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Bioengineering

Inmovilización de personas en Caenorhabditis elegans con un Chip de microfluidos polidimetilsiloxano ultra-delgada de retención de agua

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59008
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Summary

Se ha establecido una serie de métodos de inmovilización para permitir la irradiación dirigida de vivo Caenorhabditis elegans individuos utilizando un microfluídicos polidimetilsiloxano ultrafino recientemente desarrollados de la viruta con retención de agua. Esta novela inmovilización de la en-viruta también es adecuado para observaciones de imágenes. El tratamiento detallado y ejemplos de aplicación de la viruta se explican.

Abstract

Radiación es ampliamente utilizada para aplicaciones biológicas y para la cría de la viga de ion, y entre estos métodos, irradiación de microhaz representa un medio poderoso para identificar sitios sensible a la radiación en los organismos vivos. Este papel describe una serie de métodos de inmovilización de la en-viruta para la irradiación de microhaz específicas de individuos vivos de Caenorhabditis elegans. En particular, el tratamiento de las virutas de microfluidos de polidimetilsiloxano (PDMS) que desarrollamos anteriormente para inmovilizar a C. elegans individuos sin necesidad de anestesia se explica en detalle. Este chip, conocido como la hoja de un gusano, es flexible para permitir que los canales de microfluidos para ampliarse, y la elasticidad permite a los animales envolver suavemente. También, debido a la capacidad de la adsorción de los PDMS, los animales pueden sellarse en los canales cubriendo la superficie de la hoja de gusano con una película fina de la cubierta, en que animales no se empujan en los canales para el recinto. Girando la tapa de la película sobre, podemos recoger fácilmente los animales. Además, el gusano muestra retención de agua y permite a los individuos de C. elegans a ser sometidos a observación microscópica por largos periodos bajo condiciones vivo. Además, la hoja es sólo 300 μm de espesor, permitiendo que iones pesados tales como los iones de carbono pase a través de la hoja que encierra a los animales, permitiendo que las partículas de iones ser detectado y la dosis de radiación aplicada a medirse con precisión. Porque la selección de las películas de cubierta utilizado para que los animales es muy importante para la inmovilización a largo plazo exitosa, se realizó la selección de las películas de la cubierta conveniente y demostró una recomendada entre algunas películas. Como un ejemplo de aplicación de la viruta, presentamos imágenes observación de actividades musculares de los animales que incluye el canal microfluídico de la hoja de gusano, así como la irradiación de microhaz. Estos ejemplos indican que las hojas Gusano han expandido las posibilidades para experimentos biológicos.

Introduction

Radiación, incluyendo rayos x, rayos gamma y haz de iones pesados, es ampliamente utilizada para aplicaciones biológicas como en el diagnóstico de cáncer y tratamiento y para la cría de la viga de ion. Numerosos estudios y desarrollos técnicos actualmente se centra en los efectos de la radiación1,2,3. Irradiación de microhaz es un medio poderoso de identificación de sitios sensible a la radiación en la vida de los organismos4. La Takasaki avanzado radiación Instituto de nacional institutos de investigación de Quantum y radiológicas de la ciencia y tecnología (QST-Takasaki) ha desarrollado una tecnología para irradiar células individuales bajo observación microscópica con iones pesados microhaces5y ha establecido métodos para permitir la irradiación de microhaz específicas de varios animales modelo, tales como el nematodo Caenorhabditis elegans4,6gusanos de seda7y Oryzias latipes (medaka japonesa)8. Irradiación de microhaz específicas del nematodo C. elegans permite la caída efectiva de regiones específicas, tales como el anillo del nervio en la región de la cabeza, ayudando así a identificar las funciones de estos sistemas en procesos tales como locomoción.

Se ha desarrollado un método para la inmovilización de la en-viruta de C. elegans individuos sin necesidad de anestesia para permitir la irradiación de microhaz4. Además, para mejorar la microfluídica virutas usadas en el anterior estudio4, recientemente hemos desarrollado chips de microfluídicos mojable, ion-permeable, polydimethylsiloxane (PDMS), contempladas como hojas de gusano (véase Tabla de materiales), para inmovilización de individuos de C. elegans 9. Estos forman parte de hojas de suaves ultra delgadas (espesor = 300 μm; ancho = 15 mm; longitud = 15 mm) con múltiples canales de microfluidos recto (20 o 25) (profundidad = 70 μm; ancho = 60 μm o 50 μm; longitud = 8 mm) en la superficie (figura 1A, D). Los canales de la microfluídica están abiertos y permite que varios animales ser incluido en ellos al mismo tiempo (figura 1E). Las hojas son flexibles para permitir que los canales de microfluidos para ampliar (~ 10%, figura 1F), y la elasticidad permite a los animales envolver suavemente. También, debido a la capacidad de la adsorción de los PDMS, los animales pueden sellarse en los canales cubriendo la superficie de la hoja de gusano con una película fina de la cubierta, en que animales no se empujan en los canales para el recinto. Girando la tapa de la película sobre, podemos recoger fácilmente los animales.

Los canales no hacen daño los gusanos cuando están siendo cerrados o cuando se recogen. Además, las hojas están hechas de PDMS, que es esencialmente hidrofóbicas, pero la retención de agua se logra impartiendo hidrofilia del material. La retención de agua y el espesor son características favorables de las hojas de gusano. La capacidad de retención de agua evita la deshidratación de los animales después de la inmovilización prolongada y permite observaciones a largo plazo para llevarse a cabo.

Además, como se describe anteriormente9, las hojas son sólo 300 μm de espesor, permitiendo que iones pesados tales como los iones de carbono (con un rango de aproximadamente 1 mm de agua) para pasar a través de la hoja que encierra a los animales. Esto permite que las partículas de iones para ser detectado y la dosis de radiación aplicada a medirse con precisión. Por otra parte, las hojas de gusano pueden ser reutilizadas y así son económicas. Con el método de inyección convencional, los animales incluidos son a veces muertos y no puede ser sacados del canal; sus huevos también pueden obstruir los canales. Esto hace que el chip inutilizables. Chips son, por lo tanto, básicamente disponible y el costo-beneficio relación es pobre.

En el presente trabajo, describimos detalladamente una serie de métodos para la inmovilización de la en-viruta de vivo C. elegans individuos utilizando hojas de gusano. A través de análisis de la locomoción de los animales 3 h después de la inmovilización de la en-viruta, evaluamos la película cubierta conveniente. Además, mostramos los ejemplos de inmovilización de la en-viruta para observaciones de imágenes y de la irradiación de microhaz.

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Protocol

1. las cepas y mantenimiento

  1. Seleccione una cepa adecuada de C. elegans y Escherichia coli (comida) según el propósito del experimento.
    Nota: En el presente documento, tipo N210C. elegans (figura 2A) es utilizado generalmente y HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 sólo se emplea para el análisis de la proyección de imagen. E. coli OP50 fue utilizado como alimento para C. elegans. Algunos mutantes con forma del cuerpo anormales, tales como el mutante de unc-119(e2498) III con forma en espiral (figura 2B), también pueden ser incluidos en los canales de microfluidos recta (figura 2C).
  2. Mantener la C. elegans a 20 ° C en platos de Petri de 6 cm que contiene 10 mL de medio de cultivo de nematodos (NGM) con incubar durante la noche (37 ° C) e. coli como se describió anteriormente10. Si es posible, sincronizar las etapas de desarrollo de C. elegans de la etapa de embrión.
  3. Utilizar animales adultos bien alimentados, aproximadamente 3-4 días después de la eclosión con una anchura de unos 50-60 μm, que se adaptan óptimamente al tamaño de los canales de microfluidos en las hojas de gusano.

2. selección de la solución tampón para la inmovilización de la en-viruta

  1. Para las hojas Gusano mojable, utilice cualquier tampón según el propósito de los experimentos.
    Nota: Las soluciones tampón adecuado para la inmovilización de la en-viruta en PDMS microfluídicos chips han sido definición previamente9 y las soluciones siguientes fueron demostradas para no tener ningún efecto sobre la motilidad de los animales después de la inmovilización: tampón básico S solución (5,85 g de NaCl, 1 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol), 50 mL de fosfato de potasio de 1 M pH 6,0, H2O a 1 L; esterilizado por autoclave)10 que contiene una gran cantidad de NaCl, solución amortiguadora de fosfatos M9 (5 g de NaCl , 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 1 mL de 1 M MgSO4, H2O a 1 L; esterilizar en autoclave)10, tampón de lavado (5 mL de fosfato de potasio de 1 M pH 6,0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 0,5 g pf gelatina, H2O a 1 L; esterilizado por autoclave)12 que contiene gelatina y agua ultrapura9. En el presente documento, tampón de lavado se utiliza típicamente, y tampón básico S sólo se emplea para la evaluación de la en-viruta inmovilización mediante películas de diversa cubierta en la sección 3.
  2. Chips microfluídicos convencional sin humedad, utilizar una solución de tampón de lavado, que proporciona el medio más eficaz de mantener la humedad en los canales de microfluidos del chip y así evita el secado de C. elegans () personas independientemente de la mojabilidad de los chips de microfluídica).

3. selección de la película de la cubierta adecuada para la inmovilización de la en-viruta

  1. Preparación de películas de diversa cubierta como sigue. Basado en la facilidad de manejo, corte transparente, las siguientes películas de cubierta biocompatible a un tamaño adecuado(es decir, de 10-15 mm de ancho y longitud de 30-50 mm): 130-170 μm espesor cubierta vidrio 125 μm poliester (animal doméstico) película gruesa y ~ 130 μm espesor poliestireno (PS) película.
  2. Realizar la inmovilización de la en-viruta de 3 h con películas de diversa cubierta como sigue. Basado en pasos 4.1-4.6, encierran ≥10 lavadas animales adultos (3,5 días después de la eclosión) en la hoja de gusano con cada película de cubierta, respectivamente y dejar durante 3 horas.
  3. Para propósitos de comparación, permite 3 h de libre circulación como sigue. Lugar ≥10 lavar animales adultos en un plato de 3,5 cm que contiene 3 mL NGM fresco, cubrir con una tapa y dejar durante 3 horas.
  4. Recoger animales inmediatamente después de 3 horas de inmovilización de la en-viruta según pasos 5.1-5.3. Retire la película de la cubierta de la hoja de gusano y añadir una gota de tampón a cada animal. Recoger animales nadando en la gota con un selector de platina y transferirlas a una placa de 3,5 cm que contiene 3 mL NGM fresco sin comida (placa de ensayo).
  5. Recoger animales después de 3 horas de libre circulación. Añadir una gota de tampón a cada animal. Recoger animales nadando en la gota en la placa de NGM y transferirlas a una placa de ensayo usando un selector de platina.
  6. Evaluar los efectos de la película de la cubierta sobre motilidad (ensayo de locomoción).
    1. Por lo menos 5 minutos después de la transferencia a la placa de ensayo, cuenta ' curvas (definido como la cantidad de curvas en la región anterior del cuerpo en intervalos de 20 s) manualmente bajo un microscopio13del cuerpo.
    2. Llevar a cabo ensayos de locomoción cinco veces independientemente para cada película de la cubierta.
      Nota: En los experimentos que se muestra en los resultados representativos, se evaluaron 10 animales para cada experimento en el que varios animales fueron incluidos al mismo tiempo, en comparación con sólo cinco animales en el estudio anterior13.
    3. Calcular el promedio de las curvas del cuerpo para los 10 animales en cada grupo para cada experimento. Entonces un promedio de los valores de cinco experimentos independientes para evaluar la effects de inmovilización de la en-viruta. Analizar los datos estadísticamente mediante una prueba de análisis unidireccional de varianza (ANOVA) en un software de hoja de cálculo en los niveles de significación de 0.01 y 0.05.
      Nota: Basado en estos experimentos, una película de tapa PS con permeabilidad al oxígeno alta consideró conveniente (véase los resultados representativos). Estas películas de PS están incluidas en las hojas de gusano. Película del animal doméstico, que tiene poco oxígeno permeabilidad, no se consideró conveniente porque los animales tienden a asfixiar si cubierto con él durante la inmovilización a largo plazo en las hojas de gusano. También es importante que no se rompa la película cubierta durante una serie de procedimientos; cubiertas de vidrio por lo tanto también eran inadecuadas (véase los resultados representativos).

4. inmovilización de la en-viruta

Nota: Se deben usar guantes desechables y estériles para evitar contaminar las hojas gusano.

  1. Coloque una lámina transparente delgada como una película de cubierta vidrio o PS que no tiene autofluorescencia, para su uso como una película de tapa inferior, sobre el escritorio experimental o la etapa microscópica. Coloque una hoja de gusano en la película de cubierta inferior con unas pinzas planas.
    Nota: Además de las hojas del gusano con 60 canales de todo el μm microfluídicos (convenientes para adultos 3-4 días después de la eclosión), hojas con 50 canales de todo el μm (convenientes para los jóvenes adultos 3 días después de la eclosión y mutantes con cuerpo pequeño en etapa adulta) pueden también ser empleadas. Seleccionar una hoja adecuada basada en el tamaño de los animales a utilizar.
  2. Para recolectar los animales, recoger un adulto individual C. elegans de la placa de cultivo bajo un estereomicroscopio con un selector de platina. Repita el proceso si se necesitan varios animales.
  3. Lavar animales para remover alimentos (bacterias).
    1. Coloque por lo menos tres gotas (gotas de 5 μl) de solución tampón en la superficie de una 6 cm no tratadas (hidrófugo) plato de Petri.
    2. Traslado de los animales a una gota con un selector de platina y que puedan retirar cualquier alimento nadando. Lávelas dos veces en dos gotas separadas y luego enjuague los animales en otra gotita.
      Nota: Es necesario para la práctica de este procedimiento para poder realizar rápidamente antes de realizar cualquier experimentos.
  4. Dejar caer 2-3 μl de tampón sobre la superficie de una hoja de gusano. Recoger los animales lavados de la gota en el plato de Petri y transferirlos a la gota sobre la hoja de gusano.
  5. Encerrar animales en microfluidos canales como sigue. Coloque una película cubierta de PS sobre la hoja de gusano con unas pinzas planas y presione suavemente sobre los canales de un extremo de la hoja a la otra para mantener la humedad (como se describe anteriormente4,9).
    Nota: Los animales están encerrados al azar en los canales. Gotas que contengan animales se distribuyen en la hoja de gusano cubriendo la hoja, dando por resultado gotas está ampliamente extendidas en varios canales. Cada animal puede ser incluido en alguno de estos canales. El punto importante con respecto al uso de la hoja de gusano para la inmovilización de la en-viruta es que varios canales están disponibles en una amplia zona.
  6. Inmediatamente después de que los animales en los canales de microfluidos, confirman que están vivos comprobando el movimiento de la cabeza debajo de un microscopio (por ejemplo, 1 x o 2 x de ampliación).
  7. Registrar la posición del animal, al mismo tiempo como realización paso 4.6 y note lo siguiente en una hoja dedicada (1 archivo suplementario): número del canal en el que el animal está encerrado; posición de cada animal en el canal (izquierda/centro/derecha); y la dirección de la cabeza.
  8. Dibujar una flecha para marcar la posición de cada animal en el canal, con la dirección de la flecha correspondiente a la cabeza del animal.
    Nota: Los números de canal (p. ej., 1, 5, 10, 15, 20, 25) están grabadas en la superficie de la hoja de gusano cerca de los bordes derecho e izquierdos de los canales de microfluidos (figura 1B). Esta información de la hoja dedicadoa permite a los animales que se encuentra rápidamente, haciendo el proceso más eficiente y también ayuda a prevenir la salida de la radiación durante los pasos posteriores.

5. colección de animales de una hoja de gusano

  1. Inmediatamente después de la inmovilización, retire la película de la cubierta de la hoja de gusano con unas pinzas planas.
  2. Gota de solución de 10-15 μl tampón en los canales de microfluidos que encierra los animales y observar los animales a nadar en las gotitas bajo un estereomicroscopio.
    Nota: Los animales comienzan natación en la gota de nuevo en sus propios sin ninguna presión adicional, ayuda o empuje. Sólo dejar caer algunos buffer encima de ellos es suficiente para hacerlos nadar fuera del canal. Un animal no puede nadar en una gota si se ha dañado vital por irradiación en paso 7.9 o por el proceso de inmovilización en pasos 4.2-4.5, aunque esto es raro. Además, si el animal permanece adherido a la película de la cubierta cuando se extrae, añadir las gotas sobre la película de la cubierta en vez de en los canales.
  3. Recoger los animales nadando en la gota con un selector de platina y colocarlos en una placa de ensayo.

6. uso de hojas de gusano para observaciones de imágenes

Nota: Hojas de gusano pueden ser ampliamente utilizadas en observaciones microscópicas. El chip puede retener el agua y no afecta a la movilidad de los individuos de C. elegans después de 3 horas de inmovilización de la en-viruta9. Además, el chip sí mismo no tiene autofluorescencia, haciéndolo conveniente para el uso en análisis de la proyección de imagen de la fluorescencia. Una aplicación de muestra para análisis de imágenes de fluorescencia se expone a continuación.

  1. Seleccionar un microscopio de fluorescencia y montar una cámara digital o cámara de vídeo digital en el microscopio para capturar imágenes o vídeos, respectivamente (figura 3A).
    Nota: La distancia de trabajo (WD) de microscopio es más de 0,2 mm según las especificaciones de la lente del objetivo (véase figura 3B, C). La especificación del sistema de microscopio de fluorescencia utilizado en este trabajo se muestra en la Tabla de materiales. Sin embargo, la especificación no se limita a nuestro ejemplo porque depende de la finalidad de la observación o / y los usuarios.
  2. Seleccione cualquier fluorescente cepa de C. elegans y mantienen como se describe en la sección 1.
    Nota: Si es necesario observar la contracción muscular de la pared del cuerpo (ver resultados representativos), uso de HBR4 adulto joven11C. elegans, en la que un gen reportero se utiliza para expresar el indicador de calcio GCaMP3.35 en todas las células de músculo de la pared del cuerpo. Es importante utilizar a los adultos jóvenes (≤ 3 días después de la eclosión) que son más delgados que el ancho de los canales de microfluidos (50 o 60 μm) de la hoja del gusano. El pequeño grado de separación implica que los animales se pueden doblar ligeramente, lo que es posible observar la contracción muscular y la extensión durante el rastreo, con un indicador de iones de calcio.
  3. Llevar a cabo el recinto de los animales según el procedimiento de inmovilización en la sección 4.
  4. Observar manchas fluorescentes de animales (por ejemplo, verde fluorescente cepas etiquetado proteína) utilizando un microscopio de fluorescencia y capturar imágenes con una cámara digital montada en el microscopio.
    Nota: Seguir los métodos establecidos anteriormente14,15,16, ya que los métodos de observación del microscopio (incluyendo observación de fluorescencia) y depende de la especificación del sistema de microscopio el propósito de la observación.
  5. Propagación de la onda de la ión calcio de imagen mediante adquisición de vídeo para observar actividades dinámicas, como la contracción muscular de la pared del cuerpo y la extensión en los gusanos HBR4 (Video 1).

7. uso de hojas de gusano para la irradiación de microhaz

Nota: La colimación microhaz irradiación sistema5 puede utilizar varias partículas de iones pesados aceleradas desde el ciclotrón de campo azimutales diferentes instalado en los aceleradores de iones Takasaki para facilidad de uso avanzada de radiación (TIARA) de QST-Takasaki (figura 4A). Hay una etapa automática por irradiación bajo la salida de la viga (figura 4B). El procedimiento para la irradiación de iones pesados microhaz de C. elegans mediante este sistema es el siguiente.

  1. Localizar la hoja del gusano que encierra varios animales en un marco de aluminio a medida para la instalación de irradiación de microhaz y colóquela en la fase automática de irradiación (figura 4C).
  2. Aumentar la muestra de irradiación (es decir, animales encerrados en una hoja de gusano en un marco), para inmediatamente bajo salida (~ 2 mm) la viga se basa en la imagen del monitor de un microscopio situado debajo de la etapa automática (figura 4D).
  3. Después de la colocación vertical, Ubique cada animal al objetivo con la irradiación de microhaz usando el software a la medida para irradiación específica de animales y cultivos celulares. Para ubicar cada animal incluido en el canal microfluídico, consulte la hoja dedicada que se describe en paso 4.7-4.8 (véase la archivo adicional 1) y confirmar el número del canal cerca de los bordes derecho e izquierdos de los canales.
  4. Controlar la fase automática en el X y Y direcciones para colocar los animales debajo de la viga salir mediante un sistema de control remoto y un ratón láser funciona con el software de irradiación.
  5. Áspero tono la zona de irradiación al ver la proyección del microscopio ubicado bajo la fase automática de la muestra y mueve el cursor a la posición de irradiación del animal a ser objetivo.
  6. Después de colocar áspero, salir y cerrar la sala de irradiación y trasladarse a la sala de control adyacente para evitar irradiar los operadores.
  7. Conjunto el número de partículas de iones para un procedimiento de irradiación, correspondiente a la radiación de una región concreta del animal, utilizando la consola vinculado a un sistema de contador de iones.
    Nota: Esto consiste en un scintillator plástico y un multiplicador de fotoelectrones en el sistema de irradiación de microhaz colimación.
  8. De la sala de control de irradiación, ajustar la posición de los animales basada en la imagen de monitor desde el microscopio situado debajo de la etapa automática, que es la misma imagen proyectada en el monitor en la sala de irradiación (figura 4E).
  9. Objetivo la irradiación de microhaz por haga clic en el botón de la irradiación del software para la irradiación.
    Nota: En el ejemplo mostrado en la figura 4F, la faringe en la principal región de destino e irradiar con el número apropiado de microhaz iones de carbono. Porque se cuenta el número de partículas de iones pasar a través de la muestra mediante un sistema de contador de iones ligado a la consola y el software de la irradiación, la irradiación se detiene después de la entrega del número deseado de partículas de iones.
  10. Ubique cada animal registrado en la hoja dedicada y llevar a cabo la irradiación específica para cada animal. Repita los pasos 7,8 y 7,9 hasta que todos los animales han sido irradiados.
  11. Inmediatamente después de la irradiación, entrar en la sala de irradiación y baje la etapa automática irradiación. Retire la muestra en el marco a la medida en la fase automática.
  12. Recoger los animales como se describe en los pasos 5.1-5.3.
  13. Realizar análisis conductuales y moleculares necesaria para evaluar los efectos de la irradiación específica, dependiendo de la finalidad del estudio.
    Nota: El ensayo de locomoción se describe en el paso 3.6 es un método eficaz para evaluar los efectos de la irradiación en motilidad4,9.

8. tratamiento de hojas de gusano para uso repetido

Nota: Hojas de gusano pueden ser utilizado en varias ocasiones por lo menos 10 veces9 sin efectos adversos en los animales si limpiarse y esterilizarse adecuadamente después de su uso como sigue.

  1. Limpieza
    1. Coloque la hoja de gusano usado en una placa de Petri de 6 cm y cerca de 100 μl de agua ultrapura estéril sobre toda la hoja de la gota.
    2. Paleta el agua en la superficie de la hoja usando guantes los dedos para lavar la suciedad como polvo, alimentos bacterianas y los huevos puestos en los canales.
    3. Limpie la humedad de la hoja de gusano con toallitas desechables.
  2. Esterilización
    1. Inyectar aproximadamente 5 mL de etanol al 70% de la placa de Petri que contiene la hoja del gusano y la superficie de la hoja con los dedos enguantados para lavar la suciedad de la paleta.
  3. De secado
    1. Eliminen las virutas de la placa de Petri con etanol al 70% y dejar para secar naturalmente.
  4. Almacenamiento de información
    1. Después de secar, colocar la hoja de gusano en una placa Petri estéril y cubrirla. Las hojas también se pueden almacenar en una caja Petri estéril con etanol al 70%.
      Nota: Es mejor deshacerse de las películas de la tapa después de su uso, pero si van a volver a ser utilizados, limpieza de la hoja de gusano. Sin embargo, caso de pliegues en la película de la cubierta después de su uso ya no se adhiere a la viruta, dando por resultado la deshidratación de los animales, y por lo tanto debe ser sustituido.

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Representative Results

Activo C. elegans individuos podrían ser inmovilizados con éxito usando un PDMS ultrafino, mojable, chip de microfluidos (hoja de gusano). Se investigó la conveniencia de películas de diversa cubierta para el sellado de la hoja de gusano, como se describe en el artículo 3 del protocolo. Para evaluar los efectos de sellado de las películas de la tapa, se determinó la movilidad de los animales 3 h después de la inmovilización de la en-viruta con cubierta de vidrio (espesor: 130-170 μm), película del animal doméstico (grueso: 125 μm) y PS film (grueso: ~ 130 μm), respectivamente. Como se muestra en la figura 5, no hubo ninguna diferencia significativa en la movilidad (curvas de cuerpo) entre los animales de control permitido moverse libremente para 3 h y los animales dentro de la hoja de gusano con la película PS. En cambio, la movilidad se redujo significativamente en animales encerrados bajo una cubierta de vidrio. Algunos animales parecen se han secado, sugiriendo que el vidrio de cubierta rechazó la gota, previniendo una junta cercana y permitiendo que los animales parcialmente seco hacia fuera, dando por resultado la reducción de la movilidad. Se disminuyó también significativamente la motilidad de los animales incluido utilizando una película de PET; Aunque no secado se observó, la movilidad de los animales tendió a disminuir uniformemente, lo que sugiere que la tasa de transmisión de oxígeno bajo (~ 30 mL / [24 h·m²· MPa]), que es cerca de 100 veces menor que el de PS, causado los animales sofocar. Estos resultados sugieren que cubren PS films deben utilizarse para encerrar los animales en la hoja de gusano.

También aplicamos la técnica de hoja de gusano para observaciones de imágenes y para realizar la irradiación de microhaz de cada región. Inmovilización de la en-viruta con una hoja de gusano con retención de agua y no autofluorescence era adecuado para observación microscópica bajo condiciones vivo. Por ejemplo, se aplicó la técnica de la HBR4 cepa11 de C. elegans, en la que un gen reportero expresó el indicador de calcio GCaMP3.35 en todas las células de músculo de la pared del cuerpo. Observamos las actividades de todas las células de músculo de pared del cuerpo en animales adultos jóvenes a ≤ 3 días post eclosión en hojas gusano con 50 canales de todo el μm microfluídicos, que permitió a que los animales espacio para doblar ligeramente. La intensidad de la señal GCaMP3.35 en la cepa de HBR4 corresponde a la contracción de las células de músculo de la pared del cuerpo. El Ca2 + propagación de la onda correspondiente a la actividad muscular se observó claramente (Video 1). Además, confirmamos que la hoja de gusano no tenía autofluorescencia como se muestra en la última etapa (últimos ~ 10 s) de vídeo 1. De esta manera, la falta de necesidad de anestesia permitió las actividades fisiológicas de las células musculares para ser observadas bajo condiciones vivo.

Además, aplicamos la hoja del gusano para la irradiación de microhaz región-específicas de los individuos de C. elegans . Los múltiples canales de microfluidos recta en la hoja de gusano permiten varios animales para ser inmovilizados al mismo tiempo, sin necesidad de anestesia, permitiendo así la irradiación secuencial de ≥ 20 animales (suficiente para un análisis de grupo) en un corto tiempo (30 min por 20 las personas físicas).

Figure 1
Figura 1 : Esquema de una hoja gusano. (A) Resumen de una hoja de gusano con una moneda de centavo americano 1 para la escala. La hoja de gusano era 300 μm de espesor, 15 mm de ancho y 15 mm de largo. (B) la superficie de la hoja de gusano contiene 25 canales rectos microfluídicos (profundidad = 70 μm; ancho = 60 μm; longitud = 8 mm). (C) esquema de las muestras de la película de la cubierta inferior, la hoja de gusano y la película de la cubierta. (D) la hoja de gusano es una hoja suave y ultra delgada de PDMS y pellizcando con las pinzas planas se puede doblar. (E) ejemplo de múltiples animales en múltiples canales. (F) Ampliación de un canal microfluídico empujando con un selector de platina. La elasticidad del canal permite a los animales envolver suavemente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Cuerpo en forma de C. elegans. (A) tipo (N2) C. elegans en una placa NGM. (B) un mutante unc-119 con forma anormal en una placa NGM. (C) unc-119 mutantes encerrados los canales de microfluídica de la hoja del gusano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Esquemas de observación microscopio de individuos de C. elegans encerrados la hoja del gusano en vivo. (A) diagrama esquemático del sistema de Estereomicroscopio para observaciones de imágenes. (B) esquema de observación del microscopio del gusano de la hoja envolvente en C. elegans individuos. (C) vista seccional del gusano de la hoja envolvente en C. elegans individuos colocan en la platina del microscopio. W.D. indica la distancia de trabajo de microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Esquema de colimador sistema microhaz QST Takasaki y procedimiento de irradiación microhaz específicas para individuos de C. elegans en vivo. (A) Resumen de la colimación microhaz irradiación sistema5, que puede utilizar varias partículas de iones pesados aceleradas desde el ciclotrón de campo azimutales diferentes instalado en la TIARA de QST Takasaki. (B) Resumen de la salida de la viga y la etapa automática por irradiación. (C) muestra la configuración de la etapa automática del sistema de microhaz colimación. (D) posicionamiento Vertical de la muestra de irradiación llevó a cabo en la sala de irradiación. (E) ajuste del área de irradiación de llevó a cabo en la sala de control de la irradiación. (F) Targeted microhaz irradiación de en C. elegans. La faringe fue hacer clic en la posición de destino y se irradiaron pulsando el botón de irradiación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Motilidad de C. elegans después de la inmovilización de la en-viruta con cubierta de vidrio, película de poliester (PET) y film de poliestireno (PS). Las barras indican curvas de medio cuerpo de los animales 3 h después de la inmovilización de la en-viruta o después de la libre circulación de 3 h en una placa de la NGM (control). Diez animales fueron examinados y curvas del cuerpo fueron hechas un promedio entre cada grupo. Por último, los datos de cinco experimentos independientes fueron hechas un promedio para cada grupo. Barras de error representan el error estándar de la media de cinco experimentos independientes. Todos los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional en 0.05 (*) o nivel de significación de 0.01 (*). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1
Video 1: ejemplos de imagen observaciones de actividades musculares en C. elegans encerrado en una hoja de gusano. Propagación de ondas de iones de calcio correspondiente a la contracción de las células de músculo de la pared del cuerpo durante el arrastre en HBR4 C. elegans individuos dentro de una hoja de gusano. Los últimos ~ 10 s se observó bajo iluminación de campo claro. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Supplementary Figure 1
Archivo complementario 1: ejemplo de hoja dedicada de papel (versión de irradiación de microhaz). Dibujar una flecha para indicar la posición de cada animal en el canal. La dirección de la flecha corresponde a la cabeza. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Inmovilización de la en-viruta de C. elegans bajo condiciones vivo usando un chip de microfluidos mojable de PDMS permite la irradiación de microhaz objetivo eficiente de múltiples animales. La facilidad de manejo y características para prevenir la resequedad que este sistema adecuado para aplicaciones en microhaz irradiación, sino también en diversos estudios de comportamiento. Estas hojas gusano ya han sido comercializadas y pueden obtenerse fácilmente. Chips microfluídicos convencional, como astillas de olfativos, están asociadas con problemas como obstrucción de huevos en los canales de microfluidos cerrado haciendo difícil recoger los animales y los animales, y así estos chips han tendido a ser desechables, de tal modo aumentar el costo. En cambio, los canales de microfluidos en la hoja actual de gusano están abiertos, haciéndolo más fácil recoger los animales. Estas hojas de gusano pueden ser utilizadas repetidamente, lo que los hace más económicos.

Innovaciones tecnológicas recientes en chips de microfluídica PDMS han mostrado una tendencia creciente en complejidad estructural y multifuncionalidad16,18,19,20,21, 22,23. Sin embargo, creemos que es importante que el sistema simple y fácil de usar. De hecho, en contraste con el uso de convencional microfluídicos grandes virutas19,20,21,22,23 que requieren la fijación de una bomba de vacío, el pequeño tamaño y diseño simple de las hojas Gusano procedimientos a llevarse a cabo fácilmente dentro de un espacio limitado.

El rendimiento de retención de agua de las hojas de gusano permite observaciones a largo plazo para llevarse a cabo. Además, el espesor de la hoja permite que partículas de iones pasar a través de las muestras, lo que permite la irradiación dirigida a aplicarse para vivir los individuos de C. elegans con un número exacto de las partículas de iones. Estas ventajas de las hojas Gusano han expandido las posibilidades para experimentos biológicos.

Creemos que es importante para los biólogos desarrollar nuevos equipos y métodos para mejorar la eficiencia de sus análisis y experimentos. El microhaz irradiación software y hojas de gusano se han desarrollado con este objetivo en mente y tienen el potencial para contribuir al éxito de futuros experimentos innovadores más allá de sus objetivos originales.

A lo mejor de nuestro conocimiento, nuestro grupo es el primero en desarrollar esta tecnología en todo el mundo. Sin embargo, su uso estándar en el futuro facilitará la aplicación de la irradiación de microhaz dirigidos a los animales en condiciones vivas, ayudando así a identificar las funciones de las células/tejidos específicos en procesos internos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen el Dr. Atsushi Higashitani Consejo bueno con respecto al tratamiento de C. elegans , los Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota y Yasuhiko Kobayashi para discusiones valiosas. Los autores agradecen el centro genético de Caenorhabditis proveer cepas de C. elegans y e. coli. Agradecemos a la tripulación del ciclotrón de TIARA en QST Takasaki por su amable ayuda con los experimentos de irradiación. Agradecemos al Dr. Susan Furness para editar un borrador de este manuscrito. Este estudio fue apoyado en parte por KAKENHI (beca números JP15K11921 y JP18K18839) de JSP a M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild-type strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA N2 Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA CB4845 C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape 
C. elegans transgenic strain HBR4 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA HBR4 The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA OP50 E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60) Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM17-0001 Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper 
Worm Sheet 60 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001 Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. 
Worm Sheet 50 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0002 Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. 
MICRO COVER GLASS MATSUNAMI GLASS IND. LTD. C030401 Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001/ BCM18-0002 Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan Lumirror T60 (t 125 µm) PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-060 Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-035 Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q Merck, France Ultrapure water
Kimwipe S-200 Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan 62020 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick Genesee Scientific Corporation, CA, USA) 59-AWP Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX16 Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16 OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-ILLB This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO1×PF NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO2XPFC NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan U-LH100HG The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-FYFPHQ Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013 Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA EXCEL Software used for statistical analyses

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References

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Bioingeniería número 145 C. elegans irradiación de microhaz inmovilización de la en-viruta chip de microfluidos PDMS hoja de gusano mojabilidad
Inmovilización de personas en <em>Caenorhabditis elegans</em> con un Chip de microfluidos polidimetilsiloxano ultra-delgada de retención de agua
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Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, T. Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention. J. Vis. Exp. (145), e59008, doi:10.3791/59008 (2019).

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