Summary
일련의 동원 정지 메서드를 라이브 꼬마 선 충 의 대상된 조사 수 있도록 설립 되었습니다 최근 개발한 초박형입니다 미세를 사용 하 여 개인 물 유지와 칩. 이 새로운 칩에 동원 정지 관측 이미징에 대 한 적절 한 이기도 합니다. 자세한 치료 및 칩의 응용 프로그램 예제는 설명 했다.
Abstract
방사선은 생물 학적 응용 프로그램 및 이온 빔 번 식, 널리 사용 되 고 이러한 방법 중 microbeam 방사선 생명체에 radiosensitive 사이트를 식별 하는 강력한 수단을 나타냅니다. 이 문서는 일련을의 온 칩 immobilization 메서드 꼬마 선 충의 라이브 개인 대상된 microbeam 방사선에 대 한 개발에 대해 설명 합니다. 특히, 우리가 이전 마 취는 자세히 설명 되어에 대 한 필요 없이 선 충 C. 개인을 무력화 하기 위해 개발입니다 (PDMS) 미세 칩의 치료. 웜 시트 라고 하는이 칩은 탄력 미세 채널 확장 될 수 있도록 하며 탄성 동물 부드럽게 덮여 또한,는 PDMS의 자기 흡착 용량 때문 동물 수 봉인 채널에 없는 동물 하지 올려집니다 채널에 위한 인클로저 얇은 커버 필름으로 벌레 시트의 표면을 커버 하는 여. 회전 표지에 영화, 하 여 우리 쉽게 동물을 수집할 수 있습니다. 또한, 웜 시트 물 보존을 보여줍니다 및 선 충 C. 개인이 라이브 조건에서 오랜 기간 동안 현미경 관찰 대상이 될 수 있습니다. 또한, 시트가입니다만 300 µ m 두께, 탄소 이온 이온 입자 감지 되므로 동물을 포함 하는 시트를 통과 같은 무거운 이온과 적용된 방사선 복용량을 정확 하 게 측정할 수 있도록. 다양 한 동물을 둘러싸는 사용 커버 영화 성공적인 장기 동원 정지에 대 한 매우 중요 하기 때문에, 우리 적당 한 커버 영화의 선택을 실시 하 고 일부 영화 중 하나를 권장된 했다. 응용 프로그램의 예로 칩, 웜 시트 microbeam 방사선의 미세 채널을 포함 하는 동물의 근육 활동의 영상 관측을 소개 했습니다. 이 예제에서는 웜 시트 생물학 실험에 대 한 가능성을 크게 확대 했습니다 나타냅니다.
Introduction
방사선, 엑스레이, 감마선, 무거운 이온 빔 등 암 진단 및 치료에서 같은 생물 학적 응용 및 이온 빔 사육에 널리 사용 됩니다. 수많은 연구와 기술 개발은 현재 방사선1,2,3의 효과에 집중 됩니다. Microbeam 방사선은 생활에 radiosensitive 사이트를 식별 하는 강력한 수단 유기 체4. 다카사키 고급 방사선 연구소의 국립 연구소 양자 방사선 과학 및 기술 (QST-다카사키)에 대 한 무거운 이온을 사용 하 여 현미경 관찰에서 개별 셀을 비추는 기술 개발 microbeams5, 선 충 류 꼬마 선 충4,6, 누7, Oryzias 등 여러 모델 동물의 방사선 조사 대상된 microbeam를 사용 하는 방법을 설립 했다 latipes (일본 메 다카)8. 선 충 C. 선 충 의 타겟된 microbeam 방사선 수 신경 반지에 머리 지역에 따라서 운동 같은 프로세스에 이러한 시스템의 역할을 돕는 등 특정 지역의 효과적인 최저가 있습니다.
무감각을 위한 필요 없이 선 충 C. 개인의 온 칩 동원 정지 하는 방법 microbeam 조사4수 있도록 개발 되었습니다. 또한, 이전 연구4에서 사용 하는 미세 칩을 개선 하기 위해, 우리는 최근 개발 wettable, 이온-꿰 뚫을 수,입니다 (PDMS) 미세 칩, 웜 시트 ( 재료의 표참조), 라고 immobilizing C. 선 충 개인9. 이러한 울트라 얇은 부드러운 시트의 구성 (두께 = 300 µ m; 폭 = 15 밀리미터; 길이 = 15 m m) 여러 (20 또는 25) 똑바로 미세 채널 (깊이 70 µ m; = 너비 = 60 µ m 또는 50 µ m; 길이 = 8 mm) 표면 (그림 1A-D)에. 미세 채널은 열려 있고 동시에 그들에 묶어야 합니다 여러 동물 허용 (그림 1E). 시트는 탄력 미세 채널 (~ 10%, 그림 1F)에 의해 확장 될 수 있도록 하며 탄성 동물 부드럽게 덮여 또한,는 PDMS의 자기 흡착 용량 때문 동물 수 봉인 채널에 없는 동물 하지 올려집니다 채널에 위한 인클로저 얇은 커버 필름으로 벌레 시트의 표면을 커버 하는 여. 회전 표지에 영화, 하 여 우리 쉽게 동물을 수집할 수 있습니다.
채널 포함 되는 경우 또는 그들은 수집 하는 때 벌레를 다치게 하지 않습니다. 또한, 시트는 본질적으로 소수는 PDMS에서 만들었지만 물 보존 자료에 화란 부여에 의해 달성 될 수 있다. 물 보존 및 두께 웜 시트의 유리한 특징입니다. 물 보존 용량 머리말 붙인된 동원 정지 후 동물의 탈수를 방지 하 고 장기 관측 실시 될 수 있습니다.
또한, 앞에서 설명한9, 시트는만 300 µ m 두께, 동물을 포함 하는 시트를 통과 탄소 이온 (물 약 1 m m의 범위)와 같은 무거운 이온을 허용. 이온 입자 감지 되 고 적용 된 방사선 복용량을 정확 하 게 측정할 수 있습니다. 또한, 웜 시트 다시 사용할 수 있으며 따라서 경제적. 기존의 주입 방법 동봉 동물은 때때로 죽은 채널;에서 촬영 하실 수 없습니다. 그들의 계란 또한 채널을 방해할 수 있습니다. 이것은 칩을 사용할 수 없게 합니다. 칩은, 따라서, 기본적으로 일회용 비용 혜택 비율입니다.
현재 신문에서 우리 자세하게에서 설명 일련의 온 칩 라이브 C. 선 충 의 동원 정지에 대 한 메서드를 웜 시트를 사용 하 여 개인. 동물 내장 동원 정지 후 3 h의 운동 분석을 통해 우리는 적당 한 커버 필름 평가. 또한, 우리는 온-칩 동원 정지 영상 관찰과 microbeam 방사선에 대 한의 예를 보였다.
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Protocol
1. 긴장 및 유지 보수
- 실험의 목적에 따라 C. 선 충 및 대장균 (음식)의 적당 한 긴장을 선택 합니다.
참고: 현재 신문에서 야생-타입 N210C. 선 충 (그림 2A)는 일반적으로 사용, 및 HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54-3' utr, unc-119(+)] V11 만 이미징 분석 결과 대 한 고용. 대장균 OP50 C. 선 충에 대 한 음식으로 사용 되었다. 일부 돌연변이 코일 모양 (그림 2B), unc-119(e2498) III 돌연변이 같은 비정상적인 신체 모양, 또한 수 묶어야 직선 미세 채널 (그림 2C). - C. 선 충 선 충 성장 매체 (NGM) 하룻밤 incubated (37 ° c) 대장균 10. 위에서 설명한 대로 확산의 10 mL를 포함 하는 6 cm 배양 접시에 20 ° C에서 유지 만약에 가능 하다 면, 태아 단계에서 C. 선 충 의 발달 단계를 동기화 합니다.
- 사용 잘 먹이 성인 동물, 폭 약의 부 화 후 3-4 일 약 50-60 µ m, 웜 시트에 미세 채널의 크기를 최적으로 적합.
2. 온 칩 동원 정지에 대 한 버퍼 솔루션의 선택
- Wettable 웜 시트에 대 한 실험의 목적에 따라 어떤 버퍼 솔루션을 사용 합니다.
참고: PDMS 미세 칩 왔다에 동원 정지에 칩에 대 한 적당 한 버퍼 솔루션 정의9 이전 및 다음 버퍼 솔루션 동원 정지 후 동물의 운동에 아무런 영향을 표시 했다: S 기저 버퍼 솔루션 (5.85 g의 NaCl, 콜레스테롤 (에탄올에 5 mg/mL)의 1 mL, 50 mL의 1 M pH 6.0 칼륨 인산 염, H2O 1 l; 압력가 마로 소독에 의해 소독)10 포함 하는 많은 양의 NaCl, M9 인산 염 버퍼 솔루션 (NaCl의 5 g KH2포4의 3 세대, 나2HPO46 g, 1 mL의 1 M MgSO4, H2O 1 l; 압력가 마로 소독에 의해 소독)10, 워시 버퍼 솔루션 (5 mL의 1 M pH 6.0 칼륨 인산 염, 1 M CaCl2의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO4, 0.5 g pf 젤라틴, H2O 1 l; 압력가 마로 소독에 의해 소독)12 젤라틴을 포함 하 그리고 초순9. 현재 신문에서 워시 버퍼 솔루션은 일반적으로 사용 하 고, 그리고 S 기저 버퍼 솔루션만 온 칩 immobilization 섹션 3에서에서 다른 커버 필름을 사용 하 여 평가 대 한 고용. - 습윤 없이 기존의 미세 칩, 칩의 미세 채널에 수 분을 유지 하는 가장 효과적인 수단을 제공 한다을 따라서 선 충 C. 개인 (건조 방지 워시 버퍼 솔루션 사용 하 여 에 미세 칩의 습윤).
3. 온 칩 동원 정지에 대 한 적합 한 커버의 선택
- 다음과 같이 다른 커버 필름을 준비 합니다. 적당 한 크기 (즉, 10-15 m m의 너비와 30-50 m m의 길이)에 생체 커버 필름 처리, 투명 한, 다음을 잘라의 용이성에 따라: 130-170 µ m 두꺼운 덮개 유리, 125 µ m 두께 폴 리 에스테 르 (PET) 영화와 ~ 130 µ m 두께 폴리스 티 렌 (PS) 영화입니다.
- 3 h 온 칩 immobilization 다른 커버 필름을 사용 하 여 다음과 같이 수행 합니다. 단계 4.1 4.6 묶습니다 ≥10 성인 동물 (부 화 후 3.5 일) 각각, 각 커버 필름을 사용 하 여 웜 시트에서 씻어와에 3 h 떠나.
- 비교를 위해, 자유로운 이동의 3 h를 다음과 같이 수 있습니다. 장소 ≥10 3 mL를 포함 하는 3.5 c m 접시에 성인 동물을 씻어 신선한 NGM, 뚜껑, 커버 하 고 3 h 떠나.
- 3 h 단계 5.1-5.3에 따라 온-칩 동원 정지의 직후 동물을 수집 합니다. 웜 시트에서 커버 필름을 제거 하 고 각 동물에 버퍼 솔루션의 한 방울을 추가 합니다. 백 금 선택기를 사용 하 여 작은 물방울에서 수영 하는 동물을 선택 하 고 3 mL를 포함 하는 3.5 c m 접시에 그들을 전송 음식 (분석 결과 플레이트) 없이 신선한 NGM.
- 무료 운동의 3 h 후 동물을 수집 합니다. 각 동물에 버퍼 솔루션의 한 방울을 추가 합니다. NGM 접시에는 작은 물방울에 수영 하는 동물을 선택 하 고 백 금 선택을 사용 하 여 분석 결과 접시에 그들을 전송.
- 운동 성 (운동 분석 결과)에 커버 필름의 효과 평가 합니다.
- 분석 결과 플레이트, 수에 이동 후에 적어도 5 분 ' 굴절 (20-s 간격 앞쪽 몸 지역에 굴절 수로 defined) 현미경13에서 수동으로 바디.
- 수행 하지 운동 분석 5 번 독립적으로 각 덮개 필름에 대 한.
참고: 대표 결과에 표시 된 실험에 10 동물 있는 여러 동물 했다 동봉 하는 동시에, 이전 연구13에 5 개의 동물에 비해 각 실험에 대 한 평가 했다. - 각 실험에 대 한 각 그룹에 10 동물에 대 한 신체 굴곡의 평균 수를 계산 합니다. 다음 칩에 동원 정지의 effects를 평가 하기 위해 5 개의 독립적인 실험 값 평균. 0.01, 0.05의 의미 수준에서 스프레드시트 소프트웨어 단방향 분산 분석 (ANOVA) 테스트를 사용 하 여 통계 데이터를 분석 합니다.
참고: 이러한 실험에 기반, 높은 산소 침투성와 PS 덮개 필름 적당 한 간주 되었다 (대표 결과 참조). 이 PS 영화 웜 시트 포함 되어 있습니다. 애완 동물 영화, 낮은 산소 투과율이 동물 웜 시트에 장기 동원 정지 동안 그것으로 덮여 질 식 하는 경향이 있기 때문에 적당 한 간주 되었다. 그것은 또한 중요 커버 필름 절차;의 시리즈 동안 휴식 하지 않습니다. 유리 커버 되지 않은 따라서 또한 적당 한 (대표 결과 참조).
4. 온-칩 동원 정지
참고: 일회용, 멸 균 장갑 웜 시트 오염 방지를 착용 한다.
- 실험적인 책상 이나 미세한 무대에 하단 덮개 필름으로 사용 하기 위해 아무 autofluorescence는 PS 또는 유리 커버 필름 등 얇은 투명 시트를 놓습니다. 평평한 핀셋을 사용 하 여 하단 커버 필름에 부드럽게 웜 시트를 놓습니다.
참고: 60 µ m 차원의 미세 채널 (성인 부 화 후 3-4 일을 위한 적당 한) 벌레 시트 외에 50 µ m 넓은 채널 (젊은 성인 성인 무대에서 해칭 및 작은 시체와 함께 돌연변이 후 3 일을 위한 적당 한)와 시트도 사용할 수 있습니다. 사용 될 동물의 크기에 따라 적절 한 시트를 선택 합니다. - 동물을 수집 하는 개별 성인 C. 선 충 stereomicroscope 백 금 선택을 사용 하 여 아래 문화 판에서 선택. 여러 동물 필요한 경우 프로세스를 반복 합니다.
- 음식 (박테리아)을 제거 하는 동물을 씻어.
- 버퍼 솔루션의 적어도 3 방울 (5 µ L 정) 6 cm 치료 비 (물) 페 트리 접시의 표면에 놓습니다.
- 동물 물방울 백 금 선택기를 사용 하 여 전송 하 고 수영 하 여 어떤 음식 든 지 제거 하도록 허용. 두 개의 별도 방울에 두 번 그들을 세척 하 고 다른 방울에 동물을 씻어.
참고: 그것은 어떤 실험을 수행 하기 전에 신속 하 게 수행할 수 있도록이 절차를 연습 하는 데 필요한입니다.
- 2-3 µ L 웜 시트의 표면에 버퍼 솔루션의 드롭. 페 트리 접시에 방울에서 씻어 동물을 선택 하 고 웜 시트에는 작은 물방울에 그들을 전송.
- 미세 채널에 따라 동물을 묶습니다. 평평한 핀셋을 사용 하 여 웜 시트 PS 커버 필름을 놓고 하 고 (앞에서 설명한4,9) 습도 유지 하기 위해 다른 시트의 한쪽 끝에서 채널을 통해 부드럽게 누릅니다.
참고: 동물 채널에 임의로 묶여있다. 동물을 포함 하는 방울 방울 여러 채널을 통해 널리 확장 되 고 그 결과 시트를 취재 하 여 웜 시트에 걸쳐 전파 됩니다. 각 동물 이러한 채널 중 하나에 포함 되어 있습니다. 온 칩 동원 정지에 대 한 웜 시트의 사용에 관한 중요 한 점은 여러 채널 넓은 지역에 사용할 수 있습니다. - 미세 채널에 동물을 포함 직후 그들은 현미경에서 머리의 움직임에 대 한 확인 하 여 살아는 확인 (예: 1 x 또는 2 x 배율).
- 수행 단계 4.6으로 동시에 동물의 위치를 기록 하 고 종이 (보조 파일 1)의 전용된 시트에서 다음을 유의 하십시오: 있는 동물 묶인; 채널의 숫자 채널 (왼쪽/중앙/오른쪽);에서 각 동물의 위치 그리고 머리의 방향입니다.
- 동물의 머리에 해당 하는 화살표의 방향으로는 채널에 각 동물의 위치를 표시 하는 화살표를 그립니다.
참고: 채널 번호 (예: 1, 5, 10, 15, 20, 25) 미세 채널 (그림 1B)의 왼쪽 및 오른쪽 가장자리 근처 웜 시트의 표면에 새겨져 있다. 전용된 시트에 대 한이 정보는 과정 좀 더 효율적인, 동물을 신속 하 게 배치할 수 있습니다 그리고 또한 이후 단계 동안 방사선 누출을 방지 하는 데 도움이.
5. 웜 시트에서 동물의 수집
- Immobilization, 직후 플랫 핀셋을 사용 하 여 웜 시트에서 커버 필름을 제거 합니다.
- 동물을 포함 하는 미세 채널에 10-15 µ L 버퍼 솔루션을 삭제 하 고는 stereomicroscope 아래 방울에 수영을 시작 하는 동물을 관찰.
참고: 동물 없이 자신의 추가 압력, 도움, 또는 푸시에 새로운 방울에 수영을 시작합니다. 그냥 그들의 위에 몇몇 버퍼를 삭제 하는 것은 채널에서 수영 수 있도록 충분 하다. 동물 이것은 드문 있지만 그것은 손상 된 경우 극히 단계 7.9에서에서 방사선 또는 단계 4.2-4.5, immobilization 프로세스 물방울에 수영을 수 있을 수 있습니다. 또한, 경우 동물 커버 필름 부착 제거 되 면, 채널에 커버 필름 대신에 방울을 추가 합니다. - 백 금 선택기를 사용 하 여 작은 물방울에서 수영 하는 동물을 선택 하 고 시험 접시에 그들을 배치.
6. 웜 시트 관측 이미징 응용
참고: 웜 시트 사용할 수 있습니다 광범위 하 게 현미경 관찰에. 칩 물 유지할 수 및 온 칩 immobilization9의 3 h 후 선 충 C. 개인의 운동 성 영향을 주지 않습니다. 또한, 칩 자체 형광 이미징 분석 실험에서에서 사용 하기 위해 적합 한 만드는 아무 autofluorescence가 있다. 형광 이미징 분석 결과 대 한 샘플 응용 프로그램은 아래에 주어진 다.
- 형광 현미경을 선택 하 고 각각 디지털 카메라 또는 디지털 비디오 카메라 캡처 이미지 또는 비디오, 현미경에 장착 (그림 3A).
참고: 현미경의 작동 거리 (WD)은 대물 렌즈 사양에 따라 0.2 m m 이상 (참조 그림 3B, C). 이 문서에 사용 된 형광 현미경 시스템의 사양 자료의 테이블에에서 표시 됩니다. 그러나, 사양에 국한 되지 않습니다 예에서 관찰의 목적에 따라 또는 / 그리고 사용자가. - C. 선 충 의 어떤 형광 긴장을 선택 하 고 섹션 1에서에서 설명한 대로 유지.
참고: 체 벽의 근육 수축 관찰 해야 하는 경우 (대표적인 결과 참조), 젊은 성인 HBR411C. 선 충, 칼슘 표시기 모든 몸 벽 근육 세포에서 GCaMP3.35을 표현 하는 취재 원 유전자 사용 되는 사용. 그것은 벌레 시트의 미세 채널 (50 또는 60 µ m)의 폭 보다는 젊은 성인 (부 화 후 ≤3 일)를 사용 하는 것이 중요. 정리의 작은 정도 동물 구부릴 수 있다 약간, 근육 수축과 확장, 크롤링 중에 관찰 가능 하 게 하는 칼슘 이온 표시기를 사용 하 여 의미 합니다. - 섹션 4에서에서 동원 정지 절차에 따라 동물의 인클로저를 실시 합니다.
- 동물 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 분류 긴장) 형광 현미경을 사용 하 여 형광 관광 명소를 확인 하 고 현미경에 장착 된 디지털 카메라를 사용 하 여 이미지를 캡처.
참고: 이전 설립된 방법14,,1516, (를 포함 하 여 형광 관찰) 현미경 관찰 방법부터 따르고 현미경 시스템의 사양에 따라 달라 집니다. 관찰의 목적입니다. - 이미지 칼슘 이온 파 번 식 비디오 수집을 사용 하 여 동적 활동, 체 벽의 근육 수축 및 확장 HBR4 웜 (비디오 1)에서 같은 관찰을.
7. 웜 시트 microbeam 방사선에 대 한 응용
참고: collimating microbeam 방사선 시스템5 여러 중 이온 입자 다카사키 이온 가속기의 고급 방사선 응용 프로그램 (티아라) 시설에 설치 된 azimuthally 다양 한 필드 싸이 클 로트 론에서 가속을 사용할 수 있습니다. QST-다카사키(그림 4). (그림 4B) 빔 출구에서 방사선에 대 한 자동 무대가입니다. C. 선 충 이 시스템을 사용 하 여 무거운 이온 microbeam 방사선에 대 한 절차는 다음과 같습니다.
- Microbeam-방사선 조사 시설에 대 한 주문 품 알루미늄 프레임에 여러 동물을 포함 하는 웜 시트 찾아서 조사 (그림 4C)에 대 한 자동 무대에 그것을 설정 합니다.
- (즉, 동물 벌레 시트 프레임에 동봉), 조사 샘플 인상 바로 아래 (~ 2 m m) 광속 출구 자동 단계 (그림 4D) 아래에 있는 현미경에서 모니터 이미지에 따라.
- 세로 위치 지정 후 동물 세포 배양의 대상된 조사에 대 한 맞춤 소프트웨어를 사용 하 여 microbeam 방사선 조사와 함께 대상에 각 동물을 찾습니다. 미세 채널에 각 동물을 찾으려면 단계 4.7-4.8 ( 보충 파일 1참조)에 설명 된 전용된 시트를 참조 하 고 왼쪽 및 오른쪽 가장자리 근처는 채널의 채널 번호를 확인 합니다.
- X에서 자동 단계 제어 및 바로 광선 아래 동물 위치 Y 방향 원격 제어 시스템을 사용 하 여 종료 하 고 레이저 마우스 방사선 소프트웨어와 함께 운영.
- 대략 조정 현미경에서 투영을 보고 조사 면적 샘플 및 타겟이 될 동물의 방사선 조사 위치에 커서를 이동의 자동 단계 아래에 있습니다.
- 거친 위치, 후 종료 및 방사선 방 닫고 연산자 해 피하기 위해 인접 한 컨트롤을 이동 합니다.
- 설정에 해당 하는 콘솔을 사용 하 여 동물의 특정 지역의 방사선 한 조사 절차에 대 한 이온 입자의 원하는 수 이온 카운터 시스템에 연결 합니다.
참고:이 구성 되어 플라스틱 선과 광전자 멀티 플라이어의 collimating microbeam 조사 시스템에 있습니다. - 방사선-제어 실에서 자동 무대, 방사선 실 (그림 4E)에서 모니터에 투사 같은 이미지 아래에 있는 현미경에서 모니터 이미지에 따라 동물의 위치를 미세 조정할.
- 방사선에 대 한 소프트웨어의 조사 버튼 클릭 하 여 microbeam 방사선을 대상.
참고: 그림 4F의 예에서 우리 머리 지역에서 인 두 대상 및 microbeam 탄소 이온의 적절 한 수를 가진 비추는. 샘플을 통과 하는 이온 입자의 수는 콘솔과 조사 소프트웨어에 연결 하는 이온 카운터 시스템을 사용 하 여 계산, 하므로 방사선 이온 입자의 원하는 수의 배달 후 중지 됩니다. - 전용된 시트에 기록 된 각 동물을 찾아서 각 동물을 대상으로 조사를 수행 합니다. 7.8-7.9 단계를 반복 하 여 모든 동물 반구 되었습니다.
- 방사선, 직후 방사선 룸을 입력 하 고 자동 조사 단계를 낮출. 자동 단계에 맞춤 프레임에 샘플을 제거 합니다.
- 5.1-5.3 단계에 설명 된 대로 동물을 수집 합니다.
- 연구의 목적에 따라 대상된 방사선의 효과 평가 하는 데 필요한 행동 및 분자 분석에 실시 합니다.
참고: 단계 3.6에서에서 설명한 운동 분석 결과 운동 성4,9에 방사선의 효과 평가 하기 위한 효과적인 방법입니다.
8. 반복된 사용에 대 한 웜 시트의 치료
참고: 웜 시트 수 반복적으로 10 배 이상9 동물에 어떤 불리 한 영향을 미칠 경우 사용 청소 하 고 같이 사용 후 제대로 소독.
-
청소
- 6 cm 배양 접시에 사용 된 웜 시트를 배치 하 고 전체 시트에 소독된 초순의 약 100 µ L를 놓습니다.
- 라켓 사용 하 여 시트의 표면에 물 gloved 손가락 씻어 흙 먼지, 세균, 음식과 모든 계란 같은 채널에 누워 있다.
- 철저 하 게 일회용 물티슈를 사용 하 여 웜 시트에서 수 분을 닦아냅니다.
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살 균
- 웜 시트를 포함 하는 배양 접시에 70% 에탄올의 약 5 mL를 주입 하 고 저 어 흙을 씻어 gloved 손가락을 사용 하 여 시트의 표면.
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건조
- 70% 에탄올으로 가득 배양 접시에서 칩을 제거 하 고 자연스럽 게 건조 허용.
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스토리지
- 건조 후, 웜 시트 멸 균 페 트리 접시에 놓고 그것을 커버 합니다. 시트 또한 70% 에탄올으로 가득 멸 균 페 트리 접시에 저장할 수 있습니다.
참고: 그것은 덮개 필름 사용, 후 처리 하지만 그들은 다시 사용 될 것 이라면 그들을 청소 벌레 시트 다 좋습니다. 그러나, 주름 커버 필름에 개발 하는 경우 사용 후 그것은 더 이상 동물의 탈수에 따른 칩 준수 것 이다 그리고 그러므로 대체 되어야 한다.
- 건조 후, 웜 시트 멸 균 페 트리 접시에 놓고 그것을 커버 합니다. 시트 또한 70% 에탄올으로 가득 멸 균 페 트리 접시에 저장할 수 있습니다.
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Representative Results
활성 C. 선 충 개인은 초박형, wettable PDMS, 미세 칩 (웜 시트)를 사용 하 여 성공적으로 움직일 수 있습니다. 우리는 프로토콜 섹션 3에에서 설명 된 대로 웜 시트를 씰링을 위한 다른 커버 영화의 적합성을 조사. 커버 영화의 씰링 효과 평가 하려면 우리는 커버 유리를 사용 하 여 칩에 동원 정지 후 동물 3 h의 운동 성 결정 (두께: 130-170 µ m), 애완 동물 필름 (두께: 125 µ m), 및 PS 필름 (두께: ~ 130 µ m), 각각. 그림 5에서 보듯이 3 h 및 동물 PS 영화 웜 시트에 자유롭게 움직일 수 제어 동물 사이 운동 (바디 벤드)에 상당한 차이가 있었습니다. 반면, 운동 성 동물 동봉 하는 커버 유리 아래에 크게 감소 되었다. 일부 동물 등장, 건조는 커버 유리는 물방울 격퇴 하는 것을 건의 가까운 인감을 방지 하 고 동물 들을 수 있도록 부분적으로 건조, 운동 성 감소의 결과로. 애완 동물 영화를 사용 하 여 동봉 하는 동물의 운동 성 또한 크게 감소 했다. 비록 아무 건조 관찰 했다, 동물 들의 운동 성 경향이 균일 하 게, 감소 제안 하는 낮은 산소 투과율 (~ 30 mL / [24 h·m²· MPa]),이 약 100 배 보다 낮은 PS의 동물 질 식 시킨. 이러한 결과 PS 커버를 영화 웜 시트에서 동물을 묶는 데 사용 해야 합니다 것이 좋습니다.
우리는 또한 관찰 이미징 지역별 microbeam 조사를 수행 하 고 웜 시트 기술 적용. 온 칩 immobilization 물 보존 및 아무 autofluorescence 웜 시트를 사용 하 여 라이브 조건 현미경 관찰에 적합 했다. 예를 들어 우리 C. 선 충, 취재 원 유전자 표현 했다 칼슘 표시기 모든 몸 벽 근육 세포에서 GCaMP3.35의 HBR4 스트레인11 기법 적용. 우리는 ≤3 일 동물 공간을 약간 구 부 수 50 µ m 차원의 미세 채널 웜 시트에 부 화 후에 젊은 성인 동물에 모든 몸 벽 근육 세포의 활동을 관찰. GCaMP3.35 신호 강도 HBR4 스트레인에 시체 벽 근육 세포의 수축에 해당합니다. 캘리포니아2 + 파 전파 해당 근육 활동 하는 (비디오 1) 관찰 명확 하 게 되었다. 또한, 우리가 벌레 시트에 아무 autofluorescence 했다 마지막 단계에 표시 된 대로 확인 (~ 10 최근 s) 비디오 1의. 이 방법에서는, 무감각을 위한 필요의 부족 라이브 조건에서 관찰 해야 근육 세포의 생리 적인 활동을 허용.
또한, 우리 선 충 C. 개인의 지역별 microbeam 방사선에 대 한 웜 시트 적용. 웜 시트에 여러 개의 연속 미세 채널 허용 여러 동물 들을 짧은 시간 (30 분 20에 ≥20 동물 (그룹 분석 결과 대 한 충분 한)의 순차적 조사 되므로 마 취에 대 한 필요 없이 동시에 움직일 수 개인)입니다.
그림 1 : 웜 시트의 도식. (A) 규모는 미국의 1 센트 동전과 벌레 시트의 개요. 웜 시트 되었고 300 µ m 두께 15 m m, 길이 15 m m. (B) 웜 시트의 표면 포함 25 연속 미세 채널 (깊이 70 µ m; = 너비 = 60 µ m; 길이 = 8 m m). 하단 커버 필름, 웜 시트 및 커버 필름으로 구성 된 샘플의 (C) 회로도 (D) 웜 시트 PDMS에서 만든 소프트, 울트라 얇은 시트 이며, 평평한 핀셋으로 곤란에 의해 구부려 질 수 있다. 여러 채널에 여러 동물의 (E) 예. (F) 백 금 선택으로 추진 하 여 미세 채널의 확장. 채널의 탄성 동물을 부드럽게 덮여 있을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : C. 선 충의 형태 몸. (A) 야생-타입 (N2) C. 선 충 NGM 접시에. (B) NGM 접시에 비정상적인 모양으로 unc-119 돌연변이. (C) unc-119 돌연변이 웜 시트의 미세 채널에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 회로도의 현미경 관찰의 라이브 선 충 C. 개인 웜 시트에. 영상 관측을 위한 stereomicroscope 시스템의 (A) 회로도 벌레의 현미경 관찰의 개략도 (B) 시트 바깥쪽 살 선 충 C. 개인. 벌레의 단면 보기 (C) 시트 바깥쪽 살 선 충 C. 개인 현미경 스테이지에 배치. W.D.는 현미경의 작동 거리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Collimating QST 다카사키 및 타겟된 microbeam 조사 절차에서 microbeam 시스템의 회로도 살 선 충 C. 개인. (A) collimating microbeam 조사 시스템5, 여러 중 이온 입자 QST 다카사키의 티아라에 설치 된 azimuthally 다양 한 필드 싸이 클 로트 론에서 가속을 사용할 수 있는 개요. (B) 빔 출구 조사에 대 한 자동 무대의 개요. (C) collimating microbeam 시스템의 자동 스테이지 설정 샘플. 방사선 실에서 실시 하는 조사 샘플의 수직 위치 (D). 방사선-제어 실에서 실시 (E) 조사 면적의 조정. (F) 라이브 C. 선 충의 타겟 microbeam 방사선. 인 두 클릭-에 대상 위치로 이었고 방사선 버튼을 누르면 반구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : C. 선 충 커버 유리, 폴 리 에스테 르 (PET) 영화, 폴리스 티 렌 (PS) 필름을 사용 하 여 칩에 동원 정지 후의 운동 성. 온 칩 동원 정지 후 또는 3 h NGM 플레이트 (제어)에 대 한 무료 운동 후 막대 동물 3 h의 평균 신체 굴곡을 나타냅니다. 10 동물 시험 되었다 그리고 몸 굴절 각 그룹의 사이에서 평균 했다. 마지막으로, 5 개의 독립적인 실험에서 데이터는 각 그룹에 대 한 평균 했다. 오차 막대는 5 개의 독립적인 실험의 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 모든 데이터는 (*) 0.05 또는 0.01 (*)의 수준에서 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 분석 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: 근육 활동의 영상 관측의 예제 C. 선 충 웜 시트에. 칼슘 이온 파 번 식 HBR4 C. 선 충 개인 웜 시트에 크롤 링 하는 동안 몸 벽 근육 세포의 수축에 해당. 마지막 ~ 10의 필드 밝은 조명 아래에서 관찰 되었다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
보조 파일 1: 종이 (microbeam 방사선 버전)의 전용된 시트의 예. 채널에 각 동물의 위치를 나타내는 화살표를 그립니다. 화살표의 방향으로 머리에 해당합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Wettable PDMS 미세 칩을 사용 하 여 라이브 조건 C. 선 충 의 온 칩 immobilization 여러 동물의 효율적인 타겟된 microbeam 조사를 수 있습니다. 처리 및 건조 방지 기능을 추가의 용이성 microbeam 방사선, 뿐만 아니라 여러 행동 분석에서이 시스템을 응용 프로그램에 적합 하 게. 이러한 웜 시트 이미 상용화 하 고 쉽게 얻어질 수 있다. 후 각 칩 등 기존의 미세 칩에 연결 된 동물, 동물, 수집 하 고 어려운 닫힌된 미세 채널에서 계란의 막힘을 포함 하 여 문제 및 따라서 이러한 칩 따라서 일회용, 수 하는 경향이 있다 비용을 증가. 반면, 현재 웜 시트에 미세 채널은 열려, 동물 수집을 쉽게. 이러한 웜 시트 사용할 수 있습니다 따라서 반복적으로, 그들을 더 경제에 게 하.
PDMS 미세 칩에서 최근 기술 혁신 구조적 복잡성과 많은16,,1819,20,21에서 증가 추세를 보여왔다 22,23. 그러나, 우리는 그것이 간단 하 고 사용 하기 쉬운 시스템을 만드는 것이 중요 믿습니다. 실제로, 기존의 큰 미세 칩19,20,21,,2223 진공 펌프, 작은 크기의 첨부 파일을 필요로 하는 사용 하 여 달리 그리고 웜 시트의 심플한 디자인 수는 제한 된 공간 내에서 쉽게 실시 하는 절차.
웜 시트의 물 보존 성능 장기 관측을 실시 될 수 있습니다. 또한, 시트의 두께 이온 입자를 이온 입자의 정확한 수를 가진 선 충 C. 개인 라이브에 적용할 타겟된 조사 활성화 샘플을 통과 수 있습니다. 웜 시트의 이러한 장점은 크게 생물학 실험에 대 한 가능성을 확장 했습니다.
우리는 생물학 그들의 실험 및 분석의 효율성을 개선 하기 위해 새로운 장비 및 방법을 개발 하는 것이 중요 하다 고 믿습니다. 웜 시트와 microbeam 조사 소프트웨어 마음에,이 목적으로 개발 된 하 고 그들의 원래 목적을 넘어 미래의 혁신적인 실험의 성공에 기여할 가능성이.
우리의 지식 최선을 다 해 우리의 그룹 전세계이 기술을 개발 하기 위해 처음 이다. 그러나, 표준화 된 사용 미래에 따라서 특정 세포/조직 내부 프로세스에서의 역할을 돕는 라이브 조건 동물 대상된 microbeam 방사선의 응용을 촉진 한다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 박사 아츠 시 Higashitani 귀중 한 토론에 대 한 C. 선 충 과 박사 유야 핫토리, 유이치로 요코타, 야스히코 고바야시의 치료에 관한 친절 상담 감사. 저자는 꼬마 유전 센터 C. 선 충 및 대장균의 긴장을 제공 하기 위한 감사 합니다. 우리는 방사선 실험 그들의 종류에 대해 QST 다카사키에서 티아라의 싸이 클 로트 론의 승무원을 감사합니다. 우리는이 원고 초안을 편집 하기 위해 박사 수잔 퍼니스를 감사 합니다. 이 연구는 일부 KAKENHI (보조금 번호 JP15K11921 및 JP18K18839)에 의해에서 지원 JSP 석사
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
| Mercury Light Source | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | U-LH100HG | The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores. |
| SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-FYFPHQ | Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain. |
| Digital Camera High Speed EXILIM | CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan | EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera. | |
| Office 2013 | Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA | EXCEL Software used for statistical analyses |
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