉल से भरा एक बाँझ पेट्री डिश पर संग्रहित किया जा सकता है ।
      नोट: उपयोग के बाद कवर फिल्मों का निपटान करने के लिए बेहतर है, लेकिन अगर वे फिर से इस्तेमाल किया जा रहे हैं, उंहें साफ के रूप में कीड़ा चादर के लिए किया । हालांकि, अगर परतों का उपयोग करने के बाद कवर फिल्म पर विकसित यह अब चिप का पालन करेंगे, पशुओं के निर्जलीकरण में जिसके परिणामस्वरूप, और यह इसलिए प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए ।

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Representative Results

सक्रिय C. एलिगेंस व्यक्तियों सफलतापूर्वक एक अल्ट्रा पतली, wettable pdms, microfluidic चिप (कृमि शीट) का उपयोग कर दिया जा सकता है । हमने वर्मी शीट सील करने के लिए विभिन्न कवर फिल्मों की उपयुक्तता की जांच की, जैसा कि प्रोटोकॉल सेक्शन 3 में बताया गया है । कवर फिल्मों के सील प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हम पर-चिप स्थिरीकरण कवर ग्लास का उपयोग (मोटाई: 130-170 μm), पीईटी फिल्म (मोटाई: १२५ μm), और पुनश्च फिल्म (मोटाई: ~ १३० μm), क्रमशः के बाद जानवरों की गतिशीलता 3 एच निर्धारित किया । के रूप में चित्रा 5में दिखाया गया है, वहां गतिशीलता में कोई महत्वपूर्ण अंतर (शरीर bends) के बीच नियंत्रण पशुओं के लिए स्वतंत्र रूप से 3 एच और पी एस फिल्म के साथ कीड़ा चादर में संलग्न पशुओं के लिए स्थानांतरित करने की अनुमति दी । इसके विपरीत, एक आवरण कांच के नीचे संलग्न पशुओं में गतिशीलता काफी कम थी । कुछ जानवरों के लिए बाहर सूख गया दिखाई दिया, सुझाव है कि कवर छोटी बूंद, एक बंद सील को रोकने और पशुओं को आंशिक रूप से बाहर सूखी, कम गतिशीलता में जिसके परिणामस्वरूप की अनुमति के गिलास । एक पालतू फिल्म का उपयोग कर संलग्न जानवरों की गतिशीलता भी काफी कम हो गया था; हालांकि कोई सुखाने मनाया गया था, ' जानवरों गतिशीलता समान रूप से कम करने के लिए खड़ा है, सुझाव है कि कम ऑक्सीजन संचरण दर (~ 30 मिलीलीटर/ MPa]), जो के बारे में १०० बार है कि पुनश्च की तुलना में कम है, जानवरों को घुटता है । इन परिणामों का सुझाव है कि पुनश्च कवर फिल्मों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए कीड़ा चादर में पशुओं संलग्न ।

हम भी इमेजिंग टिप्पणियों के लिए कृमि शीट तकनीक लागू करने के लिए और क्षेत्र विशिष्ट microbeam विकिरण प्रदर्शन । पर चिप पानी प्रतिधारण के साथ एक कीड़ा चादर का उपयोग कर स्थिरीकरण और कोई autofluorescence जीवित परिस्थितियों में सूक्ष्म अवलोकन के लिए उपयुक्त था । उदाहरण के लिए, हम सी. एलिगेंस, जिसमें एक रिपोर्टर जीन के HBR4 तनाव11 के लिए तकनीक लागू सभी शरीर दीवार मांसपेशी कोशिकाओं में कैल्शियम सूचक gcamp 3.35 व्यक्त किया । हम युवा वयस्क जानवरों में सभी शारीरिक दीवार मांसपेशी कोशिकाओं की गतिविधियों को ≤ 3 दिनों के बाद ५० μm-वाइड microfluidic चैनल है, जो जानवरों की जगह थोड़ा झुकने की अनुमति के साथ कृमि चादरें में हैचिंग मनाया । HBR4 तनाव में GCaMP 3.35 संकेत तीव्रता शरीर की दीवार मांसपेशी कोशिकाओं के संकुचन के लिए संगत है । Ca2 + वेव प्रचार पेशी गतिविधि के लिए इसी स्पष्ट रूप से मनाया गया (वीडियो 1) । इसके अतिरिक्त, हमने पुष्टि की है कि कृमि पत्रक के रूप में अंतिम चरण (अंतिम ~ 10 s) 1 वीडियोमें दिखाया गया कोई autofluorescence था । इस तरह, संवेदनाहरण के लिए जरूरत की कमी मांसपेशियों की कोशिकाओं की शारीरिक गतिविधियों को जीने की स्थिति के तहत मनाया जा करने की अनुमति दी ।

इसके अलावा, हम C. एलिगेंस व्यक्तियों के क्षेत्र विशिष्ट microbeam विकिरण के लिए कीड़ा पत्र लागू किया । कृमि शीट पर एकाधिक सीधे microfluidic चैनल कई जानवरों को एक साथ, बेहोशी के लिए की आवश्यकता के बिना, इस प्रकार एक कम समय में ≥ 20 जानवरों (एक समूह की परख के लिए पर्याप्त) की अनुक्रमिक विकिरण की अनुमति के लिए अनुमति दी है (30 मिनट के लिए 20 व्यक्ति) ।

Figure 1
चित्रा 1 : एक कीड़ा चादर की योजनाबद्ध । (क) पैमाने के लिए एक अमेरिकी 1 प्रतिशत सिक्के के साथ एक कीड़ा चादर का अवलोकन । कृमि शीट ३०० μm मोटी, 15 मिमी चौड़ी, और 15 मिमी लंबी थी । (इ) कृमि शीट की सतह में 25 स्ट्रेट माइक्रोफ्लूइडिक चैनल (गहराई = ७० μm; चौड़ाई = ६० μm; लम्बाई = 8 उउ) होते हैं । (ग) नीचे कवर फिल्म, कीड़ा चादर, और कवर फिल्म से मिलकर नमूनों की योजनाबद्ध । (घ) कृमि-पत्र, पीडीएम से निर्मित एक मृदु, अति-पतली शीट है, और इसे सपाट चिमटी से चुटकी भरकर झुके जा सकते हैं । (ङ) बहुविध चैनलों में संलग्न अनेक जंतुओं का उदाहरण । (च) एक platina बीनने के साथ धक्का द्वारा एक microfluidic चैनल का विस्तार । चैनल की लोच जानवरों धीरे से ढंक दिया जा करने के लिए अनुमति देता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : C. एलिगेंसके शारीरिक रूप । (क) एक एनजीएम प्लेट पर वाइल्ड टाइप (N2) सी एलिगेंस । (ख) एक unc-११९ उत्परिवर्ती एक ngm प्लेट पर असामान्य आकार के साथ । (ग) वर्मी शीट के माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों में संलग्न यूएनसी-११९ म्यूटेंट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : लाइव सी. एलिगेंस के सूक्ष्मदर्शी प्रेक्षण की योजनाबद्ध कृमि शीट में संलग्न व्यक्ति । (क) इमेजिंग पे्रक्षणों के लिए स्टीरियोमिकरोस्कोप प्रणाली का योजनाबद्ध रूप से होना । (ख) सजीव ग. एलीगेंस व्यक्तियों को आबद्ध करने वाली कृमि शीट के सूक्ष्मदर्शी प्रेक्षण की योजनाबद्ध । (ग) जीवित सी. एलिगेंस को आबद्ध करने वाले कृमि शीट का अनुभागीय दृश्य सूक्ष्मदर्शी स्तर पर रखा जाता है । W.D. माइक्रोस्कोप की कार्य दूरी को इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : qst-takवासाकी और लक्षित microbeam जी सी. एलिगेंस व्यक्तियों के लिए विकिरण प्रक्रिया में समांतरकारी माइक्रोबीम प्रणाली की योजनाबद्ध । (क) समांतरकारी माइक्रोबीम किरणन प्रणाली5का सिंहावलोकन, जो कई भारी आयन कणों का प्रयोग कर सकता है जो कि क्यूएसटी-तकासाकी के तियारा में स्थापित दिवाला बदलती क्षेत्र साइक्लोट्रॉन से त्वरित है । (ख) किरणपुंज निकास और विकिरण के लिए स्वचालित अवस्था का सिंहावलोकन । (ग) संकोरक माइक्रोबीम प्रणाली की स्वचालित अवस्था पर प्रतिदर्श की स्थापना । (घ) किरणन कक्ष में किए गए विकिरण प्रतिदर्श की ऊर्ध्वाधर अवस्थिति । (ङ) किरणन-नियंत्रण कक्ष में किरणित विकिरण क्षेत्र का फाइन-ट्यूनिंग । (च) लाइव सी एलिगेंसके लक्षित माइक्रोबीम विकिरण । ग्रसनी पर क्लिक किया गया-पर लक्षित स्थिति के रूप में और किरणन विकिरण बटन धक्का द्वारा किरणित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : पर चिप स्थिरीकरण कवर ग्लास, पॉलिएस्टर (पीईटी) फिल्म, और polystyrene (पी एस) फिल्म का उपयोग कर के बाद सी एलिगेंस की गतिशीलता । सलाखों के मतलब शरीर जानवरों के झुकता 3 एच पर चिप स्थिरीकरण के बाद या एक ngm प्लेट पर 3 एच के लिए मुक्त आंदोलन के बाद संकेत मिलता है (नियंत्रण) । दस पशुओं की जांच की गई और प्रत्येक समूह के बीच शरीर की बेंडों का औसत था । अंत में, पांच स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा प्रत्येक समूह के लिए औसत थे । त्रुटि पट्टियां पांच स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । सभी डेटा ०.०५ (*) या ०.०१ (* *) महत्व स्तर पर एक तरह से ANOVA का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Video 1
1 वीडियो: में पेशी गतिविधियों के इमेजिंग टिप्पणियों के उदाहरण C. एक कीड़ा चादर में संलग्न एलिगेंस. कैल्शियम आयन तरंग संचरण शरीर के संकुचन के लिए इसी-HBR4 C. एलिगेंस एक कीड़ा चादर में संलग्न व्यक्तियों में रेंगने के दौरान दीवार मांसपेशी कोशिकाओं । पिछले ~ 10 एस उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत मनाया गया । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Supplementary Figure 1
अनुपूरक फाइल 1: कागज के समर्पित शीट का उदाहरण (माइक्रोबीम विकिरण संस्करण) । चैनल में प्रत्येक जानवर की स्थिति का संकेत करने के लिए एक तीर आरेखित करें । तीर की दिशा सिर से मेल खाती है । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एक wettable pdms microfluidic चिप का उपयोग कर जीने की स्थिति के तहत सी. एलिगेंस के चिप स्थिरीकरण पर कई जानवरों के कुशल लक्षित microbeam विकिरण सक्षम बनाता है । हैंडलिंग और सुविधाओं को सुखाने से रोकने के लिए इस प्रणाली को न केवल microbeam विकिरण में अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाने में आसानी, लेकिन यह भी कई व्यवहार assays में । इन कृमि पत्रकों का पहले ही वाणिज्यीकरण किया जा चुका है और आसानी से प्राप्त किया जा सकता है. पारंपरिक microfluidic चिप्स, जैसे कि घ्राण चिप्स, बंद microfluidic चैनल यह मुश्किल जानवरों को इकट्ठा करने के लिए बनाने में जानवरों और अंडे की कॉलेस्ट्रॉल सहित समस्याओं के साथ जुड़े रहे हैं, और इस तरह चिप्स के लिए प्रयोज्य हो खड़ा किया है, जिससे लागत में वृद्धि । इसके विपरीत, वर्तमान कृमि शीट में माइक्रोफ्लूइडिक चैनल खुले हैं, जिससे जानवरों को इकट्ठा करना आसान हो जाता है । ये कृमि शीट्स इसलिए बार-बार इस्तेमाल की जा सकती हैं, जिससे उन्हें और किफायती बना दिया जाए.

pdms microfluidic चिप्स में हाल ही में तकनीकी नवाचारों संरचनात्मक जटिलता और multifunctionality में एक बढ़ती प्रवृत्ति दिखाया गया है16,18,19,20,21, 22,23. हालांकि, हमें विश्वास है कि यह प्रणाली सरल और प्रयोग करने में आसान बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । दरअसल, पारंपरिक बड़े microfluidic चिप्स के उपयोग के विपरीत19,20,21,22,23 कि एक वैक्यूम पंप के लगाव की आवश्यकता होती है, छोटे आकार और कृमि शीट्स की सरल डिजाइन प्रक्रियाओं को एक सीमित स्थान के भीतर आसानी से आयोजित की अनुमति देते हैं ।

कृमि पत्रकों का जल प्रतिधारण निष्पादन दीर्घकालिक टिप्पणियों को निष्पादित करने में सक्षम बनाता है । इसके अलावा, चादर की मोटाई आयन कणों के नमूनों के माध्यम से पारित करने की अनुमति देता है, इस प्रकार लक्षित विकिरण सक्षम करने के लिए आयन कणों की एक सटीक संख्या के साथ लाइव सी एलिगेंस व्यक्तियों के लिए लागू किया जा. कृमि पत्रकों के इन फायदों ने जैविक प्रयोगों के लिए संभावनाओं का काफी विस्तार किया है.

हमारा मानना है कि जीव विज्ञानियों के लिए यह जरूरी है कि वे नए उपकरण और तरीके विकसित करें ताकि उनके प्रयोगों और विश्लेषणों की कुशलता में सुधार हो सके. कीड़ा चादरें और microbeam विकिरण सॉफ्टवेयर मन में इस उद्देश्य के साथ विकसित किया गया है, और अपने मूल उद्देश्यों से परे भविष्य अभिनव प्रयोगों की सफलता में योगदान करने की क्षमता है ।

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, हमारे समूह के सबसे पहले इस प्रौद्योगिकी दुनिया भर में विकसित करने के लिए है । तथापि, भविष्य में इसके मानकीकृत उपयोग से जीवित परिस्थितियों में पशुओं को लक्षित माइक्रोबीम विकिरण के अनुप्रयोग की सुविधा होगी, इस प्रकार आंतरिक प्रक्रियाओं में विशिष्ट कोशिकाओं/ऊतकों की भूमिकाओं की पहचान करने में मदद मिलेगी ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने सी. एलिगेंस और डीआरएस के उपचार के संबंध में तरह की सलाह के लिए डॉ. अतसुशी हिगष्टानी का शुक्रिया अदा की । युया हेटटोरी, युइचिरो योकोटा, र यसुहिको कोबायाशी बहुमूल्य छलफल लिए । लेखक C. एलिगेंस और ई.कोलाई के उपभेदों प्रदान करने के लिए caenorhabditis आनुवंशिक केंद्र का शुक्र है । हम qst में tiara के साइक्लोट्रॉन के चालक दल को धंयवाद-takasaki विकिरण प्रयोगों के साथ अपनी तरह की सहायता के लिए । हम इस पांडुलिपि का एक मसौदा संपादन के लिए डॉ Susan Furness धंयवाद । इस अध्ययन के भाग में KAKENHI (अनुदान संख्या JP15K11921 और JP18K18839) JSPS से एमएस के लिए समर्थन किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild-type strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA N2 Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA CB4845 C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape 
C. elegans transgenic strain HBR4 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA HBR4 The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA OP50 E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60) Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM17-0001 Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper 
Worm Sheet 60 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001 Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. 
Worm Sheet 50 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0002 Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. 
MICRO COVER GLASS MATSUNAMI GLASS IND. LTD. C030401 Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001/ BCM18-0002 Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan Lumirror T60 (t 125 µm) PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-060 Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-035 Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q Merck, France Ultrapure water
Kimwipe S-200 Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan 62020 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick Genesee Scientific Corporation, CA, USA) 59-AWP Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX16 Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16 OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-ILLB This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO1×PF NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO2XPFC NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan U-LH100HG The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-FYFPHQ Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013 Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA EXCEL Software used for statistical analyses

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पानी प्रतिधारण के साथ एक अल्ट्रा पतली polydimethylsiloxane microfluidic चिप का उपयोग कर जीवित <em>caenorhabditis एलिगेंस</em> व्यक्तियों के स्थिरीकरण
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Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, T. Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention. J. Vis. Exp. (145), e59008, doi:10.3791/59008 (2019).

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