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Bioengineering

Imobilização de indivíduos ao vivo Caenorhabditis elegans , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59008
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Summary

Estabeleceu-se uma série de métodos de imobilização para permitir a irradiação de alvo de viver elegans de Caenorhabditis indivíduos usando um polidimetilsiloxano ultra-fino recentemente desenvolvidos microfluidic chip com retenção de água. Este romance imobilização no chip também é adequada para imagens observações. O tratamento detalhado e exemplos de aplicação do chip são explicados.

Abstract

Radiação é amplamente utilizada para aplicações biológicas e para reprodução de feixes de iões, e entre esses métodos, irradiação microbeam representa um poderoso meio de identificar sites radiosensitive em organismos vivos. Este artigo descreve uma série de métodos de imobilização no chip desenvolvido para a irradiação do alvo microbeam dos indivíduos ao vivo de Caenorhabditis elegans. Notavelmente, o tratamento dos chips microfluídicos polydimethylsiloxane (PDMS) que desenvolvemos anteriormente para imobilizar a indivíduos de c. elegans , sem necessidade de anestesia é explicada em detalhes. Este chip, referido como uma folha de verme, é resistente para permitir que os canais microfluídicos ser expandido, e a elasticidade permite que os animais ser envolto suavemente. Também, devido a capacidade de adsorção independente do PDMS, animais podem ser selados nos canais, cobrindo a superfície da folha com um filme de capa fina, em que os animais não são empurrados para os canais para o compartimento de verme. Girando a tampa filme sobre, você pode facilmente acumular os animais. Além disso, a folha do verme mostra a retenção de água e permite que os indivíduos de c. elegans ser submetido a observação microscópica por longos períodos em condições ao vivo. Além disso, a folha é apenas 300 µm de espessura, permitindo íons pesados tais como íons de carbono para passar através da folha de delimitador dos animais, permitindo assim que as partículas de iões ser detectado e a dose de radiação aplicada para ser medido com precisão. Porque a seleção dos filmes capa usada para colocar os animais é muito importante para a imobilização a longo prazo bem sucedida, nós realizou a seleção dos filmes tampa apropriada e mostrou um recomendado entre alguns filmes. Como um exemplo de aplicação do chip, introduzimos a observação de imagens das atividades musculares de animais encerram o canal microfluidic da folha de minhoca, bem como a irradiação microbeam. Estes exemplos indicam que os lençóis de verme tem ampliadas as possibilidades de experimentos biológicos.

Introduction

Radiação, incluindo raios x, raios gama e o feixe de iões pesados, é amplamente utilizada para aplicações biológicas, tais como no tratamento e diagnóstico de câncer e para a reprodução de feixes de iões. Numerosos estudos e desenvolvimentos técnicos atualmente estão focando os efeitos da radiação1,2,3. Microbeam irradiação é um poderoso meio de identificar sites radiosensitive em vida organismos4. Takasaki avançado radiação pesquisa Instituto de institutos nacionais de Quantum e radiológica de ciência e tecnologia (QST-Takasaki) tem vindo a desenvolver uma tecnologia para a irradiação de células individuais, sob observação microscópica usando pesado-íon microbeams5e estabeleceu-se métodos para habilitar o alvo microbeam irradiação de vários animais de modelo, como o nematódeo Caenorhabditis elegans,4,6, bichos da seda7e Oryzias latipes (medaka japonês)8. Microbeam alvo irradiação do nemátodo c. elegans permite o nocaute eficaz de regiões específicas, tais como o anel de nervo na região da cabeça, ajudando assim a identificar as funções destes sistemas em processos como a locomoção.

Um método para a em-microplaqueta imobilização de indivíduos de c. elegans , sem necessidade de anestesia foi desenvolvido para permitir a irradiação de microbeam4. Além disso, para melhorar microfluidic fichas utilizadas no estudo anterior4, recentemente desenvolvemos fichas de microfluidic molháveis, íon-penetrável, polidimetilsiloxano (PDMS), conhecidas como worm folhas (ver Tabela de materiais), para imobilização de indivíduos de c. elegans 9. Estes são compostos por folhas macias ultra-fino (espessura = 300 µm; Largura = 15 mm; comprimento = 15 mm) com múltiplos canais de microfluidic reta (20 ou 25) (profundidade = 70 µm; Largura = 60 µm ou 50 µm; comprimento = 8 mm) na superfície (Figura 1A-D). Os canais microfluídicos são abertos e permitem que vários animais ser incluído entre eles simultaneamente (Figura 1E). As folhas são flexíveis para permitir que os canais microfluídicos ser expandido (por ~ 10%, Figura 1,F), e a elasticidade permite que os animais ser envolto suavemente. Também, devido a capacidade de adsorção independente do PDMS, animais podem ser selados nos canais, cobrindo a superfície da folha com um filme de capa fina, em que os animais não são empurrados para os canais para o compartimento de verme. Girando a tampa filme sobre, você pode facilmente acumular os animais.

Os canais não machuque os vermes quando eles estão sendo fechados ou quando eles são coletados. Além disso, as folhas são feitas de PDMS, que é essencialmente hidrofóbicas, mas retenção de água pode ser conseguida transmitir Hidrofilia ao material. A retenção de água e a espessura são características favoráveis das folhas do worm. A capacidade de retenção de água impede a desidratação dos animais após a imobilização prolongada e permite que a longo prazo observações a efectuar.

Além disso, conforme descrito anteriormente,9, as folhas são apenas 300 µm de espessura, permitindo íons pesados tais como íons de carbono (com um intervalo de cerca de 1 mm de água) para passar através da folha, juntando os animais. Isso permite que as partículas de iões para ser detectado e a dose de radiação aplicada para ser medido com precisão. Além disso, as folhas do worm podem ser reutilizadas e, portanto, são econômicas. Com o método de injeção convencional, os animais fechados às vezes estão mortos e que não pode ser tomado fora do canal; seus ovos também podem entupir os canais. Isso torna o chip inutilizável. Chips são, portanto, basicamente descartável e o custo-benefício relação é pobre.

O presente trabalho, descrevemos detalhadamente uma série de métodos para a imobilização em-microplaqueta ao vivo c. elegans indivíduos usando folhas de verme. Através de ensaios de locomoção dos animais 3 h após a imobilização em-microplaqueta, avaliamos o filme de cobertura adequado. Além disso, mostramos exemplos de imobilização em-microplaqueta para observações de imagens e microbeam irradiação.

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Protocol

1. cepas e manutenção

  1. Selecione uma tensão adequada de c. elegans e Escherichia coli (comida) dependendo da finalidade do experimento.
    Nota: No presente trabalho, selvagem-tipo N210c. elegans (Figura 2)é usado geralmente e HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 é empregado apenas para imagens do ensaio. Escherichia coli OP50 foi utilizado como alimento para o c. elegans. Alguns mutantes com forma anormal do corpo, tais como o mutante unc-119(e2498) III com uma forma espiral (Figura 2B), também podem ser colocados entre os canais microfluídicos reta (Figura 2C).
  2. Manter o c. elegans , a 20 ° C, em cm 6 placas de Petri contendo 10 mL do meio de crescimento de nematoides (NGM) espalhar com incubados durante a noite (37 ° C) e. coli conforme descrito anteriormente,10. Se possível, sincronize as fases do desenvolvimento da c. elegans desde a fase de embrião.
  3. Use bem alimentados animais adultos, aproximadamente 3-4 dias após a eclosão, com uma largura de aproximadamente 50-60 µm, que são otimamente adequado para o tamanho dos canais microfluídicos nas fichas de verme.

2. selecção da solução-tampão para a imobilização em-microplaqueta

  1. Para folhas de worm molháveis, use qualquer solução tampão dependendo da finalidade dos experimentos.
    Nota: Soluções-tampão apropriado para a imobilização em-microplaqueta no PDMS microfluidic fichas foram definidas anteriormente9 e as seguintes soluções tampão foram mostradas para não ter nenhum efeito sobre a motilidade dos animais após a imobilização: buffer basal de S solução (5,85 g de NaCl, 1 mL de colesterol (5 mg/mL em etanol), 50 mL de fosfato de potássio pH 6.0 1 M, H2O para 1 L; esterilizado em autoclave)10 , contendo uma grande quantidade de NaCl, solução de tampão fosfato M9 (5 g de NaCl , 3 g de KH2PO4, 6g Na2HPO4, 1ml de 1m MgSO4, H2O l 1; esterilizados em autoclave)10, solução de tampão de lavagem (5 mL de fosfato de potássio pH 6.0 1 M, 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de 1m MgSO4, gelatina de pf de 0,5 g, H2O para 1 L; esterilizado em autoclave)12 contendo gelatina e água ultrapura9. No presente trabalho, solução de tampão de lavagem é normalmente utilizada, e solução-tampão basal S só é empregada para avaliar a imobilização em-microplaqueta usando filmes de capa diferente na seção 3.
  2. Para chips microfluídicos convencional sem molhabilidade, use uma solução de tampão de lavagem, que fornece os meios mais eficazes de manter a umidade nos canais microfluídicos do chip e, portanto, impede a secagem de c. elegans indivíduos ( independentemente da molhabilidade dos chips microfluídicos).

3. seleção da película de cobertura adequado para a imobilização em-microplaqueta

  1. Prepare filmes capa diferente da seguinte forma. Baseia a facilidade de manuseio, corte o seguinte transparente, filmes biocompatíveis capa para um tamanho adequado (ou seja, largura de 10-15 mm e comprimento de 30 a 50 mm): 130-170 µm de espessura de vidro tampa, 125 µm do poliéster (PET) película grossa e ~ 130 µm de espessura poliestireno (PS) filme.
  2. Realize imobilização de 3 h no chip usando filmes de capa diferente da seguinte maneira. Com base em etapas 4.1-4.6, coloque ≥ 10 lavado animais adultos (3,5 dias após a eclosão) na folha de worm usando cada filme de cobertura, respectivamente e deixe por 3 h.
  3. Para fins de comparação, permita 3 h de livre circulação como segue. ≥ 10 lugar lavado animais adultos num prato de 3,5 cm, contendo 3 mL NGM fresco, cubra com uma tampa e deixe por 3 h.
  4. Recolha animais imediatamente após 3 h de imobilização em-microplaqueta de acordo com passos 5.1-5.3. Retire a película de cobertura da folha de verme e adicionar uma gota de solução-tampão para cada animal. Apanhar animais nadando em gota usando um seletor de platina e transferi-los para um prato de 3,5 cm, contendo 3 mL NGM fresco sem comida (placa de ensaio).
  5. Recolha animais após 3 h de livre circulação. Adicione uma gota de solução-tampão para cada animal. Apanhar animais nadando em gota na placa NGM e transferi-los para uma placa de ensaio usando um seletor de platina.
  6. Avalie os efeitos do filme capa na motilidade (ensaio de locomoção).
    1. Pelo menos 5 min após a transferência para a placa de ensaio, Conde ' curvas (defined como o número de dobras na região anterior do corpo, em intervalos de 20-s) manualmente sob um microscópio13do corpo.
    2. Realizar ensaios de locomoção cinco vezes independentemente para cada filme de capa.
      Nota: Nos experimentos mostrados nos resultados representativos, 10 animais foram avaliados para cada experimento, em que vários animais foram colocados simultaneamente, em comparação com apenas cinco animais contados no estudo anterior13.
    3. Calcule o número médio de curvas do corpo para os 10 animais de cada grupo para cada experimento. Então os valores de cinco experimentos independentes para avaliar o effects em-microplaqueta imobilização médios. Analise os dados estatisticamente, usando um teste de uma forma de análise de variância (ANOVA) em um software de planilha eletrônica em níveis de significância de 0,01 e 0,05.
      Nota: Com base em experiências, um filme de capa PS com permeabilidade de oxigênio alta foi considerado adequado (veja os resultados representativos). Esses filmes de PS são incluídos com os lençóis de verme. Filme do animal de estimação, que tem permeabilidade de oxigênio baixa, não foi considerado apropriado porque os animais tendem a sufocar se coberto com ele durante a imobilização a longo prazo sobre as folhas de verme. Também é importante que o filme de cobertura não quebra durante uma série de procedimentos; tampas de vidro também foram, portanto, inadequadas (veja os resultados representativos).

4. imobilização em-microplaqueta

Nota: Luvas descartáveis, estéreis devem ser usadas para evitar a contaminação dos lençóis de worm.

  1. Coloque uma folha fina e transparente como um filme de capa PS ou vidro, que não tem nenhum autofluorescência, para uso como um filme de cobertura inferior, sobre a mesa experimental ou fase microscópica. Coloque uma folha de worm suavemente para o filme de cobertura inferior usando uma pinça plana.
    Nota: Além das chapas de verme com 60 canais microfluídicos todo o µm (apropriados para adultos 3-4 dias após a eclosão), folhas com 50 canais de todo o µm (apropriados para jovens adultos 3 dias após a eclosão e os mutantes com corpo pequeno em fase adulta) podem também ser empregadas. Selecione uma folha apropriada com base no tamanho dos animais para ser usado.
  2. Para coletar os animais, pega um adulto individual c. elegans da placa de cultura sob um estereomicroscópio usando um seletor de platina. Repita o processo, se forem necessários vários animais.
  3. Lave os animais para remover alimentos (bactérias).
    1. Coloque pelo menos três gotas (5 µ l gotas) de solução-tampão na superfície de um 6 cm não tratados (Water-repellent) placa de Petri.
    2. Transferir os animais para uma gotícula usando um seletor de platina e permitir-lhes para remover qualquer comida pela natação. Lavá-los duas vezes nas duas gotas separadas e em seguida enxaguar os animais em outra gota.
      Nota: É necessário para a prática deste procedimento para ser capaz de realizá-la rapidamente antes de efectuar quaisquer experiências.
  4. Solte os 2-3 µ l de solução-tampão para a superfície de uma folha do verme. Pegar os animais lavados da gota sobre o prato de Petri e transferi-los para a gota na folha de verme.
  5. Coloque animais entre canais microfluídicos como segue. Coloque um filme de capa do PS sobre a folha de worm usando uma pinça plana e pressione suavemente sobre os canais de um lado da folha para o outro para manter a umidade (conforme descrito anteriormente,4,9).
    Nota: Os animais são colocados aleatoriamente entre os canais. Gotículas contendo animais de folha de worm são espalhadas cobrindo a folha, resultando em gotas sendo amplamente estendidas ao longo de vários canais. Cada animal pode ser colocado em qualquer um destes canais. O ponto importante sobre o uso da folha do verme para a imobilização em-microplaqueta é que vários canais estão disponíveis em uma área ampla.
  6. Imediatamente após colocar os animais nos canais microfluídicos, confirmar que estão vivos, verificando para o movimento da cabeça sob um microscópio (por exemplo, 1 x ou 2 x de ampliação).
  7. Gravar a posição do animal, ao mesmo tempo como realização de etapa 4.6 e observe o seguinte numa folha de papel (arquivo complementar 1) dedicado: número do canal em que o animal é fechado; posição de cada animal no canal (esquerda/centro/direita); e a direção da cabeça.
  8. Desenhe uma seta para marcar a posição de cada animal no canal, com a direção da seta correspondente à cabeça do animal.
    Nota: Os números de canal (por exemplo, 1, 5, 10, 15, 20, 25) estão gravadas na superfície da folha do verme perto as bordas esquerdas e direita dos canais microfluídicos (Figura 1B). Esta informação na folha dedicada permite animais ser localizado rapidamente, tornando o processo mais eficiente e também ajuda a prevenir o vazamento de radiação durante as etapas subsequentes.

5. coleção de animais de uma folha de worm

  1. Imediatamente após a imobilização, remova a película de cobertura da folha de worm usando uma pinça plana.
  2. Gota de solução-tampão de 10-15 µ l para os canais microfluídicos abrangendo os animais e observar os animais começando a nadar nas gotas sob um estereomicroscópio.
    Nota: Os animais começam a nadar na nova gota no seus próprios sem qualquer pressão adicional, ajuda ou empurrar. Só estou deixando algum buffer em cima deles é suficiente para fazê-los nadar fora do canal. Um animal pode ser incapaz de nadar em uma gota se estiver extremamente danificado por irradiação na etapa 7,9 ou pelo processo de imobilização em passos 4.2-4.5, embora isto é raro. Além disso, se o animal permanece anexado ao filme capa quando ele é removido, adicione as gotas para o filme de cobertura, em vez dos canais.
  3. Pegar os animais a nadar a gota usando um seletor de platina e colocá-los em uma placa de ensaio.

6. aplicação de folhas de worm para observações de imagem

Nota: Folhas de minhoca podem ser amplamente utilizadas em observações microscópicas. O chip pode reter a água e não afeta a motilidade dos indivíduos de c. elegans após 3 h de imobilização em-microplaqueta9. Além disso, o chip em si tem nenhum autofluorescência, tornando-o adequado para uso em ensaios de imagem de fluorescência. Um aplicativo de amostra para ensaio de imagens de fluorescência é dada abaixo.

  1. Selecione um microscópio de fluorescência e montar uma câmera digital ou câmera de vídeo digital no microscópio para capturar imagens ou vídeos, respectivamente(Figura 3).
    Nota: A distância de trabalho (WD) do microscópio é superior a 0,2 mm dependendo da especificação da lente objetiva (ver Figura 3B, C). A especificação do sistema de microscópio de fluorescência usada neste trabalho é mostrada na Tabela de materiais. No entanto, a especificação não está limitada ao nosso exemplo, porque isso depende da finalidade de observação ou / e usuários.
  2. Selecione qualquer tensão fluorescente de c. elegans e manter, conforme descrito na seção 1.
    Nota: Se é necessário observar a contração dos músculos do corpo-parede (veja resultados representativos), use o jovem adulto HBR411c. elegans, em que um gene repórter é usado para expressar o indicador de cálcio GCaMP3.35 em todas as células de músculo do corpo-parede. É importante o uso de adultos jovens (≤ 3 dias após a eclosão) que são mais finos do que a largura dos canais microfluídicos (50 ou 60 µm) da folha do verme. O pequeno grau de afastamento significa que os animais podem dobrar ligeiramente, tornando-se possível observar a contração muscular e extensão durante o rastreamento, utilizando um indicador de iões cálcio.
  3. Realize o cerco dos animais de acordo com o procedimento de imobilização na seção 4.
  4. Observar manchas fluorescentes de animais (por exemplo, verde fluorescente cepas proteína-rotulado) usando um microscópio de fluorescência e capturar imagens usando uma câmera digital montada no microscópio.
    Nota: Siga os métodos anteriormente estabelecidos14,15,16, desde os métodos de observação do microscópio (incluindo a observação da fluorescência) e a especificação do sistema de microscópio depende o objetivo da observação.
  5. Propagação de ondas de íons cálcio de imagem usando a aquisição observar atividades dinâmicas, como a contração dos músculos da parede do corpo e extensão na HBR4 worms (vídeo 1).

7. aplicação de folhas de worm para irradiação microbeam

Nota: A collimating microbeam irradiação sistema5 pode usar várias partículas de iões pesados aceleradas do azimuthally variados ciclotron campo instalado nos aceleradores de íon Takasaki para facilidade de aplicação de radiação avançada (TIARA) de QST-Takasaki(Figura 4). Há um estágio automático para irradiação sob a saída do feixe (Figura 4B). O procedimento para irradiação de iões pesados microbeam de c. elegans usando este sistema é o seguinte.

  1. Localize a folha de worm juntando vários animais em uma moldura de alumínio feitos sob medida para a instalação de microbeam-irradiação e configurá-lo no palco automático para irradiação (Figura 4C).
  2. Aumentar a amostra de irradiação (ou seja, fechados em uma folha de worm em um quadro de animais), para imediatamente sob saída (~ 2 mm), o feixe baseia a imagem do monitor de um microscópio localizado debaixo do palco automático (Figura 4-D).
  3. Após o posicionamento vertical, localize cada animal ao alvo com a irradiação de microbeam usando o software feito sob medido para alvo irradiação de animais e culturas de células. Para localizar cada animal colocado entre o canal microfluídicos, consulte a folha de dedicado descrita no passo 4.7-4.8 (ver arquivo complementar 1) e confirmar o número do canal perto das bordas esquerdas e direita dos canais.
  4. Controlar o estágio automático no X e Y direções para posicionar os animais apenas sob o feixe de saída usando um sistema de controle remoto e um laser mouse operado com o software de irradiação.
  5. Mais ou menos melodia a área de irradiação por assistir a projeção do microscópio localizado debaixo do palco automático da amostra e movendo o cursor para a posição de irradiação do animal a ser alvo.
  6. Após posicionamento áspero, sair e fechar a sala de irradiação e passar à sala de controle adjacente para evitar irradiar os operadores.
  7. Conjunto o número desejado de partículas de íon para um procedimento de irradiação, correspondente a irradiação de uma região específica do animal, usando o console ligado a um sistema de íon-contador.
    Nota: Este consiste em um cintilador plástico e um multiplicador de fotoelétron no sistema de irradiação de collimating microbeam.
  8. Da sala de controle de irradiação, ajuste a posição dos animais com base na imagem de microscópio localizado debaixo do palco automático, que é a mesma imagem projetada no monitor na sala de irradiação (Figura 4E) monitor.
  9. Alvo a irradiação microbeam clicando no botão de irradiação do software para irradiação.
    Nota: No exemplo mostrado na Figura 4F, nós alvo da faringe na região da cabeça e irradiar com o número apropriado de íons de carbono microbeam. Porque o número de partículas de íon, passando através da amostra é contado usando um sistema de íon-contador vinculado para o console e o software de irradiação, a irradiação é interrompida após a entrega do número desejado de partículas de iões.
  10. Localize cada animal registrado na folha dedicada e realizar irradiação direcionada para cada animal. Repita as etapas 7.8 e 7.9 até que todos os animais têm sido irradiados.
  11. Imediatamente após a irradiação, entrar no quarto de irradiação e abaixar o estágio automático de irradiação. Retire a amostra no quadro sob medida, localizado no palco automático.
  12. Recolha os animais conforme descrito nas etapas 5.1-5.3.
  13. Efectuar análises comportamentais e/ou moleculares, conforme necessário para avaliar os efeitos do tratamento por irradiação alvo, dependendo da finalidade do estudo.
    Nota: O ensaio de locomoção descrito na etapa 3.6 é um método eficaz para avaliar os efeitos da irradiação na motilidade4,9.

8. tratamento de folhas de worm para uso repetido

Nota: Folhas de minhoca podem ser usada repetidamente pelo menos 10 vezes9 sem efeitos adversos sobre os animais se limpos e esterilizados corretamente após o uso da seguinte maneira.

  1. Limpeza
    1. Coloque a folha de worm usado sobre uma placa de Petri de 6cm e soltar cerca de 100 µ l de água ultrapura esterilizada sobre a folha inteira.
    2. Remo com a água na superfície da folha, usando luvas dedos para lavar a sujeira como poeira, comida bacteriana e ovos estabelecidas nos canais.
    3. Limpe a umidade fora da folha de worm completamente usando lenços descartáveis.
  2. Esterilização
    1. Injetar cerca de 5 mL de etanol a 70% da placa de Petri contendo a folha de verme e remar a superfície da folha usando os dedos com a luva de lavar a sujeira.
  3. De secagem
    1. Retire os chips de Petri preenchida com etanol a 70% e deixe para secar naturalmente.
  4. Armazenamento
    1. Após a secagem, coloque a folha de worm em uma placa de Petri estéril e cobri-lo. Folhas também podem ser armazenadas em uma placa de Petri estéril preenchido com etanol a 70%.
      Nota: É preferível dispor dos filmes tampa após o uso, mas se eles são ser reutilizado, limpá-los, como fez para a folha do verme. No entanto, se dobras desenvolvem no filme da tampa após o uso já não irá aderir ao chip, resultando na desidratação dos animais, e, portanto, deve ser substituído.

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Representative Results

Ativo c. elegans indivíduos poderiam ser imobilizados com êxito usando um PDMS ultra-fino, pó molhável, microplaqueta microfluidic (folha do verme). Nós investigamos a adequação de filmes de capa diferente para selar a folha do verme, conforme descrito na seção 3 de protocolo. Para avaliar os efeitos da selagem dos filmes tampa, determinamos a motilidade dos animais 3 h após a imobilização em-microplaqueta usando a tampa de vidro (espessura: 130-170 µm), películas PET (espessura: 125 µm) e o filme PS (espessura: ~ 130 µm), respectivamente. Como mostrado na Figura 5, não houve nenhuma diferença significativa na motilidade (curvas do corpo) entre animais controle permitido mover-se livremente para 3h e animais colocados na folha de verme com filme de PS. Em contraste, a motilidade foi significativamente reduzida em animais colocados sob um tampa de vidro. Alguns animais parecem ter secado, sugerindo que o vidro de tampa repelida da gota, impedindo um selo estreita e permitindo que os animais se parcialmente seco para fora, resultando em redução da motilidade. A motilidade dos animais fechados usando um filme de PET foi também significativamente diminuída; embora sem secagem foi observada, motilidade dos animais tende a diminuir uniformemente, sugerindo que a taxa de transmissão de oxigênio baixa (~ 30 mL / [24 h·m²· MPa]), que é cerca de 100 vezes inferiores que, do PS, causou os animais a sufocar. Estes resultados sugerem que cobrem PS filmes devem ser usados para delimitar os animais na folha de verme.

Também aplicamos a técnica de folha do verme para observações de imagem e para realizar irradiação microbeam específicas da região. Imobilização em-microplaqueta usando uma folha de verme com retenção de água e não autofluorescência foi adequada para observação microscópica sob condições ao vivo. Por exemplo, nós aplicamos a técnica para a estirpe HBR411 de c. elegans, em que um gene repórter expresso o indicador de cálcio GCaMP3.35 em todas as células de músculo do corpo-parede. Observamos que as atividades de todas as células de músculo de corpo-parede em animais jovens e adultos em ≤ 3 dias pós-incubação em folhas de verme com 50 canais microfluídicos µm-largo, que permitiu que os animais espaço para dobrar ligeiramente. A intensidade do sinal de GCaMP3.35 na estirpe HBR4 corresponde a contração das células de músculo do corpo-parede. A Ca2 + propagação de onda correspondente à atividade muscular foi claramente observada (Video 1). Além disso, confirmamos que a folha do verme não tinha nenhum autofluorescência conforme mostrado na última etapa (última ~ 10 s) de vídeo 1. Desta forma, a falta de necessidade de anestesia permitiu as atividades fisiológicas das células musculares para ser observadas as condições de viver.

Além disso, aplicamos a folha worm para regiões específicas microbeam irradiação de indivíduos de c. elegans . Os múltiplos canais microfluídicos reta na folha worm permitiu vários animais ser imobilizado simultaneamente, sem a necessidade de anestesia, permitindo assim a irradiação sequencial de ≥ 20 animais (o suficiente para um ensaio de grupo) em um curto período de tempo (30 min para 20 indivíduos).

Figure 1
Figura 1 : Esquemático de uma folha de worm. (A) visão geral de uma folha de minhoca com uma moeda de centavo americano 1 para escala. A folha do verme foi 300 µm de espessura, 15 mm largura e 15 mm de comprimento. (B) a superfície da folha worm continha 25 canais microfluídicos reta (profundidade = 70 µm; Largura = 60 µm; comprimento = 8 mm). (C) diagrama esquemático das amostras consiste no filme de cobertura inferior, a folha do verme e o filme de cobertura. (D) a folha do worm é uma folha ultra-fino, macia feita de PDMS e pode ser dobrada por beliscar com pinça plana. (E) a exemplo de vários animais fechados em múltiplos canais. (F) expansão de um canal de microfluidic empurrando com um selecionador de platina. A elasticidade do canal permite que os animais ser envolto suavemente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Corpo forma de c. elegans. (A) selvagem-tipo (N2) c. elegans , um prato de NGM. (B) um mutante unc-119 com forma anormal em um prato NGM. (C) o unc-119 mutantes colocados entre os canais microfluídicos da folha do verme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Esquemas de observação do microscópio de vivem c. elegans indivíduos colocados na folha de worm. (A) diagrama esquemático do sistema de duas oculares para observações de imagem. (B) esquema de observação do microscópio do worm folha delimitador ao vivo c. elegans indivíduos. (C) vista secional do worm folha delimitador ao vivo c. elegans indivíduos colocados na fase de microscópio. W.D. indica a distância de trabalho de microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Esquema de colimar microbeam sistema no QST-Takasaki e procedimento de irradiação microbeam direcionados para viver indivíduos de c. elegans . (A) visão geral do collimating microbeam irradiação sistema5, que pode usar várias partículas de iões pesados aceleradas do ciclotron azimuthally variados de campo instalado na TIARA de QST-Takasaki. (B) visão geral da saída do feixe e o estágio automático para irradiação. (C) configuração no palco automático do sistema de microbeam collimating da amostra. (D) o posicionamento Vertical da amostra irradiação conduzida na sala de irradiação. (E) ajuste fino da área de irradiação conduzida na sala de controle de irradiação. (F) alvejados microbeam irradiação ao vivo c. elegans. A faringe foi clicado-na como a posição do alvo e irradiados pressionando o botão de irradiação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Motilidade do c. elegans após imobilização em-microplaqueta usando a tampa de vidro, película de poliéster (PET) e filme de poliestireno (PS). Barras indicam curvas de corpo médio de animais 3 h depois em-microplaqueta de imobilização ou de livre circulação para 3h em um prato NGM (controle). Dez animais foram examinados e curvas do corpo foram em média entre cada grupo. Finalmente, dados de cinco experimentos independentes foram em média para cada grupo. Barras de erro representam o erro padrão da média de cinco experimentos independentes. Todos os dados foram analisados utilizando ANOVA One-Way a 0,05 (*) ou 0,01 (*) nível de significância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Video 1
Video 1: exemplos de observações de imagens das atividades musculares em C. elegans fechado em uma folha de worm. Propagação de ondas de iões cálcio correspondente a contração das células musculares do corpo-parede durante o rastreamento em indivíduos HBR4 c. elegans , fechados em uma folha do verme. O último ~ 10 s foram observadas sob iluminação de campo claro. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Supplementary Figure 1
Complementar arquivo 1: exemplo de dedicado folha de papel (microbeam versão de irradiação). Desenhe uma seta para indicar a posição de cada animal no canal. A direção da seta corresponde à cabeça. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Imobilização no chip de c. elegans sob condições ao vivo usando um pó molhável PDMS microfluidic chip permite a irradiação de eficiente microbeam alvo de vários animais. A facilidade de manipulação e recursos para evitar a secagem fazer este sistema apropriado para aplicações não só na irradiação microbeam, mas também em vários ensaios comportamentais. Estas folhas de verme já tem sido comercializadas e podem ser facilmente obtidas. Fichas de microfluidic convencionais, tais como fichas olfativas, são associadas a problemas incluindo entupimento dos animais e de ovos nos canais microfluídicos fechado dificultando a recolher os animais, e assim tais fichas tendem a ser descartáveis, assim aumentando o custo. Em contraste, os canais microfluídicos na planilha atual de worm são abertos, tornando mais fácil para recolher os animais. Estas folhas de verme podem consequentemente ser usadas repetidamente, tornando-os mais econômicos.

Recentes inovações tecnológicas em PDMS microfluidic fichas têm demonstrado uma tendência crescente em complexidade estrutural e multifuncionalidade16,18,19,20,21, 22,23. No entanto, acreditamos que é importante tornar o sistema simples e fácil de usar. Com efeito, em contraste com o uso de convencional microfluidic grandes fichas19,20,21,22,23 que exigem a fixação de uma bomba de vácuo, o tamanho pequeno e design simples das folhas do worm permitem que os procedimentos a efectuar facilmente dentro de um espaço limitado.

O desempenho de retenção de água das folhas de worm permite a longo prazo observações a efectuar. Além disso, a espessura da folha permite que as partículas de iões passar através das amostras, permitindo assim a irradiação de alvo a ser aplicado para viver c. elegans indivíduos com um número preciso de partículas de iões. Estas vantagens das folhas de verme tem ampliadas as possibilidades de experimentos biológicos.

Acreditamos que é importante para biólogos desenvolver novos equipamentos e métodos para melhorar a eficiência de suas experiências e análises. O worm lençóis e software de irradiação microbeam foram desenvolvidas com este objectivo em mente e têm o potencial de contribuir para o sucesso de futuras experiências inovadoras, para além de seus objetivos originais.

O melhor de nosso conhecimento, nosso grupo é a primeira a desenvolver essa tecnologia em todo o mundo. No entanto, sua utilização padronizada no futuro irá facilitar a aplicação da irradiação microbeam direcionados aos animais em condições de viver, ajudando assim a identificar as funções dos tecidos/células específicas em processos internos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecer Dr. Atsushi Higashitani Conselho em relação ao tratamento de c. elegans e DRS Yuya Hattori, Yuichiro Yokota e Yasuhiko Kobayashi para discussões valiosas. Os autores agradecer o centro de genética Caenorhabditis pelo fornecimento de cepas de c. elegans e e. coli. Agradecemos a tripulação do ciclotron de TIARA no QST-Takasaki por sua gentil assistência com os experimentos de irradiação. Agradecemos o Dr. Susan Furness para edição de um projecto deste manuscrito. Este estudo foi suportado em parte pela KAKENHI (Grant números JP15K11921 e JP18K18839) de JSPS para M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild-type strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA N2 Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA CB4845 C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape 
C. elegans transgenic strain HBR4 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA HBR4 The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA OP50 E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60) Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM17-0001 Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper 
Worm Sheet 60 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001 Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. 
Worm Sheet 50 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0002 Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. 
MICRO COVER GLASS MATSUNAMI GLASS IND. LTD. C030401 Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001/ BCM18-0002 Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan Lumirror T60 (t 125 µm) PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-060 Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-035 Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q Merck, France Ultrapure water
Kimwipe S-200 Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan 62020 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick Genesee Scientific Corporation, CA, USA) 59-AWP Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX16 Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16 OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-ILLB This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO1×PF NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO2XPFC NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan U-LH100HG The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-FYFPHQ Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013 Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA EXCEL Software used for statistical analyses

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References

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Imobilização de indivíduos ao vivo <em>Caenorhabditis elegans</em> , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água
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Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, T. Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention. J. Vis. Exp. (145), e59008, doi:10.3791/59008 (2019).

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