Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Immobilisering af levende Caenorhabditis elegans enkeltpersoner ved hjælp af en ultra-tynd Polydimethylsiloxan mikrofluid Chip med væskeophobning

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59008
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Summary

En serie af immobilisering metoder er blevet etableret til at tillade den målrettede bestråling af levende Caenorhabditis elegans enkeltpersoner ved hjælp af en nyligt udviklede ultra-tynde Polydimethylsiloxan mikrofluid chip med væskeophobning. Denne roman på chip immobilisering er også passende for imaging observationer. Detaljeret behandling og applikationseksempler chip er forklaret.

Abstract

Stråling er almindeligt anvendt til biologiske applikationer og ion-beam avlsdyr, og blandt disse metoder, microbeam bestråling udgør et effektivt middel til at identificere radiosensitive websteder i levende organismer. Dette papir beskriver en række på chip immobilisering metoder udviklet for målrettet microbeam bestråling af levende individer af Caenorhabditis elegans. Især behandlingen af Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluid chips, som vi tidligere har udviklet til at immobilisere C. elegans enkeltpersoner uden behov for anæstesi er forklaret i detaljer. Denne chip, omtales som en orm ark, er modstandsdygtige at tillade mikrofluid kanalerne skal udvides, og elasticitet tillader dyr at være indhyllet forsigtigt. Også, på grund af selvstændig adsorption kapaciteten af PDMS, dyr kan være forseglet i kanaler ved at dække overfladen af ormen ark med et tyndt dække film, hvor dyr ikke er skubbet ind i kanalerne til kabinet. Ved at dreje dækslet film over, kan vi nemt indsamle dyr. Derudover orm ark viser væskeophobning og tillader C. elegans enkeltpersoner udsættes for mikroskopiske observation i lange perioder under live betingelser. Arket er derudover kun 300 µm tykt, så tunge ioner som kulstof ioner passere arket omslutter dyr, således at ion partiklerne til at blive opdaget og de anvendte strålingsdosis skal måles nøjagtigt. Fordi udvalg af cover film bruges til omslutter dyrene er meget vigtigt for vellykket langvarig immobilisering, vi gennemførte udvælgelse af passende dækning film og viste en anbefalede en blandt nogle film. Et ansøgning eksempel på chippen indførte vi imaging observation af muskulære aktiviteter af dyr omslutter mikrofluid kanalen af arket orm, samt microbeam bestråling. Disse eksempler viser, at ormen ark høj grad har udvidet mulighederne for biologiske eksperimenter.

Introduction

Stråling, herunder x-stråler, gammastråler, og heavy-ion stråle, er meget udbredt for biologiske applikationer som i kræftdiagnose og behandling og for ion-beam avl. Talrige undersøgelser og tekniske udvikling i øjeblikket fokuserer på virkningerne af stråling1,2,3. Microbeam bestråling er et kraftfuldt middel til at identificere radiosensitive websteder i levende organismer4. Den Takasaki avanceret stråling Institute af nationale forskningsinstitutter for Quantum og radiologisk videnskab og teknologi (QST-Takasaki) har udviklet en teknologi til at bestråle individuelle celler under mikroskopisk observation ved hjælp af tung-ion microbeams5, og har etableret metoder for at aktivere målrettede microbeam bestråling af flere model dyr, såsom nematode Caenorhabditis elegans4,6, silkeorme7og Oryzias latipes (japanske medaka)8. Målrettede microbeam bestråling af det ødelægge C. elegans tillader den effektive knockdown i specifikke regioner, såsom nerve ring i regionen hoved, hvilket bidrager til at identificere roller af disse systemer i processer som bevægelse.

En metode til-chip immobilisering af C. elegans enkeltpersoner uden behov for anæstesi er blevet udviklet for at muliggøre microbeam bestråling4. Derudover for at forbedre mikrofluid chips anvendes i den tidligere undersøgelse4, har vi for nylig udviklet vanddispergerbare, ion-gennemtrængelige, Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluid chips, omtales som orm ark (Se Tabel af materialer), for immobilisere C. elegans personer9. Disse omfatter ultra-tynd blød ark (tykkelse = 300 µm; bredde = 15 mm længde = 15 mm) med flere (20 eller 25) lige mikrofluid kanaler (dybde = 70 µm; bredde = 60 µm eller 50 µm; længde = 8 mm) på overfladen (figur 1A-D). Mikrofluid kanalerne er åbne og tillade flere dyr til at blive lukket inde i dem samtidig (figur 1E). Arkene er modstandsdygtige at tillade mikrofluid kanalerne skal udvides (ved ~ 10%, figur 1F), og elasticitet tillader dyr at være indhyllet forsigtigt. Også, på grund af selvstændig adsorption kapaciteten af PDMS, dyr kan være forseglet i kanaler ved at dække overfladen af ormen ark med et tyndt dække film, hvor dyr ikke er skubbet ind i kanalerne til kabinet. Ved at dreje dækslet film over, kan vi nemt indsamle dyr.

Kanalerne ondt ikke orme, når de er ved at blive lukket, eller når de er indsamlet. Derudover arkene er lavet af PDMS, som er det væsentlige hydrofobe, men væskeophobning kan opnås ved at videregive hydrofiliciteten til materialet. Væskeophobning og tykkelse er gunstige egenskaber orm ark. Vand-retention kapacitet forhindrer dehydrering af dyrene efter forlænget immobilisering og gør det muligt for langsigtede observationer skal udføres.

Desuden, som tidligere beskrevet9, er arkene kun 300 µm tykt, så tunge ioner som kulstof ioner (med et udvalg af omkring 1 mm i vand) til at passere gennem arket omslutter dyr. Dette giver mulighed for ion partikler til at blive opdaget og de anvendte strålingsdosis skal måles nøjagtigt. Derudover orm ark kan genbruges og er dermed økonomisk. Med den konventionelle injektion metode, dyrene lukket er undertiden døde og de kan ikke tages ud af kanalen. deres æg kan også blokere kanalerne. Dette gør chippen ubrugelig. Chips er derfor dybest set engangs og cost-benefit-forholdet er dårligt.

I det foreliggende papir, vi beskriver i detaljer en række metoder til-chip immobilisering af levende C. elegans enkeltpersoner ved hjælp af orm ark. Gennem bevægelse assays af dyr 3 h efter-chip immobilisering vurderet vi egnet dækning film. Derudover viste vi eksempler på-chip immobilisering for både imaging observationer og microbeam bestråling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. stammer og vedligeholdelse

  1. Vælg en egnet stamme af C. elegans og Escherichia coli (mad) afhængigt af formålet med forsøget.
    Bemærk: I det foreliggende papir, wild-type N210C. elegans (fig. 2A) er generelt bruges, og HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 er kun ansat til imaging assay. E. coli OP50 blev brugt som mad til C. elegans. Nogle mutanter med abnorm kropsform, såsom unc-119(e2498) III mutant med en snoet form (figur 2B), kan også være lukket i lige mikrofluid kanaler (figur 2C).
  2. Vedligeholde C. elegans ved 20 ° C på 6 cm petriskåle, der indeholder 10 mL af ødelægge vækstmediet (NGM) spredes med overnatning-inkuberes (37 ° C) E. coli som tidligere beskrevet10. Hvis det er muligt, synkronisere udviklingsstadier C. elegans fra den embryonale fase.
  3. Bruge velnærede voksne dyr, ca 3-4 dage efter udklækningen med en bredde på omkring 50-60 µm, som er optimalt egnet til størrelsen af mikrofluid kanalerne i orm ark.

2. udvælgelse af stødpudeopløsning for-chip immobilisering

  1. For vanddispergerbare orm ark, bruge en stødpudeopløsning afhængigt af formålet med forsøgene.
    NOTE: Egnet buffer løsninger for-chip immobilisering på PDMS mikrofluid chips har været defineret tidligere9 og de følgende buffer løsninger blev vist at have nogen effekt på motilitet af dyrene efter immobilisering: S basal buffer løsning (5.85 g NaCl, 1 mL af kolesterol (5 mg/mL ethanol), 50 mL af 1 M pH 6.0 kalium fosfat, H2O til 1 L; steriliseres ved autoklavering)10 indeholder en stor mængde af NaCl, M9 fosfatstødpudeopløsningen (5 g NaCl , 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 1 mL 1 M MgSO4, H2O til 1 L; steriliseres ved autoklavering)10, wash bufferopløsning (5 mL 1 M pH 6.0 kalium fosfat, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 0,5 g pf gelatine, H2O til 1 L; steriliseres ved autoklavering)12 indeholdende gelatine , og ultrarent vand9. I det foreliggende papir, wash bufferopløsning bruges typisk og S basal stødpudeopløsning er kun ansat til evaluering på chip immobilisering ved hjælp af forskellige cover film i afsnit 3.
  2. For konventionelle mikrofluid chips uden befugtningen, bruge en wash bufferopløsning, som giver det mest effektive middel til at opretholde fugt i mikrofluid kanalerne af chippen og dermed forhindrer udtørring af C. elegans enkeltpersoner ( Uanset befugtningen af mikrofluid chips).

3. udvælgelse af passende dækning film for-chip immobilisering

  1. Forberede forskellige cover film som følger. Baseret på nem håndtering, skære følgende gennemsigtig, biokompatible dække film til en passende størrelse (dvs., bredde på 10-15 mm og længde på 30-50 mm): 130-170 µm tykt dække glas, 125 µm tykt polyester (PET) film og ~ 130 µm tykt polystyren (PS) film.
  2. Udføre 3 h på chip immobilisering bruger forskellige cover film som følger. Baseret på trin 4.1-4.6, vedlægge ≥10 vasket voksne dyr (3,5 dage efter klækning) på arket orm benytter hver dække film, henholdsvis, og orlov til 3 h.
  3. Til sammenligningsformål, tillade 3 h frie bevægelighed som følger. Sted ≥10 vasket voksne dyr på en 3,5 cm plade der indeholder 3 mL frisk NGM, dæk med et låg, og orlov til 3 h.
  4. Indsamle dyr straks efter 3 h-chip immobilisering ifølge trin 5.1-5.3. Fjerne dækslet film fra arket orm og tilføje en dråbe af stødpudeopløsning til hvert dyr. Afhente dyrene svømme i slipværktøjet ved hjælp af en platina picker og overføre dem til en 3,5 cm plade der indeholder 3 mL frisk NGM uden mad (assay plade).
  5. Indsamle dyr efter 3 timer med fri bevægelighed. Tilføj en dråbe af stødpudeopløsning til hvert dyr. Afhente dyrene svømme i slipværktøjet NGM plade og overføre dem til en assay plade ved hjælp af en platina picker.
  6. Evaluere virkningerne af cover film på motilitet (bevægelse analyse).
    1. Mindst 5 min efter overførsel til assay plade, grev ' body bøjninger (defineret som antallet af bøjninger i regionen forreste krop med 20-s intervaller) manuelt under et mikroskop13.
    2. Udføre locomotion assays fem gange uafhængigt for hver dække film.
      Bemærk: I forsøgene vist i de repræsentative resultater, 10 dyr blev evalueret til hvert eksperiment, hvor flere dyr blev lukket samtidig, sammenlignet med kun fem dyr tælles i den tidligere undersøgelse13.
    3. Beregne det gennemsnitlige antal krop bøjninger for de 10 dyr i hver gruppe for hvert forsøg. Derefter gennemsnitlige værdier fra fem uafhængige forsøg at evaluere effekt af-chip immobilisering. Analysere data statistisk ved hjælp af en envejs variansanalyse (ANOVA) test i et regneark software på betydning 0,01 og 0,05.
      Bemærk: Baseret på disse eksperimenter, var en PS dække film med høj ilt permeabilitet anses for egnede (se de repræsentative resultater). Disse PS film er inkluderet med orm ark. PET film, som har lavt iltindhold permeabilitet, var ikke anses for egnede, fordi dyrene tendens til at kvæle hvis dækket med det under langvarig immobilisering på orm ark. Det er også vigtigt at dække filmen ikke bryder under en række procedurer; glas dækker var derfor også uegnede (se de repræsentative resultater).

4. chip immobilisering

Bemærk: Engangs, sterile handsker skal bæres for at undgå at forurene orm ark.

  1. Placer en tynd gennemsigtig plade som et PS eller glas dækning film, som har ingen autofluorescence, til brug som en bunden dække film, på den eksperimentelle skrivebord eller mikroskopiske scenen. Placer en orm ark forsigtigt på bunden dække film ved hjælp af flad pincet.
    Bemærk: Ud over orm ark med 60 µm-dækkende mikrofluid kanaler (egnet til voksne 3-4 dage efter klækning), ark med 50 µm-wide kanaler (velegnet til unge voksne 3 dage efter klækning og mutanter med lille krop i voksen fase) kan også være ansat. Vælg et passende ark baseret på størrelsen af de dyr, der skal bruges.
  2. For at indsamle dyr, afhente en individuel voksen C. elegans fra kultur plade under et stereomikroskop ved hjælp af en platina picker. Gentag processen, hvis flere dyr er nødvendige.
  3. Vask dyr for at fjerne mad (bakterier).
    1. Placere mindst tre dråber (5 µL dråber) af stødpudeopløsning på overfladen af en 6 cm ubehandlede (vandafvisende) petriskål.
    2. Overføre dyr til et slipværktøj, ved hjælp af en platina picker og tillade dem at fjerne enhver mad ved at svømme. Vaske dem to gange i to separate dråber, og skyl derefter dyrene i en anden dråbe.
      Bemærk: Det er nødvendigt at praktisere denne procedure for at være i stand til at udføre det hurtigt før han udfører nogen eksperimenter.
  4. Drop 2-3 µL stødpudeopløsning på overfladen af en orm ark. Afhente de vasket dyr fra slipværktøj på petriskålen og overføre dem til en droplet på arket orm.
  5. Vedlægge dyr i mikrofluid kanaler som følge. Placer en PS dække film over orm ark ved hjælp af flad pincet og tryk forsigtigt over kanaler fra den ene ende af ark til den anden at bevare fugt (som tidligere beskrevet4,9).
    Bemærk: Dyr er tilfældigt omsluttet af kanaler. Dråber, der indeholder dyr er spredt på tværs af arket ormen ved at dække ark, hvilket resulterer i dråber udvides bredt over flere kanaler. Hvert dyr kan være omsluttet af en af disse kanaler. Det vigtige punkt vedrørende brug af arket orm for-chip immobilisering er, at flere kanaler er til rådighed over et bredt område.
  6. Umiddelbart efter omslutter dyrene i mikrofluid kanalerne, bekræfte, at de er i live ved at kontrollere for bevægelse af hovedet under et mikroskop (fx 1 x eller 2 x forstørrelse).
  7. Optage dyrets holdning, på samme tid som udfører trin 4.6 og Bemærk følgende på en dedikeret ark papir (supplerende fil 1): antallet af kanalen, hvor dyret er lukket; placeringen af hvert dyr i kanal (venstre/center/højre); og retning af hovedet.
  8. Tegne en pil for at markere placeringen af hvert dyr i den engelske kanal, med retningen af pilen svarer til dyrets hoved.
    Bemærk: Kanalnumre (f.eks. 1, 5, 10, 15, 20, 25) er indgraveret på overfladen af arket orm i nærheden af de venstre og højre kanter af mikrofluid kanalerne (figur 1B). Disse oplysninger på dedikerede ark tillader dyr at være placeret hurtigt, at gøre processen mere effektiv, og også hjælper med at forhindre stråling lækage under efterfølgende trin.

5. opkrævning af dyr fra en orm ark

  1. Umiddelbart efter immobilisering, fjerne dækslet film fra ormen ark ved hjælp af flad pincet.
  2. Drop 10-15 µL bufferopløsning på de mikrofluid kanaler omslutter dyrene og observere dyrene begyndt at svømme i dråber under et stereomikroskop.
    Bemærk: Dyrene starter svømning i den nye slipværktøj på deres egen uden nogen yderligere pres, hjælp eller skubbe. Bare droppe nogle buffer på toppen af dem er nok til at gøre dem svømme ud af kanalen. Et dyr kan være ude af stand til at svømme i et slipværktøj, hvis den har været yderst beskadiget af bestråling i trin 7,9 eller af immobilisering processen i trin 4,2-4,5, selvom det er sjældent. Derudover hvis dyret forbliver knyttet til filmens cover, når det er fjernet, tilføje dråber ind på filmens cover i stedet for i kanalerne.
  3. Afhente dyrene svømme i slipværktøjet ved hjælp af en platina picker og placere dem på en assay plade.

6. anvendelsen af ormen ark for imaging observationer

Bemærk: Orm ark kan være almindeligt anvendt i mikroskopiske observationer. Chippen kan fastholde vand og påvirker ikke motilitet af C. elegans enkeltpersoner efter 3 h på chip immobilisering9. Derudover har chippen sig selv ingen autofluorescence, hvilket gør den velegnet til brug i fluorescens imaging assays. Et eksempelprogram til fluorescens imaging assay er givet nedenfor.

  1. Vælg et fluorescens mikroskop og montere en digital kamera eller digital videokamera på mikroskop til at fange billeder eller videoer, henholdsvis (fig. 3A).
    Bemærk: Arbejde afstand (WD) af mikroskop er mere end 0,2 mm afhængig af formålet objektivet specifikation (Se figur 3B, C). Specifikation af fluorescens mikroskop system, der anvendes i dette papir er vist i Tabel af materialer. Specifikationen er imidlertid ikke begrænset til vores eksempel fordi det afhænger af formålet med observation eller / og brugere.
  2. Vælg en fluorescerende stamme af C. elegans og vedligeholde som beskrevet i afsnit 1.
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt at observere krop-væg muskulære kontraktion (Se repræsentative resultater), bruge unge voksne HBR411C. elegans, hvor en reporter gen anvendes til at udtrykke calcium indikator GCaMP3.35 i alle krop-væg muskelceller. Det er vigtigt at bruge unge voksne (≤3 dage efter klækning), der er tyndere end bredden af mikrofluid kanalerne (50 eller 60 µm) af arket orm. Den lille grad af clearance betyder, at dyrene kan bøje lidt, gør det muligt at observere muskelsammentrækning og forlængelse under gennemsøgning, ved hjælp af en indikator for calcium-ion.
  3. Udføre kabinet af dyr efter immobilisering proceduren i punkt 4.
  4. Observere fluorescerende steder af dyr (f.eks.grønne fluorescerende proteiner-mærket stammer) ved hjælp af et fluorescens mikroskop, og fange billeder ved hjælp af en digital kamera monteret på mikroskopet.
    Bemærk: Følg tidligere etablerede metoder14,15,16siden mikroskop observation metoder (herunder fluorescens observation) og specifikation af mikroskop system afhænger Formålet med observation.
  5. Billede calcium-ion bølgeudbredelse ved hjælp af video erhvervelse for at observere dynamisk aktiviteter, såsom krop-væg muskelsammentrækning og udvidelse i HBR4 orme (Video 1).

7. anvendelse af ormen plader til microbeam bestråling

Bemærk: Kolliminerende microbeam bestråling system5 kan bruge flere tung-ion partikler accelereret fra den azimuthally varierende felt cyclotron installeret på Takasaki Ion acceleratorer til avanceret stråling ansøgning (TIARA) facilitet for QST-Takasaki (figur 4A). Der er en automatisk etape for bestråling under stråle exit (fig. 4B). Proceduren for tung-ion microbeam bestråling af C. elegans ved hjælp af dette system er som følger.

  1. Find orm ark vedlagt flere dyr på en skræddersyet til microbeam-bestrålingsanlægget aluminiumsramme og sæt den på den automatiske scene for bestråling (fig. 4C).
  2. Hæve bestråling prøven (dvs, dyr omsluttet af en orm ark på en ramme), at umiddelbart under (~ 2 mm) strålen exit baseret på skærm billede fra et mikroskop, beliggende under den automatiske fase (figur 4D).
  3. Efter lodret positionering, Find hvert dyr til målet med microbeam bestråling ved hjælp af skræddersyet software til målrettede bestråling af dyr og cellekulturer. For at finde hvert dyr omsluttet af mikrofluid kanalen, henvise til den dedikerede ark beskrevet i trin 4,7-4.8 (Se supplerende fil 1) og bekræfte kanalnummer nær de venstre og højre kanter af kanaler.
  4. Styre den automatiske scene i X og Y retninger at placere dyr lige under bjælken exit ved hjælp af en fjernbetjening system og en lasermus drives med bestråling software.
  5. Groft tune området bestråling ved at se fremskrivning fra mikroskop placeret under den automatiske fase af prøven og flytte markøren til bestråling position af dyr skal målrettes.
  6. Efter ru positionering, afslutte og lukke bestråling værelse og flytte til det tilstødende kontrolrummet at undgå bestråling af operatørerne.
  7. Sæt det ønskede antal ion partikler for en bestråling procedure, svarende til bestråling af en specifik region af dyret, bruger konsollen kædet sammen med en ion-counter system.
    Bemærk: Dette består af en plastik scintillator og en photoelectron multiplikator i kolliminerende microbeam bestråling system.
  8. Fra bestråling-kontrolrummet, finjustere placeringen af de dyr, der er baseret på skærm billede fra mikroskop placeret under den automatiske fase, som er det samme billede projiceret på skærmen i bestråling værelse (figur 4E).
  9. Målrette microbeam bestråling ved at klikke på knappen bestråling af softwaren til bestråling.
    Bemærk: I den eksempel vist i figur 4F, vi målrette svælget i regionen hoved og bestråle med et passende antal microbeam kulstof ioner. Fordi antallet af ion partikler passerer sample tælles ved hjælp af en ion-counter system forbundet til konsollen og bestråling software, er bestråling stoppet efter levering af det ønskede antal ion partikler.
  10. Find hvert dyr registreres på arket dedikeret og gennemføre målrettede bestråling til hvert dyr. Gentag trin 7,8 og 7,9, indtil alle dyr er blevet bestrålet.
  11. Straks efter bestråling, Angiv bestråling værelse og sænk den automatiske bestråling fase. Fjerne prøve på rammen custom-made beliggende på den automatiske scene.
  12. Indsamle dyr, som beskrevet i trin 5.1-5.3.
  13. Foretage adfærdsmæssige og/eller molekylære analyser, som kræves for at evaluere virkningerne af den målrettede bestråling, afhængigt af formålet med undersøgelsen.
    Bemærk: Locomotion analysen beskrevet taktfast 3.6 er en effektiv metode til at vurdere effekten af bestråling på motilitet4,9.

8. behandling af ormen ark til gentagen brug

Bemærk: Orm ark kan være anvendes mindst 10 gange9 gentagne gange med ingen skadelige virkninger på dyrene, hvis rengøres og steriliseres ordentligt efter brug som følger.

  1. Rengøring
    1. Placer den brugte orm ark på en 6 cm petriskål og slip omkring 100 µL steriliseret ultrarent vand på hele arket.
    2. Padle vand på overfladen af arket med behandskede fingre til at vaske af snavs som støv, bakteriel mad og nogen æg bliver lagt i kanalerne.
    3. Tørre fugt ned arket orm grundigt ved hjælp af engangs klude.
  2. Sterilisation
    1. Injicere ca. 5 mL 70% ethanol i petriskålen, der indeholder ormen ark og padle overfladen af arket med behandskede fingre til at vaske snavset.
  3. Tørring
    1. Fjern chipsene fra petriskålen fyldt med 70% ethanol og lad tørre naturligt.
  4. Opbevaring
    1. Efter tørring, Placer orm ark på en steril petriskål og dække det. Plader kan også være gemt på en steril petriskål fyldt med 70% ethanol.
      Bemærk: Det er bedre at bortskaffe dække film efter brug, men hvis de skal genanvendes, rense dem som gjort i arket orm. Men hvis folder udvikler på filmens cover efter brug vil det ikke længere overholde chip, resulterer i dehydrering af dyrene, og det bør derfor erstattes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aktive C. elegans enkeltpersoner kunne være immobiliseret lykkedes ved hjælp af en ultra-tynd, sprøjtepulver PDMS, mikrofluid chip (orm ark). Vi undersøgte egnetheden af forskellige cover film til tætning arket orm, som beskrevet i afsnit 3-protokollen. For at evaluere effekterne forsegling af cover film, vi bestemt motilitet af dyr 3 h efter-chip immobilisering ved hjælp af dækslet glas (tykkelse: 130-170 µm), PET-folie (tykkelse: 125 µm), og PS film (tykkelse: ~ 130 µm), henholdsvis. Som vist i figur 5, var der ingen signifikant forskel i motilitet (krop bøjninger) mellem kontroldyr tilladt at færdes frit i 3 h og dyr omsluttet af ormen ark med PS film. Derimod blev motilitet reduceret betydeligt i dyr lukket under et dække glas. Nogle dyr syntes at have tørret ud, hvilket tyder på at dække glas frastødt slipværktøjet og forebygge en tæt forsegling tillader dyr at delvis tørre ud, hvilket resulterer i reducerede motilitet. Motilitet af dyr lukket ved hjælp af en PET-folie også betydeligt faldt; selv om ingen tørring blev observeret, dyrenes motilitet tendens til at falde jævnt, tyder på, at lav ilt transmission sats (~ 30 mL / [24 h·m²· MPa]), som er omkring 100 gange lavere end det i PS, forårsaget dyr at kvæle. Disse resultater tyder på, at PS dækker film bør bruges til at omslutte dyr på arket orm.

Vi anvendes også orm ark teknik for imaging observationer og udføre område-specifik microbeam bestråling. På chip immobilisering ved hjælp af en orm ark med væskeophobning og ingen autofluorescence var egnet til mikroskopiske observation live betingelser. For eksempel, anvendte vi teknikken HBR4 stamme11 i C. elegans, som en reporter gen udtrykt calcium indikator GCaMP3.35 i alle krop-væg muskelceller. Vi observerede aktiviteter af alle krop-væg muskelceller i unge voksne dyr på ≤3 dage efter udklækning i orm ark med 50 µm-dækkende mikrofluid kanaler, som tillod dyrene plads til at bøje lidt. GCaMP3.35 signal intensitet i HBR4 stammen svarer til sammentrækning af muskelceller krop-væg. Den Ca2 + bølgeudbredelse svarende til den muskelaktivitet var tydeligt observeret (Video 1). Desuden bekræftede vi, at ormen ark havde ingen autofluorescence, som vist i den sidste fase (seneste ~ 10 s) af Video 1. På denne måde, manglen på behov for anæstesi tilladt de fysiologiske aktiviteter af muskelceller skal overholdes på live betingelser.

Desuden, vi anvendte orm ark for område-specifik microbeam bestråling af C. elegans individer. De flere lige mikrofluid kanaler på arket orm tilladt flere dyr til at blive immobiliseret samtidigt, uden behov for anæstesi, således at sekventiel bestråling af ≥20 dyr, (nok til en gruppe assay) i en kort tid (30 min til 20 enkeltpersoner).

Figure 1
Figur 1 : Skematisk af en orm ark. (A) oversigt over en orm ark med en amerikansk 1-centsmønten for skala. Arket orm var 300 µm tykt, 15 mm bredt, og 15 mm lange. (B) overfladen af arket orm indeholdt 25 lige mikrofluid kanaler (dybde = 70 µm; bredde = 60 µm; længde = 8 mm). (C) skematisk af prøver bestående af bund cover film, arket orm og filmens cover. (D) orm ark er en blød, ultra-tynd plade lavet af PDMS, og kan være bøjet ved at klemme med flad pincet. (E) eksempel på flere dyr omsluttet af flere kanaler. ()F) udvidelse af en mikrofluid kanal ved at trykke med en platina picker. Elasticiteten i kanal tillader dyr at være indhyllet forsigtigt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Body form af C. elegans. (A) Wild-type (N2) C. elegans på en NGM plade. (B) en unc-119 mutant med unormal form på en NGM plade. (C) unc-119 mutanter omsluttet af mikrofluid kanalerne af arket orm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Skemaer mikroskop observation af live C. elegans enkeltpersoner omsluttet af arket worm. (A) skematisk af stereomikroskopet system for billedbehandling observationer. (B) skematisk af mikroskop observation af ormen lagen omsluttende live C. elegans individer. (C) sektionsvisning af ormen lagen omsluttende live C. elegans enkeltpersoner placeret på stadiet mikroskop. Sortstencileret angiver den arbejdende afstand af mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Skematisk af kolliminerende microbeam system på QST-Takasaki og målrettede microbeam bestråling procedure for live C. elegans enkeltpersoner. (A) oversigt over den kolliminerende microbeam bestråling system5, som kan bruge flere tung-ion partikler accelereret fra den azimuthally varierende felt cyclotron installeret på TIARA af QST-Takasaki. (B) oversigt over afkørslen stråle og automatisk scenen for bestråling. (C) prøve indstilling på den automatiske fase af den kolliminerende microbeam system. (D) lodret positionering af bestråling prøve udført i bestråling værelse. (E) finindstilling af bestråling område gennemført i bestråling-kontrolrummet. (F) målrettet microbeam bestråling af levende C. elegans. Svælg var klikkede på som de målrettede stilling og bestrålet ved at skubbe knappen bestråling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Motilitet af C. elegans efter-chip immobilisering ved hjælp af dækslet glas, polyester (PET) film og polystyren (PS) film. Angiver gennemsnitlig krop bøjninger af dyr 3 h efter-chip immobilisering eller fri bevægelighed for 3 h på en NGM plade (kontrol). Ti dyr blev undersøgt og krop bøjninger var gennemsnit blandt hver gruppe. Endelig, data fra fem uafhængige forsøg var et gennemsnit for hver gruppe. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien af fem uafhængige forsøg. Alle data blev analyseret ved hjælp af en-vejs ANOVA på 0,05 (*) eller 0,01 (*) signifikansniveau. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1
Video 1: eksempler på imaging observationer af muskulære aktiviteter i C. elegans omsluttes af en orm ark. Calcium-ion bølgeudbredelse svarende til sammentrækning af muskelceller krop-væg under kravle i HBR4 C. elegans enkeltpersoner omsluttet af en orm ark. De sidste ~ 10 s blev observeret under lysfelt belysning. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Supplementary Figure 1
Supplerende fil 1: eksempel på dedikerede ark papir (microbeam bestråling version). Tegne en pil for at angive placeringen af hvert dyr i kanalen. Retning af pilen svarer til hovedet. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På chip immobilisering af C. elegans live betingelser ved hjælp af en vanddispergerbare PDMS mikrofluid chip giver mulighed for effektiv målrettede microbeam bestråling af flere dyr. Nem håndtering og funktioner til at forhindre udtørring gøre dette system velegnet til applikationer, ikke kun i microbeam bestråling, men også i flere adfærdsmæssige assays. Disse orm plader har allerede blevet kommercialiseret og kan hentes nemt. Konventionelle mikrofluid chips, som olfaktoriske chips, er forbundet med problemer, herunder tilstopning af dyr og æg i de lukkede mikrofluid kanaler gør det vanskeligt at indsamle dyr, og dermed sådanne chips har tendens til at være disponible, hvorved øge omkostningerne. Derimod er mikrofluid kanalerne i den orm strømtæppe åbne, hvilket gør det lettere at indsamle dyr. Disse orm ark kan derfor anvendes gentagne gange, at gøre dem mere økonomisk.

De seneste teknologiske innovationer i PDMS mikrofluid chips har vist en stigende tendens i strukturel kompleksitet og multifunktionalitet16,18,19,20,21, 22,23. Vi mener imidlertid, at det er vigtigt at gøre ordningen enkel og nem at bruge. Faktisk, i modsætning til brugen af konventionelle store mikrofluid chips19,20,21,22,23 , kræver den vedhæftede fil af en vakuumpumpe, den lille størrelse og enkle design af ormen plader tillade procedurer foretages nemt inden for en begrænset plads.

Vand opbevaring performance orm ark gør det langsigtede observationer skal udføres. Derudover tillader tykkelsen af arket ion partikler passere de prøver, således at målrettede bestråling skal anvendes til levende C. elegans individer med et præcist antal ion partikler. Disse fordele orm ark har stærkt udvidet mulighederne for biologiske eksperimenter.

Vi mener, at det er vigtigt for biologer at udvikle nyt udstyr og metoder for at forbedre effektiviteten af deres eksperimenter og analyser. Ormen ark og microbeam bestråling software er udviklet med dette mål for øje, og har potentiale til at bidrage til succes for fremtidige innovative eksperimenter ud over deres oprindelige mål.

Til bedste af vores viden er vores gruppe først til at udvikle denne teknologi på verdensplan. Men dens standardiseret anvendelse i fremtiden vil lette anvendelsen af målrettede microbeam bestråling til dyr under live, hvilket bidrager til at identificere roller af specifikke celler/væv i interne processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Dr. Atsushi Higashitani for venlig rådgivning i forbindelse med behandling af C. elegans og Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota og Yasuhiko Kobayashi for værdifulde drøftelser. Forfatterne takke Caenorhabditis genetisk Center for at levere stammer af C. elegans og E. coli. Vi takker besætningen på cyclotron af DIADEM på QST-Takasaki for deres venlige assistance med bestråling eksperimenter. Vi takker Dr. Susan Furness til redigering af et udkast til dette håndskrift. Denne undersøgelse var delvist understøttet af KAKENHI (Grant numre JP15K11921 og JP18K18839) fra JSP'ER til M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild-type strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA N2 Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA CB4845 C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape 
C. elegans transgenic strain HBR4 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA HBR4 The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA OP50 E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60) Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM17-0001 Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper 
Worm Sheet 60 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001 Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. 
Worm Sheet 50 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0002 Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. 
MICRO COVER GLASS MATSUNAMI GLASS IND. LTD. C030401 Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001/ BCM18-0002 Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan Lumirror T60 (t 125 µm) PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-060 Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-035 Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q Merck, France Ultrapure water
Kimwipe S-200 Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan 62020 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick Genesee Scientific Corporation, CA, USA) 59-AWP Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX16 Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16 OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-ILLB This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO1×PF NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO2XPFC NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan U-LH100HG The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-FYFPHQ Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013 Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA EXCEL Software used for statistical analyses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).

Tags

Bioteknologi sag 145 C. elegans microbeam bestråling på chip immobilisering PDMS mikrofluid chip orm ark befugtningen
Immobilisering af levende <em>Caenorhabditis elegans</em> enkeltpersoner ved hjælp af en ultra-tynd Polydimethylsiloxan mikrofluid Chip med væskeophobning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, … More

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, T. Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention. J. Vis. Exp. (145), e59008, doi:10.3791/59008 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter