Un approccio è descritto per la rilevazione in tempo reale della risposta immunitaria innata di ferite cutanee e Staphylococcus aureus infezione dei topi. Di confronto LysM-EGFP topi (che possiedono i neutrofili fluorescenti) con un LysM-EGFP incrociate topo immunodeficiente, abbiamo anticipato la nostra comprensione dell’infezione e lo sviluppo di approcci per combattere l’infezione.
Staphylococcus aureus (S. aureus) infezioni, compresi meticillina resistente alle macchie, sono un enorme onere per il sistema sanitario. Con tassi di incidenza di infezione da Staphylococcus aureus arrampicata annualmente, c’è una domanda per ulteriori ricerche nelle sua patogenicità. Modelli animali di malattia infettiva avanzano la nostra comprensione della risposta ospite-patogeno e portano allo sviluppo di terapie efficaci. I neutrofili svolgono un ruolo primario nella risposta immunitaria innata che controlla le infezioni da S. aureus formando un ascesso per muro fuori l’infezione e facilitare lo spazio batterico; il numero dei neutrofili che infiltrarsi un’infezione della pelle di S. aureus spesso correla con risultato di malattia. Topi LysM-EGFP, che possiedono la proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) inserita nella regione del promotore di lisozima M (LysM) (espressa principalmente dai neutrofili), quando utilizzato in combinazione con imaging in vivo animale intero fluorescenza (FLI) forniscono un mezzi di quantificazione del neutrofilo emigrazione non invadente e longitudinalmente in pelle ferita. Quando combinato con un bioluminescenti Staphylococcus aureus strain e sequenziale in vivo imaging intero animale bioluminescente (BLI), è possibile monitorare longitudinalmente sia le dinamiche di reclutamento dei neutrofili e la carica batterica in vivo presso il sito di infezione nei topi anestetizzati dall’inizio dell’infezione alla risoluzione o alla morte. I topi sono più resistenti a una serie di fattori di virulenza prodotta da S. aureus che facilitano efficace colonizzazione e l’infezione in esseri umani. Topi immunodeficienti forniscono un modello animale più sensibile per esaminare persistente S. aureus infezioni e la possibilità di terapeutica per amplificare la risposta immune innata. Nel presente documento, ci caratterizzano le risposte in topi LysM-EGFP che sono stati allevati per topi MyD88-carenti (LysM-EGFP × MyD88– / – topi) insieme con selvaggio-tipo LysM-EGFP topi per indagare lo Staphylococcus aureus pelle infezione della ferita. Rilevazione simultanea multispettrali abilitato studio delle dinamiche di reclutamento dei neutrofili utilizzando in vivo FLI, carica batterica utilizzando BLI in vivo e cicatrizzazione longitudinalmente e non invadente nel corso del tempo.
Staphylococcus aureus (S. aureus) rappresenta la maggior parte della pelle e infezioni dei tessuti molli (SSTI) in Stati Uniti d’America1. L’incidenza di meticillino-resistenti Staphylococcus aureus (MRSA) infezioni è aumentato costantemente sopra il passato due decenni2, motivare lo studio dei meccanismi di persistenza e la scoperta di nuove strategie di trattamento. Lo standard di cura per le infezioni da MRSA è la terapia antibiotica sistemica, ma MRSA è diventato sempre più resistente agli antibiotici nel corso tempo3 e questi farmaci possono diminuire microbiome benefico dell’host, causando effetti negativi sulla salute, soprattutto in bambini4. Studi preclinici hanno esaminato le strategie alternative per il trattamento di infezioni di MRSA5, ma tradurre questi approcci alla clinica ha dimostrato difficile a causa di comparsa di fattori di virulenza che contrastare host le risposte immunitarie6. Per sezionare le dinamiche di ospite-patogeno tale unità S. aureus SSTI, uniamo non invadente e letture longitudinale del numero di neutrofili reclutati al letto della ferita con misure cinetiche dell’abbondanza batterica e la zona ferita.
I neutrofili sono il più abbondanti leucociti circolanti negli esseri umani e i primi soccorritori ad un’ infezione batterica7. I neutrofili sono una componente necessaria per una risposta efficace ospite contro le infezioni da Staphylococcus aureus dovuto i loro meccanismi battericidi, compresa la produzione delle specie reattive dell’ossigeno, proteasi, peptidi antimicrobici e le risposte funzionali tra cui la fagocitosi e trappola extracellulari del neutrofilo produzione8,9. I pazienti umani con difetti genetici in funzione dei neutrofili, come la malattia granulomatosa cronica e la sindrome di Chediak-Higashi, mostrano un aumento della suscettibilità alle infezioni di S. aureus . Inoltre, pazienti con genetiche (come la neutropenia congenita) e acquisite (quali neutropenia vista nei pazienti di chemioterapia) difetti nei numeri del neutrofilo sono anche altamente suscettibili di S. aureus infezione10. Data l’importanza dei neutrofili in compensazione le infezioni da S. aureus , rafforzandone la capacità immunitaria o tuning loro numeri all’interno di una lesione di S. aureus può rivelarsi una strategia efficace nel risolvere l’infezione.
Nell’ultimo decennio, topi transgenici con i giornalisti del neutrofilo di fluorescenza sono stati sviluppati per studiare il loro traffico di11,12. Combinando i topi reporter del neutrofilo con tecniche di imaging animale intero consente analisi spazio-temporale dei neutrofili in tessuti e organi. Quando combinato con bioluminescenti ceppi di Staphylococcus aureus, è possibile tracciare l’accumulo di neutrofili in risposta all’abbondanza di S. aureus e persistenza nel contesto della virulenza batterica fattori che direttamente e indirettamente perturbare i numeri dei neutrofili nel tessuto colpito13,14,15,16.
I topi sono meno suscettibili di meccanismi di evasione di virulenza e immunitario di S. aureus che gli esseri umani. Come tale, topi wild-type non possono essere un modello animale ideale per studiare l’efficacia di un dato terapeutico per il trattamento cronico S. aureus infezione. Topi MyD88-carenti (cioè, MyD88– / – topi), un ceppo di topo immunocompromessi che manca di recettore funzionale interleuchina-1 (IL-1R) e del recettore Toll-like (TLR) segnalazione, Visualizza una maggiore suscettibilità all’infezione di S. aureus rispetto al topi wild-type17 e un danno del neutrofilo traffico a un sito di S. aureus infezione nella pelle18. Sviluppo di un ceppo di topo che possiede un reporter fluorescente del neutrofilo nei topi di MyD88– / – ha fornito un modello alternativo per indagare l’efficacia di terapie per trattare l’infezione di S. aureus rispetto alla corrente del neutrofilo topi reporter.
In questo protocollo, ci caratterizzano lo Staphylococcus aureus infezione nei LysM-EGFP × MyD88– / – topi immunocompromessi e confrontare il decorso e la risoluzione dell’infezione con i topi LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88– / – topi sviluppano un’infezione cronica che non si risolve, e 75% soccombere all’infezione dopo 8 giorni. Un difetto significativo in iniziale reclutamento dei neutrofili si verifica oltre 72 h della fase infiammatoria della infezione, e meno del 50% neutrofili reclutano durante la seconda fase dell’infezione. L’aumentata suscettibilità del × LysM-EGFP MyD88 topi– / – rende questo particolare ceppo un rigoroso modello preclinico per valutare l’efficacia di nuove tecniche terapeutiche targeting per S. aureus infezione rispetto agli attuali modelli che utilizzare topi wild-type, soprattutto tecniche con l’obiettivo di aumentare la risposta immunitaria innata contro l’infezione.
Modelli di infezione di S. aureus che utilizzano bioluminescenti S. aureus infezione in un mouse fluorescente del neutrofilo reporter in combinazione con tecniche avanzate di animale intero in vivo imaging ottico hanno avanzato la nostra conoscenza dell’innata risposta immunitaria all’infezione. Utilizzando il mouse LysM-EGFP gli studi precedenti hanno indicato che fino a 1 x 107 neutrofili recluta per una ferita infetta di S. aureus sopra le prime 24 ore dell’infezione<sup class="xr…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da nazionale istituti di salute sovvenzioni R01 AI129302 (al s.i.s.) e il programma di formazione in farmacologia: da banco al capezzale presso UC Davis (NIH T32 GM099608 a Silvana). Il molecolare e Imaging Genomic (CMGI) presso la University of California Davis fornito eccellente supporto tecnologico.
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |